Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

O objetivo geral deste método é recuperar e analisar todas as principais entidades moleculares, incluindo metabólitos polares e semipolares, lipídios e proteínas, a partir de uma única amostra, utilizando uma extração simples fracionada com éter metil-terc-butilico. Geralmente, os cientistas encontram dificuldade em analisar múltiplas classes de compostos a partir de uma única amostra. Com a extração com MTBE que apresentamos aqui, é possível extrair e analisar múltiplas classes de compostos, como lipídios, metabólitos e proteínas, a partir de uma única amostra.

A principal vantagem desta técnica é que ela pode extrair de forma robusta todas as classes de compostos moleculares a partir de uma pequena quantidade de alíquota de uma única amostra. Este método auxilia na resposta de questões fundamentais em biologia de sistemas, pois fornece a base experimental para análise de multiômicas, fornecendo frações que podem ser utilizadas para análise por proteômica, lipidômica e metabolômica. O protocolo a seguir é demonstrado utilizando tecido foliar de Arabidopsis.

Arabidopsis são pequenas plantas com flores da família Brassicaceae, relacionadas à couve. Inicie este procedimento pré-resfriando os suportes de tubos do homogeneizador de tecidos em nitrogênio líquido por pelo menos 10 minutos. Remova as amostras do nitrogênio líquido e coloque-as nos suportes de tubos.

Em seguida, retire os porta-tubos do nitrogênio líquido. Coloque rapidamente os porta-tubos no homogeneizador de tecidos e configure o homogeneizador para triturar o material biológico em um pó fino e homogêneo. Para folhas, use 20 hertz por um minuto.

O tempo e a velocidade da homogenização podem variar dependendo do tecido. Certifique-se de homogenizar até que a amostra resultante seja um pó muito fino. A amostra deve ser mantida congelada em todas as etapas da homogenização.

Homogeneíze as amostras, depois remova as amostras biológicas dos porta-tubos. Se elas não forem usadas imediatamente, coloque-as em um congelador a menos 80 graus Celsius até a extração posterior. Rotule quatro tubos microcentrífugos cónicos seguros de dois mililitros com o número da amostra.

Pré-resfrie os tubos e algumas espátulas submergindo-os em nitrogênio líquido. Uma vez que os tubos e espátulas estejam frios, coloque um dos tubos em uma balança analítica e use uma espátula para aliquotar 25 miligramas de pó tecidual no tubo de microcentrifugação. Registre o peso exato de cada amostra e, em seguida, coloque imediatamente as amostras aliquotadas em nitrogênio líquido.

Realize este passo rapidamente para evitar o descongelamento do material vegetal. Armazene as amostras alíquotas a menos 80 graus Celsius até a extração subsequente. Para preparar a extração, pré-resfrie a mistura de éter metil-terc-butilico, ou mistura de metanol MTBE, preparada conforme descrito no documento suplementar, em um congelador a menos 20 graus Celsius.

Retire as amostras alíquotas e adicione um mililitro da mistura de extração pré-resfriada a cada tubo de amostra. Realize este passo rapidamente. O MTBE possui baixa viscosidade e pode escorrer da ponta da pipeta.

Misture imediatamente cada amostra em um agitador vortex até que o tecido esteja bem homogeneizado na mistura de extração. Mantenha os tubos em um suporte sobre a bancada até que todas as amostras tenham sido extraídas. Esta etapa é crítica.

Aqui precipitamos proteínas e inativamos suas atividades enzimáticas. Incube todas as amostras em um agitador orbital a 100 RPM durante 45 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, sonique as amostras por 15 minutos em um banho de sonicação gelado.

Em seguida, para fracionar por separação de fases, adicione 650 microlitros de uma solução três para um de água e metanol a cada tubo de amostra. Em seguida, homogeneíze por vortex por um minuto. Centrifugue as amostras a uma velocidade de 20.000 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após esta etapa, manipule os tubos com cuidado para evitar a mistura das duas fases líquidas e para não perturbar o pellet precipitado. Nesta fase, existem duas fases líquidas admissíveis com um pellet sólido no fundo do tubo. A fase superior não polar contém lipídios.

A fase aquosa inferior contém metabolitos polares e semipolares. O pellet contém proteínas, amidos e a parede celular. Transfira 500 microlitros do solvente da fase superior, rica em lipídios, para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro devidamente identificado.

Em seguida, utilizando uma pipeta de 200 microlitros, remova cuidadosamente a fase lipídica remanescente e descarte-a. A seguir, transfira 400 microlitros do solvente da fase inferior para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro devidamente identificado. Transfira uma alíquota adicional de 200 microlitros para um tubo microcentrífugo para realizar análises adicionais, como análise de metabólitos por cromatografia gasosa.

