Name: Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a extrair poluentes orgânicos de amostras de água usando extração em fase sólida automatizada. Este método reduz custos e tempo de preparação para análises imunológicas ambientais.

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Este trabalho foi financiado pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia FP7/2007-2013 sob o acordo de subvenção nº 265721. Os autores agradecem ao RIKILT Institute for Food Safety (NL) por seu apoio neste projeto.

Nota: O protocolo seguinte descreve a SPE realizada em amostra de 100 ml de água com sorvente C18 e eluição com 50% v / v de metanol. A amostra é diluída enriquecido para chegar a 10% v / v de metanol, antes da análise com um ensaio de imunoabsorção enzimática kit (ELISA). 1. Preparar os reagentes <ol><li> Prepare as amostras de água <ol><li> Antes de qualquer outra etapa, filtrar cada amostra de 100 ml de água com filtros de tamanho de poro de 0,2 um. </li><li> Pico a amostra com a concentração desejada por diluição volume apropriado da solução de referência para um volume de água. Por exemplo, preparar 100 mL de amostra de água com 100 ng / L de E2 através da diluição de 3,3 ml de solução de referência E2 a uma concentração de 300 ug / L. Diluir esta solução dez vezes para obter uma amostra enriquecida com 10 ng / L E2. Dilui-se esta última mais de dez vezes para se obter uma amostra de 100 ml com 1 ng / L E2. </li><li> Colocar a amostra filtrada (não modificada ou perfurantes) em um frasco de vidro com GLinha L45. Utilizar a amostra no mesmo dia. Pegue uma pequena fração de ser analisadas com o ELISA para estimar concentração inicial. </li></ol></li><li> Preparar 300 ul de eluente por diluição em metanol (di) água desionizada a 50% v / v em um tubo apertado. </li></ol> 2. Preparação da coluna de SPE <ol><li> Preparar uma solução 20 mg / ml, suspensão de partículas de octadecil-sílica absorventes, adicionando primeiros 1.600 ul de metanol e em seguida 400 ul de di-água a 40 mg de adsorvente de fase inversa. Feche bem a tampa e agitar com um vortex. </li><li> Instalação da membrana inferior na coluna <ol><li> Selecione uma membrana de nylon com tamanho de poros de 11 mm e coloque-a sobre uma dupla camada de tecido anti-poeira. Com um furador de diâmetro de 3 mm, cortar duas peças pequenas na membrana. </li><li> Pegar numa das pequenas membranas com uma extremidade plana fórceps de filtro e colocá-lo sobre um lado da coluna. </li><li> Parafuso do conector de fundo plano com o tubo e aperte. A membrana é now no lugar e o adsorvente pode ser adicionado de forma segura. Desenhar uma seta no corpo da coluna de apontamento para o fim em que a membrana foi colocada. </li></ol></li><li> Preparação da coluna de sorvente embalado <ol><li> Fixe a coluna no suporte com a seta apontada para o fundo. A coluna deve ser definido como na vertical quanto possível. </li><li> Anexar um vazio 10 ml seringa descartável para a extremidade do tubo da coluna, utilizando os conectores Luer-Lock. </li><li> Prepare uma micro-pipeta com uma ponta de 20-200 ï¿½, ajustar o volume para 100 l. Este formato de ponta de pipeta é adaptada ao tamanho da coluna de adsorvente a ser preparado. O procedimento seria mais difícil com pontas de pipeta maiores, como os usados ​​com pipetas de 1 ml. </li><li> Agita-se a suspensão sorvente com um vortex, e pipeta-se rapidamente 100 pi no centro sobre a coluna. Embora a injecção, aspirar suavemente pipetado toda a solução através da membrana usando a seringa com a outra mão. Neste sta idade, a solução de encher a seringa tem de estar livre de partículas, e um leito de partículas pode, eventualmente, ser observada na coluna. </li><li> Repetir este processo mais 2 vezes por agitação da suspensão de pasta entre todos os passos de pipetagem para garantir a suspensão homogénea das partículas em solução. A coluna resultante contém 6 mg de sorvente. </li><li> Quando os 300 ul de suspensão ter sido carregado e secou-se por aspiração com a seringa, manter a seringa na posição e colocar a segunda membrana de nylon sobre a parte superior, utilizando a pinça com a outra mão. </li><li> Aperte o segundo conector com tubo e descarte da seringa. A coluna de SPE está pronto para