Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

O objetivo geral deste método de preparação de amostras é pré-concentrar poluentes orgânicos pequenos a partir de amostras de água, de maneira amigável ao usuário, econômica e automatizada. Este método pode substituir os processos padrão de EPE ao estudar a contaminação de amostras de água utilizando métodos de imunodetecção, como ensaios imunoenzimáticos em placas de microtitulação ou biossensores. As principais vantagens desta técnica são que o procedimento de EPE é automatizado, enquanto o tamanho físico e o custo dos instrumentos são baixos em comparação com as abordagens tradicionais.

Além disso, o desempenho do processo de enriquecimento atende aos requisitos de análise de imunoensaios tanto em termos de baixo teor de solvente quanto de eficiência de pré-concentração. Primeiro, filtre uma amostra de água de 100 milímetros com um filtro de tamanho de poro de zero vírgula dois micrômetros. Coloque a amostra filtrada em um frasco de vidro com rosca GL 45.

Prepare 300 microlitros de eluente diluindo metanol em água desionizada, até 50 por cento do volume em um tubo fechado. Em seguida, prepare uma suspensão de 20 miligramas por mililitro de partículas de silício octadecil com sorvente adicionando 1.600 microlitros de metanol seguidos por 400 microlitros de água desionizada a 40 miligramas de sorvente de fase reversa em um frasco de vidro. Feche bem a tampa e agite com um misturador de vórtice.

Coloque uma membrana de náilon com tamanho de poro de 11 micrômetros sobre uma camada dupla de tecido anti-pó. Corte duas pequenas partes na membrana com um furador de três milímetros de diâmetro. Em seguida, segure uma das pequenas membranas com pinça de filtro de ponta plana e coloque-a em um dos lados da coluna.

A seguir, parafuse o conector de fundo plano com o tubo e aperte bem. Depois, desenhe uma seta no corpo da coluna, apontando para a extremidade onde a membrana foi colocada. Neste momento, fixe a coluna no suporte com a seta voltada para baixo.

Acople uma seringa descartável vazia de 10 mililitros à extremidade do tubo da coluna utilizando os conectores de trava inferiores. Agite a suspensão do sorvente com o misturador de vórtice e pipete rapidamente 100 microlitros no centro da coluna. Durante a injeção, aspire suavemente a solução pipetada através da membrana utilizando a seringa com a outra mão.

A preparação da coluna de EPE é muito importante. Você deve garantir que aspire adequadamente a solução através da membrana utilizando a seringa enquanto injeta a suspensão de partículas na coluna. Caso contrário, as partículas não serão compactadas de forma densa.

Repita o processo anterior mais duas vezes, agitando a suspensão estoque entre todas as etapas de pipetagem, para garantir uma suspensão homogênea das partículas na solução. Após toda a suspensão ter sido carregada e seca por aspiração com uma seringa, mantenha a seringa na posição e coloque a segunda membrana de náilon em cima, utilizando a pinça com a outra mão. Em seguida, parafuse o segundo conector com um tubo e descarte a seringa.

Neste ponto, aperte a coluna no dispositivo de EPE utilizando os conectores de travamento inferiores. Conecte o frasco contendo a amostra ao dispositivo rosqueando a tampa de segurança GL 45 fornecida. Adicione 200 microlitros de eluente no reservatório de eluente.

Em seguida, carregue 800 microlitros de água desionizada no reservatório de diluição. Verifique se o regulador de pressão está na posição fechada girando-o no sentido anti-horário até que não seja mais possível movê-lo. Após ligar o protótipo, insira os valores 580 para pset e 30 para delta pset.

Para ajustar o regulador de pressão, ligue a bomba. Em seguida, gire manualmente o regulador de pressão até que o valor lido para preg seja inferior, mas próximo de 320 milibares. Após parar a bomba, inicie o procedimento de SPE pressionando iniciar no canto do modo automatizado.

Após a conclusão do procedimento de SPE, feche o frasco pequeno da amostra e armazene entre quatro e cinco graus Celsius no escuro, até a análise por ELISA. Para limpar o sistema, prepare uma solução de 10 mililitros de 70 por cento de metanol em volume em um frasco de vidro com rosca GL 45. Desconecte a coluna de SPE e tampe a tubulação com conectores.

No modo automatizado, selecione o arquivo de limpeza e inicie-o com as mesmas configurações de pressão previamente utilizadas para pset, delta pset e preg. A reprodutibilidade do empacotamento do sorvente foi avaliada por meio da secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro. A reprodutibilidade do tempo de injeção foi testada para amostras de 100 mililitros.

As concentrações das amostras inicialmente adicionadas e pré-concentradas foram determinadas utilizando um kit comercial de ELISA para 17 beta-estradiol. É evidente pelas curvas de calibração que a proporção de metanol da amostra enriquecida não afeta a sensibilidade do ensaio imunológico. Foram calculados rendimentos de 128 ± 22% e 107 ± 6% para água desionizada e água do mar artificial, respectivamente.

Uma vez dominada, a preparação de uma coluna de extração em fase sólida pode ser realizada em menos de cinco minutos, se for feita corretamente. Todo o procedimento de SPE pode ser concluído em menos de uma hora. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de ciências ambientais explorarem o desenvolvimento de métodos de imunodetecção para monitoramento de poluentes orgânicos pequenos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras de água utilizando nosso instrumento automatizado e economicamente eficiente para a análise de poluentes por imunoensaios. Não se esqueça de que trabalhar com poluentes orgânicos e solventes pode ser perigoso, e precauções, como o uso de luvas apropriadas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.