Name: Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprenda a usar microarranjos celulares de alta capacidade para correlacionar diferenciação celular e forças de tração em contextos microambientais variados. Esta técnica avança pesquisas em engenharia de tecidos e biologia de células-tronco.

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Nós reconhecemos Austin Cyphersmith e Mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Instituto de Biologia genômica, Universidade de Illinois em Urbana-Champaign) para assistência com microscopia e para generosamente acomodar tela e captura de vídeo no centro de microscopia.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nas nossas experiências, verificou-se que as deficiências mais comuns estão relacionados com a qualidade das matrizes fabricadas e mal caracterizado resposta no sistema biológico de interesse. Nós nos referimos ao leitor a Tabela 1 para os modos de falha comuns em experimentos de microarranjos celular e passos de resolução de problemas associados. Em relação à qualidade de matrizes em particular, recomendamos o seguinte. Confirmar a qualidade técnica e robustez do arraying programas, parâmetros e buffers usando moléculas fluorescente etiquetado como dextrano rodamina conjugada. pins completamente limpas antes ou depois predispor acordo com as instruções do fabricante e ainda verificar visualmente que os canais de pinos são livre de detritos usando um microscópio de luz. Confirmar retenção biomolécula vestida usando manchas de proteínas gerais ou imunomarcação. Note-se que as biomoléculas com um peso molecular abaixo de 70 kDa, não são frequentemente retidas em que o hidrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Validar células-funcionalidade biomolécula vestiu o uso de vários tipos de células. Note-se que apenas as células aderentes são compatíveis com matrizes; Além disso, a aderência a matrizes é dependente de ambas as propriedades específicas de células (por exemplo, o perfil de expressão de integrina) e as proteínas da MEC seleccionados. Devido ao espaço limitado, que não forneceram um extenso tratamento de projeto matriz, layout, e fabricação aqui e remeter o leitor a trabalhos anteriores 23, 25. Geralmente usamos 100 subarrays pontos (150 de diâmetro mm local, 450 mm de distância de centro a centro), composto por 10-20 condições de biomoléculas exclusivos (ie, 5-10 pontos / condição). O número de submatrizes em uma matriz varia, dependendo do número de condições de biomoléculas de interesse, o que pode ser confortavelmente dimensionada até 1280 em uma lâmina de microscópio de 25 x 75 mm (~ 6.400 pontos em 64 submatrizes)refex &quot;&gt; 25, 31 Os parâmetros acima irão variar ainda mais, dependendo do tamanho padrão de interesse;. pinos capazes de gerar padrões de 75-450 | iM são facilmente disponíveis. experimentos de matriz são melhor complementados pela validação de alta pontuação condições dispostas de interesse usando outros formatos cultura, leituras de ensaio e sistemas de modelos biológicos. Especificamente, recomendamos validar ainda mais os efeitos de selecionar condições dispostas utilizando culturas a granel em conjunto com técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, qRT-PCR, immunoblotting) ou TFM padrão. A manipulação genética (por exemplo, a sobre-expressão ou knockdown) do factor de interesse num sistema de modelo biológico adequado pode servir também para confirmar os efeitos observados em matrizes. Em modelos animais in vivo representam um outro meio de validação e foram recentemente utilizados, por exemplo, para confirmar o papel central da galectina-3 e galectina-8 emo cancro do pulmão metastático nicho, como inicialmente identificado através de microarray de células 31, 49. Uma série de outros métodos têm sido utilizados para sondar regulação microambiental de funções celulares, incluindo uma variedade de dois-dimensional sistemas microfabricated 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 e tridimensionais sistemas de biomateriais engenharia 56, 57, 58 , 59, 60, 61. Em comparação com outros métodos, as vantagens particulares da plataforma de microarray de células descritas aqui consistem em: (1) saída de atécentenas ou milhares de diferentes combinações de factores, permitindo a análise dos efeitos de interacção; (2) acessíveis, de imagem e análise automatizada; (3) integração de ambas as leituras bioquímicas e biofísicas com apresentação controlada de factores dispostas; (4) capacidade de variar as propriedades do material de substrato; e (5) a análise de uma única célula de alto teor de destino e a função da célula. Em resumo, a combinação de microarrays de células com TFM em substratos de rigidez do substrato sintonizável permite a caracterização completa de ambos os sinais bioquímicos e biofísicos. Tal como aqui apresentado, esta plataforma é generalizável e pode ser facilmente aplicado a uma variedade de tipos de células aderentes e contextos de tecido para uma melhor compreensão da regulação microambiental combinatória de diferenciação celular e mecanotransdução.