uso. </li></ol></li></ol> 3. Preparação do Sistema <ol><li> Aperte a coluna SPE no dispositivo usando os conectores Luer-Lock. A seta aponta para deve ser na mesma direcção que a mostrada no dispositivo. </li><li> Ligue o frasco contendo a amostra para o dispositivo por enroscamento afornecida tampa de segurança GL45 nele. </li><li> De carga de 200 mL de eluente no reservatório &quot;Eluente &#39;. </li><li> Carga de 800 ul de di-água no reservatório &quot;diluição&quot;. </li><li> Coloque uma garrafa na saída de resíduos para recolher a água processada durante a etapa de extração. O formato não é importante, mas o volume tem de ser suficientemente grande no que diz respeito ao volume da amostra. </li><li> Coloque um pequeno frasco na saída do sensor com a capacidade mínima volume de 1,5 ml. Um volume máximo de 1 ml será muito pequeno como bolhas se formarão neste saída ao coletar eluente enriquecido e tampão de diluição. </li><li> Verifique se o regulador de pressão está na posição fechada, rodando-a manualmente, inverter-horário até novo movimento não é possível. </li></ol> 4. SPE com o Prototype <ol><li> Ligue o protótipo pressionando o botão na parte de trás. </li><li> Preparando a interface do usuário e selecionar o programa <ol><li> Abra a interface do usuário. Selecionara porta de comunicação do computador ao qual o dispositivo está conectado a partir da lista e clique no botão &quot;Next&quot;. </li><li> Digite os valores para 580 pset e 30 para dpset. A bomba irá ajustar para manter a pressão no sistema pressurizado e reservatórios em 580 ± 30 mbar quando em execução. </li><li> Selecione o modo automatizado. </li><li> No canto modo automatizado, carregar o arquivo de programa no &quot;caminho do arquivo de configuração &#39;caixa. </li></ol></li><li> Ajustar o regulador de pressão <ol><li> Comece a bomba. </li><li> Gire manualmente o regulador de pressão até que o valor lido para preg é inferior mas próximo de 320 mbar. </li><li> Parar a bomba. </li></ol></li><li> Iniciar o procedimento de SPE <ol><li> Prima &#39;start&#39; no canto automatizado modo. A bomba irá ligar e as etapas de extração, eluição e diluição seguirá automaticamente o outro. Todo o procedimento para uma amostra de 100 mL é realizada em 50 min. </li><li>Verifique se o valor de preg. Ele deve estar na gama de 320 - 350 mbar durante a fase de extracção para assegurar uma taxa de fluxo óptima. </li><li> Feche o pequeno frasco e armazenar a 4-5 ° C no escuro até à análise. Realizar a análise em 30 horas a seguir para evitar a degradação da substância a analisar. </li><li> Elimine a água processada. </li></ol></li><li> Limpeza do sistema Nota: Após cada procedimento de extração do sistema precisa ser limpo para evitar a contaminação cruzada. <ol><li> Prepara-se uma solução de 10 ml de metanol a 70% v / v em um frasco de vidro de 45 GL. </li><li> Desligue a coluna SPE e ligue o tubo com conectores. </li><li> No modo automático, selecione o arquivo &#39;limpeza&#39; e iniciá-lo com as configurações mesma pressão. </li></ol></li></ol> 5. Detecção de Concentração de Estradiol com ELISA <ol><li> Preparar as amostras de calibração com concentrações, tal como indicado no protocolo fornecido com o kit de ELISA que é utilizado. Prepare uma calibração definido com a mesma matriz, como a amostra, e um conjunto de calibragem com metanol a 10% v / v. </li><li> Retirar a quantidade necessária de amostra nos poços na placa, de acordo com as instruções do fabricante. Use amostras de calibração, as amostras de água não modificados e perfurantes que foram filtrados, mas não processados ​​com a SPE, e amostras enriquecidas em metanol a 10% v / v. Use 3 poços por amostra para reduzir o erro associado com o ensaio. </li><li> Seguir as indicações do protocolo que é fornecido com o kit para a adição de reagentes, tempo de incubação, lavagem e posterior reacção com a enzima. </li><li> Ler o sinal óptico em cada poço de acordo com as instruções do fabricante do kit com um instrumento leitor de placas e recolher os dados. </li><li> Utilizar o software do instrumento leitor de placas para se ajustar às curvas de calibração e determinar a concentração de E2 na amostra inicial com mesma matriz, e nas amostras enriquecidas com metanol a 10% v / v. </li></ol>

