Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

O objetivo geral deste método é recuperar e analisar todas as principais entidades moleculares, incluindo metabólitos polares e semipolares, lipídios e proteínas de uma única amostra usando uma extração simples de éter metil-tributílico fracionado. Geralmente, os cientistas acham difícil analisar várias classes de compostos a partir de uma única amostra. Usando a extração MTBE que apresentamos aqui, você pode extrair e analisar várias classes de compostos, como lipídios, metabólitos e proteínas de uma única amostra.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode extrair de forma robusta todas as classes de compostos moleculares de uma pequena quantidade de alíquota de amostra única. Este método ajuda a responder a questões fundamentais em biologia de sistemas, uma vez que fornece a base experimental para a análise multiômica, fornecendo frações que podem ser usadas para análise por proteômica, lipidômica e metabolômica. O protocolo a seguir é demonstrado usando tecido foliar de Arabidopsis.

Arabidopsis são pequenas plantas com flores da família Brassicaceae e estão relacionadas ao repolho. Comece este procedimento pré-resfriando os suportes dos tubos homogeneizadores de tecidos em nitrogênio líquido por pelo menos 10 minutos. Remova as amostras de nitrogênio líquido e coloque-as nos suportes dos tubos.

Em seguida, remova os suportes do tubo do nitrogênio líquido. Coloque rapidamente os suportes de tubo no homogeneizador de tecidos e ajuste o homogeneizador para moer o material biológico em um pó fino e homogêneo. Para folhas, use 20 hertz por um minuto.

O tempo e a velocidade de homogeneização podem variar dependendo do tecido. Certifique-se de homogeneizar até que a amostra resultante seja um pó muito fino. E a amostra deve ser mantida congelada em cada etapa da homogeneização.

Homogeneizar as amostras e, em seguida, remover as amostras biológicas dos suportes dos tubos. E se eles não forem usados imediatamente, coloque-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos até a extração adicional. Rotule quatro tubos de microcentrífuga de fundo redondo de dois mililitros com o número da amostra.

Pré-resfrie os tubos e algumas espátulas submergindo-os em nitrogênio líquido. Quando os tubos e espátulas estiverem frios, coloque um dos tubos em uma balança analítica e use uma espátula para alíquota de 25 miligramas de pó de tecido no tubo de microcentrífuga. Registar o peso exacto de cada amostra e, em seguida, colocar imediatamente as amostras alíquotas em azoto líquido.

Execute esta etapa rapidamente para evitar o descongelamento do material vegetal. Armazenar as amostras alíquotas a menos 80 graus Celsius até nova extração. Para preparar a extração, pré-arrefecer o éter metil terc-butílico ou a mistura de extração de metanol MTBE, preparada conforme descrito no documento anexo, num congelador congelador de 20 graus Celsius negativos.

Retirar as amostras aliquotadas e adicionar um mililitro da mistura de extracção pré-arrefecida a cada tubo de amostra. Execute esta etapa rapidamente. O MTBE tem baixa viscosidade e pode pingar da ponta da pipeta.

Misturar cada amostra imediatamente num misturador de vórtices até que o tecido esteja bem homogeneizado na mistura de extracção. Mantenha os tubos em um rack na bancada até que todas as amostras tenham sido extraídas. Esta etapa é crítica.

Aqui precipitamos proteínas e inativamos suas atividades enzimáticas. Incubar todas as amostras em um agitador orbital a 100 RPM por 45 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, sonicar as amostras durante 15 minutos num banho de sonicação gelado.

Em seguida, para fracionar por separação de fases, adicione 650 microlitros de uma solução de três para um de água e metanol a cada tubo de amostra. Em seguida, misture por vórtice por um minuto. Centrifugar as amostras a uma velocidade de 20 000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após esta etapa, manuseie os tubos com cuidado para evitar a mistura das duas fases líquidas e evitar interromper o pellet precipitado. Nesta fase, existem duas fases líquidas admissíveis com um pellet sólido no fundo do tubo. A fase superior não polar contém lipídios.

A fase aquosa inferior contém metabólitos polares e semipolares. O pellet contém proteínas, amidos e a parede celular. Transfira 500 microlitros do solvente da fase superior contendo lipídios para um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,5 mililitro.

Em seguida, usando uma pipeta de 200 microlitros, remova cuidadosamente a fase lipídica restante e descarte-a. Em seguida, transfira 400 microlitros do solvente da fase inferior para um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,5 mililitro. Transfira uma alíquota adicional de 200 microlitros para um tubo de microfuga para realizar análises adicionais, como análise de metabólitos baseada em cromatografia gasosa.