As interacções entre células vizinhas e factores micro-ambientais mediar uma grande variedade de processos biológicos ao longo do desenvolvimento, homeostase e doenças patogénese 1, 2, 3, 4. Estas interacções incluem microambiente entrega de factores solúveis para as células, a ligação de células-matriz, e interacções célula-célula através da ligação ligando-receptor. Para além das considerações bioquímicas acima, os parâmetros biofísicas, tais como as propriedades mecânicas do substrato (por exemplo, o módulo de Young, a porosidade) e forma da célula, e mecanotransdução jusante associada têm cada vez mais ganhou reconhecimento como os principais mediadores da diferenciação celular da 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt;, 10. Sinais resultantes dessas interações microambiente servem como entradas para redes de genes e vias de sinalização. Além disso, esses componentes da célula-intrínseca também fornecer feedback para o microambiente via fatores secretados e enzimas que degradam a matriz, completando um ciclo de co-regulação complexa entre programas genéticos de células-intrínseca e fatores do microambiente de células-extrínseca 5, 11, 12. A utilização de sistemas de engenharia para a apresentação controlada de factores micro-ambientais mostrou-se útil numa variedade de contextos diferentes 13, 14, 15. Sistemas microfabricados em particular, têm facilitado modelação espacial precisa de proteínas e células, bem como a análise altamente paralelizado através miniaturização 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays celulares representam um tal sistema microfabricado em que combinações de biomoléculas são para um hidrogel de poliacrilamida substrato elástico 23, 24, 25 impressos-contacto. A inclusão de componentes de células-adesivo (nomeadamente proteínas da matriz) permite a adesão sustentada cultura de células e em microarrays, que é frequentemente seguida de análise a jusante através de imunocitoquímica e repórteres fluorescentes. Microarrays celulares foram produtiva orientada para alcançar uma melhor compreensão do fenótipo das células do fígado 23, 26, diferenciação neural precursor 27, Mammardecisões y progenitor destino 28, células-tronco embrionárias de manutenção / diferenciação 23, 29, 30, metástase de câncer de pulmão 31 e resposta terapêutica em pacientes com melanoma 32. Nós demonstramos recentemente, a utilização de microarranjos de células para definir o papel de matriz extracelular (ECM) na composição de proteína especificação endoderme 33, fígado progenitoras diferenciação 34, 35, e de tumor de pulmão de células 36 a resposta à droga. Nestes trabalhos, temos nos concentrado em estender as capacidades combinatórias da plataforma matriz e explorar as interseções de sinalização celular-intrínseca com composição da matriz extracelular e biomecânica. Além disso, temos implementado leituras biofísicos nesta plataforma de matriz para fornecer a capacidade de quantitativamente caracteterize o papel da contractilidade celular na diferenciação processa 35. Para fazer isso, integramos microscopia de força de tração (TFM) com microarrays de células para permitir a avaliação de alto rendimento de tração gerada por células. TFM é um método amplamente utilizado para medir forças de tração gerada por células e forneceu insights significativos sobre a coordenação de uma única célula e função em nível de tecido com a composição e biomecânica do microambiente local, 37, 38, 39, 40. Assim, combinando TFM com microarrays celulares fornece um sistema de alto rendimento para medir principais parâmetros biofísicos, fisiologicamente relevantes. A plataforma de microarray celular aqui descrita consiste em quatro seções: a fabricação de substratos de poliacrilamida, fabricação de matrizes, cultura de células e leitura de ensaio e análise de dados. VejoA Figura 1 para um resumo esquemático dos primeiros três secções experimentais; veja a Figura 2 para um resumo esquemático da secção final com foco em análise de dados de imunofluorescência. A fim de adaptar a plataforma de microarray celular para estudos de interações-substrato celular biomecânicos, foram utilizados substratos de poliacrilamida de módulo ajustável de Young, mas porosidade semelhante, por Wen et al. 41. Para habilitar medições TFM de forças exercidas por células no seu substrato, foi implementado um formato de placa de Petri com fundo de vidro, além do microscópio de vidro grosso lâminas freqüentemente utilizada por outros grupos. Assim, esta plataforma de microarray célula é capaz de medições paralelas de diferenciação celular, através de imunofluorescência em lâminas de microscópio e as forças geradas por celulares via TFM em pratos com fundo de vidro separados. Temos também aplicadas várias melhorias para a abordagem analítica utilizada com microarrays celulares. specifically, em vez de paramétrico Z-pontuação da intensidade global ilha, medir a intensidade de uma única célula e aplicar a normalização quantil, a fim de explicar as distribuições não-normais e com mais precisão descrever o comportamento celular. Acreditamos que essas melhorias fornecem uma utilidade particular para com investigações de processos biológicos em que sinais bioquímicos e biofísicos jogar, papéis de interseção significativos. Além disso, os nossos melhorias analíticos permitir a aplicação de microarrays de células para estudos de uma série de funções celulares para os quais de uma única célula e comportamento de nível população divergem.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m filtro de seringa</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Combine com seringas de plástico Luer lock de tamanho apropriado.</td></tr><tr><td>100 &ampvezes; penicilina&ndash; solução de estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &vezes; 60 mm de cobertura</td> de <td>microscopia eletrônica Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoxissilil)propil metacrilato (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Armazene sob gás inerte de acordo com as instruções do fabricante. A exposição do 3-TPM ao ar pode comprometer a silanização de substratos de vidro. CUIDADO: 3-TPM é um líquido combustível. Mantenha longe do calor, faíscas, chamas abertas e superfícies quentes e use apenas em um exaustor químico.