<ol><li>Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+identification%2C+analysis+and+removal+of+endocrine+disrupting+compounds+%28EDCs%29+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Matter%22%5BJournal%5D)">The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water.</a> J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).</li>
<li>Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+solid-phase+extraction+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+determination+of+pharmaceuticals+and+hormones+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).</li>
<li>Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+analysis+of+female-steroid+hormones+in+environ-mental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples.</a> Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).</li>
<li>Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+on-line+solid+phase+extraction+coupled+to+high-performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometric+analysis+at+sub-ng%2FL+levels+of+selected+estrogens+in+surface+water+and+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater.</a> J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).</li>
<li>Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-residue+method+for+the+determination+of+over+400+priority+and+emerging+pollutants+in+water+and+wastewater+by+solid-phase+extraction+and+liquid+chromatography-time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).</li>
<li>Huang, C. H., Sedlak, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+estrogenic+hormones+in+municipal+waste+water+effluent+and+surface+water+using+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+gas+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).</li>
<li>Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+study+using+two+immunoassays+for+the+determination+of+estradiol+and+ethinylestradiol+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment.</a> Water Res. 40, 2287-2294 (2006).</li>
<li>Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+an+estradiol+enzyme-linked+immunosorbent+assay+kit%2C+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%2C+and+ultra-performance+liquid+chromatography-quadrupole+time+of+flight+mass+spectrometry+for+part-per-trillion+analysis+of+estrogens+in+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples.</a> J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).</li>
<li>Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+analysis+of+contraceptive+drug+levonorgestrel+in+waste+water+samples+by+a+newly+developed+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29+coupled+with+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction.</a> Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).</li>
<li>Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+status+report+on+field-portable+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A status report on field-portable immunoassay.</a> Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).</li>
<li>Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+water+for+pollutants+using+biological+techniques+under+European+Union+funding+during+the+last+10+years%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years.</a> Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).</li>
<li>Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+enzyme-linked+immunosorbent+assay+for+ethinylestradiol+using+a+long-chain+biotinylated+EE2+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative.</a> Steroids. 69, 245-253 (2004).</li>
<li>Heub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+portable+solid+phase+extraction+platform+for+immuno-detection+of+17%CE%B2-estradiol+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chrom.+A%22%5BJournal%5D)">Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water.</a> J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).</li>
<li>Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+compounds+and+other+merging+contaminants+in+the+environment%3A+a+new+survey+on+new+monitoring+strategies+and+occurrence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data.</a> Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).</li>
<li>Richardson, S. D., Ternes, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+analysis%3A+Emerging+contaminants+and+current+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Water analysis: Emerging contaminants and current issues.</a> Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Foi proposto um novo método para a preparação de amostras de água seguida por análise utilizando imunoensaio. O instrumento permite realizar extração em fase sólida de forma automatizada e fácil de usar. A filtração da amostra de água antes da sua injecção no sistema é crítico. Quaisquer partículas ainda presentes na solução seria, potencialmente, causar o entupimento da rede de fluidos e obstruir a coluna de SPE. Outro passo importante é a preparação da coluna de SPE. A quantidade de partíc...