Remova e descarte o restante da fase aquosa pipetando o excesso de volume. Em seguida, para lavar o pellet obtido de proteína-amido-parede celular, adicione 500 microlitros de metanol e vortex por um minuto. Centrifugue as amostras a uma velocidade de 10.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Evapore o solvente das amostras lipídicas utilizando um evaporador com fluxo de nitrogênio para evitar modificações oxidativas dos lipídios. As amostras secas resultantes devem ser analisadas imediatamente. Evapore o solvento das amostras aquosas durante a noite em um concentrador a vácuo sem aquecimento.

As amostras aquosas secas podem ser armazenadas por várias semanas a menos 80 graus Celsius antes da análise. Re-suspenda as frações lipídicas secas em 400 microlitros de uma solução de acetonitrila para 2-propanol na proporção de sete para três. Transfira quantidade suficiente do líquido para frascos de vidro e feche firmemente.

Em seguida, coloque os frascos de vidro em um amostrador automático refrigerado a quatro graus Celsius. Injete duas microlitros por amostra e separe os lipídios em uma coluna de fase reversa C8 mantida a 60 graus Celsius utilizando um sistema UPLC operando a uma vazão de 400 microlitros por minuto. Utilize as fases móveis descritas na Tabela 1 do documento suplementar para a separação cromatográfica.

Adquira os espectros de massa em modo de ionização positiva e negativa utilizando um instrumento de EM apropriado que cubra a faixa de massa entre 150 e 1500 de razão carga-massa. Re-suspenda a fase polar em 200 microlitros de uma solução de metanol grau UPLC em água na proporção um para um. Transfira quantidade suficiente do líquido para frascos de vidro e tampe firmemente.

Em seguida, coloque os frascos de vidro em um amostrador automático refrigerado, a quatro graus Celsius. Injete dois microlitros de cada amostra e separe os metabólitos em uma coluna RP C-18 mantida a 40 graus Celsius utilizando um sistema UPLC operando a uma vazão de 400 microlitros por minuto. Utilize as fases móveis para a separação cromatográfica com os parâmetros indicados na Tabela 2 do documento suplementar.

Adquira espectros de massa em modo de ionização positiva e negativa usando um espectrômetro de massa apropriado, cobrindo uma faixa de massa entre 50 e 1500 razão massa/carga. Por fim, realize a extração, digestão e análise de proteínas, conforme descrito no documento complementar. Vinte e cinco miligramas de tecido foliar de Arabidopsis foram coletados, moídos e extraídos antes de serem submetidos a três plataformas analíticas de UPLC-MS.

Os metabólitos primários e secundários polares e semipolares foram analisados a partir da fase polar por UPLC-MS em fase reversa C-18. Os cromatogramas de íons base de lipídios, mostrados no painel superior, e de metabólitos semipolares, mostrados no painel inferior, foram analisados no modo de ionização positiva. O gráfico de pizza no canto superior direito de cada cromatograma mostra o número de lipídios e metabólitos identificados atribuídos a diferentes classes químicas.

Por exemplo, 58 lipídios diferentes foram atribuídos ao grupo de triacilgliceróis, indicados no gráfico superior como TAG. Metabólitos mais hidrofílicos dessa fração, como açúcares e aminoácidos polares, que não apresentam boa retenção no material de fase reversa, podem ser analisados por outros métodos analíticos, como CG-EM ou cromatografia líquida de interação hidrofílica. As proteínas recuperadas da extração foram digeridas em solução e analisadas por espectrometria de massas com shotgun em CL.

O gráfico de setores mostrado no canto superior direito indica o número de proteínas identificadas atribuídas a diferentes processos biológicos. Por exemplo, 268 proteínas foram atribuídas à categoria de localização. Em resumo, mais de 200 espécies lipídicas, 50 metabólitos semipolares anotados e várias milhares de proteínas podem ser rotineiramente identificados em amostras como a utilizada neste exemplo.

Além disso, o método demonstrou ampla aplicabilidade utilizando diferentes tecidos, órgãos e materiais de cultura celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair e analisar os compostos mais essenciais a partir de uma única amostra. Ao realizar este procedimento, é importante manter todas as amostras congeladas, moer adequadamente o material e utilizar solventes e produtos químicos de grau analítico.

Após este procedimento, todos os métodos analíticos podem ser empregados para determinar a composição molecular das amostras extraídas.