</td></tr><tr><td>3-[(3-Colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato hidratado (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm</td><td>Célula E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>Poço de 13 mm composto por vidro de cobertura #1,5. Permite TFM e imagens de células vivas.</td></tr><tr><td>Microplaca de polipropileno com fundo em V de 384 poços, não estéril</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de poliestireno de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>As placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm se encaixam em poços de microplacas, facilitando a fabricação da matriz.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>CUIDADO: A exposição à acrilamida pode resultar em toxicidade aguda e irritação. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Colágeno I, cauda de rato</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno III, EMD humano</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV, EMD humano</td><td>Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Reticulador, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, conjugado com rodamina B, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Usado como marcador para localização da matriz.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinante DLL1, camundongo</td><td>R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinante DLL4, camundongo</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinante JAG1, rato</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, microscópio fluorescente humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr>, <td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>invertido</td><td>Certifique-se de que o microscópio esteja equipado com uma platina robótica para imagens fluorescentes automatizadas e TFM. Controle ambiental (ou seja., 37 & C e 5% de CO2) é altamente recomendado para TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G com DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>CUIDADO: O ácido acético é inflamável e corrosivo. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, camundongo</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Scanner de microarray</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Os fluoróforos devem ser compatíveis com Cy3 ou Cy5.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro</td><td>Outros microarrayers de capacidade semelhante ou maior podem ser prontamente substituídos.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, 25 &vezes; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0,9 - 1,1 mm de espessura.</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Metilenobisacrilamida (bisacrilamida)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>CUIDADO: A exposição à acrilamida pode resultar em toxicidade aguda e irritação. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA), 16% v/v</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>RT15710</td><td>Prepare o PFA fresco (não armazene) para uma fixação ideal. CUIDADO: A exposição ao PFA pode resultar em toxicidade aguda e também pode irritar ou corroer a pele em contato. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos e use apenas em um exaustor químico.</td></tr><tr><td>Proteína A/G, bandeja de secagem Pyrex recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>, 2.000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura retangular de 4 câmaras</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Para cultura de células em lâminas de microscópio dispostas.</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>CUIDADO: O NaOH é altamente cáustico e pode causar queimaduras graves na pele e danos aos olhos. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Pino invisível para matriz</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Limpe os pinos após cada execução da matriz usando as instruções do fabricante. Produz domínios de 150 mícrons; Compre outros tamanhos de pinos (75&ndash; 450 mícrons) conforme adequado à sua aplicação específica.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

um de alta capacidade: plataforma celular microarray para análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

microarrays celulares microfabricated, que consistem em combinações impressa contato de biomoléculas em uma superfície hidrogel elástico, fornecer um alto throughput sistema rigidamente controlado, projetado para medir o impacto de sinais bioquímicos dispostas na diferenciação celular. Esforços recentes utilizando microarrays de células têm demonstrado a sua utilidade para estudos combinatórios em que muitos fatores do microambiente são apresentados em paralelo. No entanto, estes esforços têm focado principalmente na investigação dos efeitos dos sinais bioquímicos sobre as respostas celulares. Aqui, apresentamos uma plataforma de microarray célula com propriedades materiais ajustáveis ​​para avaliar tanto a diferenciação celular por interações de imunofluorescência e célula-substrato biomecânica por microscopia de força de tração. Para fazer isso, nós desenvolvemos dois formatos diferentes, utilizando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes módulo de Young fabricado em ambos lâminas de microscópio ou placas de Petri com fundo de vidro. Nós fornecemos bespráticas t e solução de problemas para a fabricação de microarrays nesses substratos de hidrogel, a cultura de células subsequente sobre microarrays, e aquisição de dados. Esta plataforma está bem adequada para uso em investigações de processos biológicos para os quais tanto bioquímicos (por exemplo, a composição da matriz extracelular) e biofísico (por exemplo, rigidez) do substrato pistas podem desempenhar significativa, intersectando papéis.