A preparação da amostra é uma etapa importante em qualquer processo analítico. Em particular, a remoção dos efeitos de matriz, diminuição das interferências, e enriquecimento da substância a analisar são necessárias para obter resultados precisos e atingem baixos limites de detecção. Compostos de desregulação endócrina (EDC) são particularmente preocupantes devido à sua ação sobre os organismos vivos, mesmo quando presentes em níveis muito baixos no meio ambiente. O hormônio natural 17β-estradiol está presente na poluição da água UE Watch List e propenso a ser adicionado à lista de substâncias prioritárias regulamentados pela Directiva-Quadro da Água da UE. Extracção em fase sólida (SPE), é geralmente utilizado para a análise de pequenas poluentes na água, com tanto química 1-5 (cromatografia, espectrometria de massa) e métodos de detecção imunológicos 6-9. Este último ganhou interesse no campo da monitorização ambiental, como imunoensaios estão disponíveis em grande variedade de formatos, são específicas para a TArPegue analito, e atingir baixos limites de detecção. 6, 7, 10, 11 Vários ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA) estão comercialmente disponíveis e permitem analisar várias amostras ao mesmo tempo sobre uma placa multi-poços. O procedimento consiste em passos de reacção sucessivos que podem levar algumas horas. O produto final da reacção pode ser detectado opticamente para determinar a concentração da molécula alvo com base em uma curva de calibração. SPE procedimentos clássicos incluem sorvente pré-condicionado, extracção da amostra, a lavagem, a eluição, e concentração por evaporação do eluente. O solvente utilizado para a diluição deste extracto é escolhido dependendo do método de detecção. 12 Para os métodos imunológicos, a quantidade de solvente orgânico influências fortemente a sensibilidade do método. Para além da recuperação e os desempenhos de pré-concentração, o método também tem de ser simples e de custo eficiente. Automação do Procedure ajuda a reduzir erros humanos-relacionados. No nosso trabalho anterior 13 que introduzida a protótipo para SPE automatizado, e o nosso método foi aplicado para a análise da hormona natural 17β-estradiol nas amostras de água do mar. Com o presente vídeo, gostaríamos de destacar as vantagens técnicas do nosso método em comparação com off-line tradicional e on-line SPE, e em particular a sua compatibilidade com detecção por imuno-reacções. Nós descrevemos o protocolo aplicado a amostras de água para a detecção de 17β-estradiol. SPE é realizada com octadecil-silica (C18) de fase sorvente e a eluição é realizada com metanol diluído.

<table><tbody><tr><td>Membrana filtrante 0,2 &mu; m tamanho do poro</td><td>Merck Millipore</td><td>GNWP04700</td><td>Para filtração de amostras</td></tr><tr><td>Membrana de nylon 11 &mu; m tamanho de poro</td><td>Merck Millipore</td><td>NY1104700</td><td>Para coluna SPE</td></tr><tr><td>Perfurador de biópsia descartável 5 mm</td><td>Orçamento Médico</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&nbsp;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &mu; m diâmetro de partícula</td></tr><tr><td>Água do mar sintética</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17beta-estradiol padrão</td><td>Enzo Life Science</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17beta-estradiol Kit ELISA</td><td>Enzo Life Science</td><td>ADI-900-008</td><td>96 poços, faixa de 30 - 3.000 ng/L</td></tr></tbody></table>

um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de pequenas poluentes

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

Um novo método de extracção em fase sólida (SPE) de amostras de água do ambiente é proposto. O protótipo desenvolvido é amigável custo-eficiente e usuário, e permite realizar SPE rápido, automatizado e simples. A solução de pré-concentrado é compatível com a análise por imunoensaio, com um conteúdo de solvente orgânico de baixo. É descrito um método para a extracção e concentração da pré-hormona natural 17β-estradiol em 100 ml de amostras de água. SPE de fase reversa é efectuada com octadecil-sílica adsorvente e a eluição é feita com 200 ul de metanol a 50% v / v. Eluente é diluída por adição de di-água para baixar a quantidade de metanol. Depois de preparar manualmente a coluna SPE, o procedimento geral é realizada automaticamente dentro de 1 hora. No final do processo, a concentração de estradiol é medido usando um ensaio imuno-sorvente comercial ligado a enzima (ELISA). 100 vezes pré-concentração é conseguida e o teor de metanol em apenas 10% v / v. Recuperações de pleno direito da moléculasão alcançados com 1 ng / L amostras adicionadas desionizada e água do mar sintética.

A reprodutibilidade da embalagem sorvente foi avaliada por secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro e o resultado é mostrado na Figura 1. A reprodutibilidade do tempo de injecção foi testado para as amostras de 100 ml, como mostrado na Figura 2. A concentração in inicial e pré- concentrado cravado amostras foram determinadas usando um kit comercial de ELISA para 17β-estradiol e são mostrados na<...

Um protocolo para a extração e pré-concentração de estradiol de amostras de água usando um sistema automatizado e miniaturizado é apresentado.