Remover e rejeitar o resto da fase aquosa pipetando o excesso de volume. Em seguida, para lavar o pellet de parede celular de proteína-amido-amido obtido, adicione 500 microlitros de metanol e depois vortex por um minuto. Centrifugar as amostras a uma velocidade de 10 000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Evaporar o solvente das amostras de lipídios usando um evaporador de fluxo de nitrogênio para evitar modificações oxidativas dos lipídios. As amostras secas resultantes devem ser analisadas imediatamente. Evaporar o solvente das amostras aquosas durante a noite num concentrador de vácuo sem aquecimento.

As amostras aquosas secas podem ser armazenadas por várias semanas a menos 80 graus Celsius antes da análise. Ressuspenda as frações lipídicas secas em 400 microlitros de uma solução de sete a três acetonitrila para 2-propanol. Transfira líquido suficiente para frascos de vidro e tampe bem.

Em seguida, coloque os frascos de vidro em um amostrador automático resfriado a quatro graus Celsius. Injete dois microlitros por amostra e separe os lipídios em uma coluna C8 de fase reversa mantida a 60 graus Celsius usando um sistema UPLC funcionando a uma taxa de fluxo de 400 microlitros por minuto. Utilizar as fases móveis descritas no quadro 1 do documento de acompanhamento para a separação cromatográfica.

Adquira os espectros de massa no modo de ionização positiva e negativa usando um instrumento MS adequado cobrindo a faixa de massa entre 150 e 1500 relação carga-massa. Ressuspenda a fase polar em 200 microlitros de uma solução de metanol de grau UPLC um-para-um para água. Transfira líquido suficiente para frascos de vidro e tampe bem.

Em seguida, coloque os frascos de vidro em um amostrador automático resfriado, quatro graus Celsius. Injete dois microlitros de cada amostra e separe os metabólitos em uma coluna RP C-18 mantida a 40 graus Celsius usando um sistema UPLC funcionando a uma taxa de fluxo de 400 microlitros por minuto. Utilizar as fases móveis para a separação cromatográfica com os parâmetros indicados no quadro 2 do documento anexo.

Adquira espectros de massa de varredura completa no modo de ionização positiva e negativa usando um espectrômetro de massa adequado cobrindo uma faixa de massa entre 50 e 1500 massas-carga. Por fim, realize a extração, digestão e análise de proteínas, conforme descrito no documento anexo. 25 miligramas de tecido foliar de Arabidopsis foram colhidos, moídos e extraídos antes de serem submetidos a três plataformas analíticas de UPLC-MS.

Os metabólitos primários e secundários polares e semipolares foram analisados a partir da fase polar por UPLC-MS C-18 de fase reversa. Os cromatogramas de pico de base de lipídios, mostrados no painel superior, e metabólitos semipolares, mostrados no painel inferior, foram analisados no modo de ionização positiva. O gráfico de pizza no canto superior direito de cada cromatograma mostra o número de lipídios e metabólitos identificados atribuídos a diferentes classes químicas.

Por exemplo, 58 lipídios diferentes foram atribuídos ao grupo triacilglicerídeos, indicado no gráfico superior como TAG. Metabólitos mais hidrofílicos dessa fração, como açúcares e aminoácidos polares, que não apresentam boa retenção no material de fase reversa, podem ser analisados por outros métodos analíticos, como GCMS, ou cromatografia líquida de interação hidrofílica. As proteínas que foram recuperadas da extração foram digeridas em solução e analisadas usando LCMS shotgun.

O gráfico de pizza mostrado no canto superior direito indica o número de proteínas identificadas atribuídas a diferentes processos biológicos. Por exemplo, 268 proteínas foram atribuídas à categoria de localização. Em resumo, mais de 200 espécies lipídicas, 50 metabólitos semipolares anotados e vários milhares de proteínas podem ser rotineiramente identificadas a partir de amostras como a usada neste exemplo.

Além disso, o método mostrou ampla aplicabilidade usando diferentes tecidos, órgãos e material de cultura de células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como extrair e analisar os compostos mais essenciais de uma única amostra. Ao tentar este procedimento, é importante manter todas as amostras congeladas, triturar o material adequadamente e usar solventes e produtos químicos de grau analítico.

Seguindo este procedimento, todos os métodos analíticos podem ser empregados para determinar a composição molecular das amostras extraídas.