Usando esta plataforma, investigou-se a papel de ambos os sinais bioquímicos e biofísicos na especificação de destino progenitoras do fígado 34, 35. Ligandos / Notch L-conjugado de proteína A mostrou uma melhor retenção e o agrupamento em que o hidrogel de poliacrilamida (Figura 3A) e foram, além disso, capaz de dirigir a diferenciação de células progenitoras do fígado para um destino celular ducto biliar (Figura 3B). Usando a análise de uma única célula, que quantificada a resposta aos ligandos de entalhe para as proteínas da MEC colagénio I, colagénio III, colagénio IV, fibronectina e laminina (Figura 3C), considerando que a resposta de células progenitoras do fígado para o ligando depende também da contexto ECM. Última, utilizamos shRNA knockdown para gerar as progenitoras do fígado sem os ligantes DLL1 e Jag1. A resposta ao ligando Notch dispostas variou de acordo com o presence de qualquer ligando, o que confirma que a capacidade de resposta ao ligando das células-extrínseca é também uma função da expressão de ligando de células-intrínseca (Figura 3D). Além disso, observou-se uma subpopulação distinta de duplo positivo (ALB + / + OPN) em células do knockdown DLL1 (Figura 3D). Juntos, esses resultados representativos mostram: (1) as capacidades combinatórias do formato de matriz, como exemplificado pelo emparelhamento de vários vestiu proteínas da MEC e ligantes Notch com o knockdown de ligantes individuais; (2) a funcionalidade da dispostas não só proteínas ECM, mas também dispostas ligando-célula através de proteína A / G-conjugação mediada; e (3) a implementação de nossa análise de uma única célula e sua capacidade de discernir subpopulações únicas. Observou-se também que a diferenciação de células progenitoras hepáticas é dependente tanto a rigidez do substrato e a composição de ECM (Figura 4A </str<html> ong&gt;), especificamente encontrar que o colagénio IV é favorável à diferenciação em ambos os substratos macios e duros, enquanto fibronectina suporta apenas a diferenciação em substratos rígidos (Figura 4B). Mapas de calor representativas das medições da TFM sugeriu que o estresse de tração sustentado a baixa rigidez substrato sobre o colágeno IV promoveu a diferenciação em células do ducto biliar (Figura 4C), um achado confirmado por valores médios root mean square (Figura 4D). Juntos, esses resultados representativos mostram: (1) a integração bem sucedida de TFM com microarrays de células em substratos com uma rigidez ajustável para avaliar tanto o fenótipo celular e o estresse de tração; (2) a coordenação do destino das células progenitoras do fígado, com tanto a composição da matriz e a rigidez do substrato; e (3) a implementação da nossa análise e típicos perfis de estresse de tração TFM em microarrays celulares. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Visão esquemática que mostra os primeiros três seções experimentais. Na Seção 1, substratos de vidro são limpos e silanizada para facilitar a fabricação de hidrogéis de poliacrilamida. Na secção 2, as combinações de biomoléculas de interesse são preparados de uma fonte de microplacas de 384 poços. A arrayer robótico é então carregado com pinos limpas, a microplaca fonte, e os hidrogéis de poliacrilamida e inicializado, fabricação de matrizes nos hidrogéis. No ponto 3, as células são semeadas sobre os domínios dispostas e deixadas a aderir, após o qual o protocolo de cultura de interesse é realizada. No ponto final, as células ou são fixadas por imunocitoquímica / imunofluorescência ou analisados ​​por meio de TFM. As barras de escala são 75 uM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: Processamento e Análise de imunofluorescência dados de matrizes. (A) de Azulejo, imagens RGB compostas de 32 bits são primeiro binned e depois dividido em canais de 8 bits individuais. Usando uma combinação de marcadores fluorescentes dispostas e ilhas de células, três cantos da matriz são identificadas para permitir a orientação automatizado e gridding das matrizes. (B) dados de uma única célula é gerado para cada canal dos arrays de entrada. A fim de explicar o desvio experimental, a normalização quantil é aplicado por replicar biológica, produzindo uma única distribuição compartilhada entre todas as repetições. Quantile de dados normalizado é posteriormente plotados e interpretada por cálculo das medições do conjunto (por exemplo, células / ilha, intensidade média, as células percentuais positivos para uma etiqueta) ou análise direta de distribuições de uma única célula.