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

O objetivo geral deste método de preparação de amostras é pré-concentrar poluentes orgânicos pequenos a partir de amostras de água, de maneira amigável ao usuário, econômica e automatizada. Este método pode substituir os processos padrão de EPE ao estudar a contaminação de amostras de água utilizando métodos de imunodetecção, como ensaios imunoenzimáticos em placas de microtitulação ou biossensores. As principais vantagens desta técnica são que o procedimento de EPE é automatizado, enquanto o tamanho físico e o custo dos instrumentos são baixos em comparação com as abordagens tradicionais.Além disso, o desempenho do processo de enriquecimento atende aos requisitos de análise de imunoensaios tanto em termos de baixo teor de solvente quanto de eficiência de pré-concentração. Primeiro, filtre uma amostra de água de 100 milímetros com um filtro de tamanho de poro de zero vírgula dois micrômetros. Coloque a amostra filtrada em um frasco de vidro com rosca GL 45.Prepare 300 microlitros de eluente diluindo metanol em água desionizada, até 50 por cento do volume em um tubo fechado. Em seguida, prepare uma suspensão de 20 miligramas por mililitro de partículas de silício octadecil com sorvente adicionando 1.600 microlitros de metanol seguidos por 400 microlitros de água desionizada a 40 miligramas de sorvente de fase reversa em um frasco de vidro. Feche bem a tampa e agite com um misturador de vórtice.Coloque uma membrana de náilon com tamanho de poro de 11 micrômetros sobre uma camada dupla de tecido anti-pó. Corte duas pequenas partes na membrana com um furador de três milímetros de diâmetro. Em seguida, segure uma das pequenas membranas com pinça de filtro de ponta plana e coloque-a em um dos lados da coluna.A seguir, parafuse o conector de fundo plano com o tubo e aperte bem. Depois, desenhe uma seta no corpo da coluna, apontando para a extremidade onde a membrana foi colocada. Neste momento, fixe a coluna no suporte com a seta voltada para baixo.Acople uma seringa descartável vazia de 10 mililitros à extremidade do tubo da coluna utilizando os conectores de trava inferiores. Agite a suspensão do sorvente com o misturador de vórtice e pipete rapidamente 100 microlitros no centro da coluna. Durante a injeção, aspire suavemente a solução pipetada através da membrana utilizando a seringa com a outra mão.A preparação da coluna de EPE é muito importante. Você deve garantir que aspire adequadamente a solução através da membrana utilizando a seringa enquanto injeta a suspensão de partículas na coluna. Caso contrário, as partículas não serão compactadas de forma densa.Repita o processo anterior mais duas vezes, agitando a suspensão estoque entre todas as etapas de pipetagem, para garantir uma suspensão homogênea das partículas na solução. Após toda a suspensão ter sido carregada e seca por aspiração com uma seringa, mantenha a seringa na posição e coloque a segunda membrana de náilon em cima, utilizando a pinça com a outra mão. Em seguida, parafuse o segundo conector com um tubo e descarte a seringa.Neste ponto, aperte a coluna no dispositivo de EPE utilizando os conectores de travamento inferiores. Conecte o frasco contendo a amostra ao dispositivo rosqueando a tampa de segurança GL 45 fornecida. Adicione 200 microlitros de eluente no reservatório de eluente.Em seguida, carregue 800 microlitros de água desionizada no reservatório de diluição. Verifique se o regulador de pressão está na posição fechada girando-o no sentido anti-horário até que não seja mais possível movê-lo. Após ligar o protótipo, insira os valores 580 para pset e 30 para delta pset.Para ajustar o regulador de pressão, ligue a bomba. Em seguida, gire manualmente o regulador de pressão até que o valor lido para preg seja inferior, mas próximo de 320 milibares. Após parar a bomba, inicie o procedimento de SPE pressionando iniciar no canto do modo automatizado.Após a conclusão do procedimento de SPE, feche o frasco pequeno da amostra e armazene entre quatro e cinco graus Celsius no escuro, até a análise por ELISA. Para limpar o sistema, prepare uma solução de 10 mililitros de 70 por cento de metanol em volume em um frasco de vidro com rosca GL 45. Desconecte a coluna de SPE e tampe a tubulação com conectores.No modo automatizado, selecione o arquivo de limpeza e inicie-o com as mesmas configurações de pressão previamente utilizadas para pset, delta pset e preg. A reprodutibilidade do empacotamento do sorvente foi avaliada por meio da secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro. A reprodutibilidade do tempo de injeção foi testada para amostras de 100 mililitros.As concentrações das amostras inicialmente adicionadas e pré-concentradas foram determinadas utilizando um kit comercial de ELISA para 17 beta-estradiol. É evidente pelas curvas de calibração que a proporção de metanol da amostra enriquecida não afeta a sensibilidade do ensaio imunológico. Foram calculados rendimentos de 128 ± 22% e 107 ± 6% para água desionizada e água do mar artificial, respectivamente.Uma vez dominada, a preparação de uma coluna de extração em fase sólida pode ser realizada em menos de cinco minutos, se for feita corretamente. Todo o procedimento de SPE pode ser concluído em menos de uma hora. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de ciências ambientais explorarem o desenvolvimento de métodos de imunodetecção para monitoramento de poluentes orgânicos pequenos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras de água utilizando nosso instrumento automatizado e economicamente eficiente para a análise de poluentes por imunoensaios. Não se esqueça de que trabalhar com poluentes orgânicos e solventes pode ser perigoso, e precauções, como o uso de luvas apropriadas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Este protocolo descreve o uso de um tangencial de fibra oca de sistema de ultrafiltração de fluxo concentração da amostra e uma dissociação de calor como passos alternativos para a detecção de...

Uma variante do método EPA 1623 que usa fluxo tangencial ultrafiltração de fibra oca e Passos de calor de dissociação para detectar Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Neste vídeo, demonstramos a extração de metabólitos baseada em sonda SPME de um rim de doador pré-colhido. Os metabólitos extraídos podem ser utilizados para realizar análises metabolômicas e lipidômicas, a fim de avaliar a qualidade do órgão para transplante.

Amostragem de microextração em fase sólida: uma técnica baseada em sonda para extração de amostras de tecidos de enxerto

Este manuscrito descreve uma abordagem automatizada de seleção de tamanho de gel para purificar fragmentos de DNA para sequenciamento de próxima geração. A tecnologia Ranger fornece automação completa de todo o processo de carregamento de gel de agarose, análise eletroforética e recuperação de fragmentos de DNA direcionados, permitindo bibliotecas de sequenciamento de última geração de alto rendimento e alta qualidade.

Automated Gel seleção de tamanho para melhorar a qualidade das bibliotecas de sequenciação de próxima geração Preparado a partir de amostras de água do ambiente

O protocolo de fabricação de um microchip de extração em fase sólida assistido por dipolo para a análise de traços de metal é apresentado.

Fabricação de um dipolo-assistida Fase Sólida Extração Microchip para análise de metais traço em amostras de água

Um protocolo sobre a caracterização e aplicação de cinco diferentes dispositivos de amostragem passiva é apresentado.

Caracterização e aplicação de amostradores passivos de monitorização de pesticidas em água

É necessário um cuidado especial com o uso de "técnicas limpas" para coletar e processar adequadamente amostras de água para estudos de traços de metais em ambientes aquáticos. É apresentado um protocolo para procedimentos de amostragem, processamento e análise com o objetivo de obter dados confiáveis de monitoramento ambiental e resultados com alta sensibilidade para estudos detalhados de metais traços.

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Apresentamos o VacuSIP, um método simples, não intrusivo e confiável para amostragem pontual limpa e precisa de água. O sistema foi desenvolvido e avaliado para a coleta simultânea da água inalada e exalada por alimentadores de suspensão bentônica in situ, para medir de forma limpa a remoção e excreção de compostos particulados e dissolvidos.

VacuSIP, um método melhorado para Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

É apresentado um protocolo para extração abrangente de lipídios, metabólitos e proteínas de tecidos biológicos usando uma amostra.

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Aqui, apresentamos um protocolo para a quantificação de alvo sequencial e não específico de análise de compostos fluorados na água por espectrometria de massa. Esta metodologia proporciona níveis quantitativos de compostos conhecidos fluorochemical e identifica produtos químicos desconhecidos em amostras relacionadas com estimativas semi-quantitativa de sua abundância.

Identificação por- e espécies químicas perfluorados com um fluxo de trabalho combinada alvo e não alvo-triagem de alta resolução de espectrometria de massa

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho totalmente automatizado para a extração de geosmina e 2-metilisoborneol de tecidos de peixes ricos em água e lipídios. O método permite a detecção precoce dessas moléculas antes que atinjam os limiares de odor. São fornecidos dados representativos de um ambiente de aquicultura.

Extração e Detecção de Geosmina e 2-Metilisoborneol em Água e Peixes usando Sondas de Extração Sortiva de Alta Capacidade e GC-MS

Aprenda a extrair poluentes orgânicos de amostras de água usando extração em fase sólida automatizada. Este método reduz custos e tempo de preparação para análises imunológicas ambientais.

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes (Vídeo) | JoVE Journal

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

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