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Apresentação Notch Ligando medeia fígado Progenitor diferenciação. (A) Notch Fc recombinante ligantes Jagged-1 (JAG1) e Delta-like 1 (DLL1) apresentaram maior retenção e clustering quando vestida com Proteína A / G. barra de escala é de 50 mm. Progenitores (B) do fígado diferenciadas em células do ducto biliar mediante a apresentação com ligando de Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) é um marcador nuclear, albumina (ALB) é um marcador de célula hepática, e osteopontina (OPN) é um marcador de células do ducto biliar. barra de escala é de 150 mm. (C) Quantificação da percentagem de células positivas para OPN para os ligandos Notch JAG1, DLL1, e semelhante a delta 4 (Dll4) sobre as proteínas da MEC colagénio I, collagen III, colágeno IV, fibronectina e laminina. -Testes T de Student foram realizados contra a IgG de controlo para cada ligando Notch vestida dentro de cada proteína ECM com valores P indicada para P &lt;0,05 (*). (D) Imagem citometria de ALB e OPN para as células no colagénio III apresentados com os ligantes Notch JAG1, DLL1 e DLL4. Progenitoras do fígado sem a Notch ligantes DLL1 e Jag1 (ie, shDll1 e shJag1) foram gerados usando shRNA knockdown. Os dados em (C) apresentados como média ± SEM Esta figura foi modificado a partir do Kaylan et ai. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: composição da matriz e do substrato Rigidez Coordinate fígado Progenitor diferenciação. (A) a diferenciação de células progenitoras do fígado contra células biliares é dependente tanto a composição ECM e rigidez substrato. DAPI é um marcador nuclear, ALB é um marcador de célula hepática, e o OPN é um marcador de células do ducto biliar. (B) Quantificação da percentagem de células positivas para OPN em substratos de módulo de Young de 30 kPa, 13 kPa, e 4 kPa para o colagénio I (C1), colagénio IV (C4), a fibronectina (FN), e todas as duas combinações diferentes de essas proteínas da MEC. (C) o estresse de tração celular é dependente tanto rigidez substrato e composição ECM. (D) A quantificação dos valores de raiz quadrada média de estresse de tração em substratos do módulo de Young de 30 kPa e 4 kPa para colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), e todos bidirecionais combinações desses proteínas da MEC. Em (B) e (D), os dados foram apresentados como média ± do SEM e aluno -Testes tForam realizadas contra 30 kPa para cada combinação de ECM com valores P indicada para P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), e P &lt;0,001 (***). As barras de escala são 50 uM. Este valor foi modificado a partir Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Seção </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> Causas potenciais </td><td> Solução </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Fabricação de poliacrilamida substrato. </td><td> Lamela não pode ser removida do hidrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reduzir o tempo de polimerização para &lt;10 minutos (4 W / m 2). Verifique se crossli UVsaída nker está dentro do intervalo esperado. </td></tr><tr><td> Pobre de polimerização de poliacrilamida hidrogel. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentar o tempo de polimerização para&gt; 10 minutos (4 W / m 2). Verifique se a saída de reticulação UV está dentro do intervalo esperado. </td></tr><tr><td> hidrogeles de poliacrilamida são danificadas após a remoção da lamela. </td><td> hidrogéis de poliacrilamida macios são fáceis de danificar. </td><td> Observamos diminuição de rendimento hidrogel de fabricação (~ 50%) para o mais macio (ou seja, 4 kPa) hidrogéis em particular. Lidar com hidrogéis suave e aumentar o número de partida para alcançar o rendimento desejado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Fabricação de matrizes. </td><td rowspan="2"> morfologia local pobre ou inconsistente. </td><td> função umidificador inconsistente. </td><td> Verifique se umidificador e reï¿½etro um funcional ao longo de cada tiragem e manter 65% RH. </td></tr><tr><td> Pinos preso no cabeçote de impressão ou obstruçãoGED. </td><td> Limpar a cabeça de impressão para permitir o movimento do pino livre. pins limpar cuidadosamente antes ou depois de cada impressão para remover agregados de canais pinos. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cultura de Células e Execução de Ensaio. </td><td rowspan="2"> descolamento celular ou morte em matrizes após a fixação inicial. </td><td> Overseeding e proliferação excessiva. </td><td> Reduzir a densidade de sementeira inicial e tempo. Use &quot;manutenção&quot; ou mídia &quot;diferenciação&quot; durante a cultura matriz para reduzir a proliferação celular. </td></tr><tr><td> Liberação de monômero acrilamida tóxicos do hidrogel. </td><td> Soak hidrogeles em dH2O durante pelo menos 3 d para permitir a difusão / libertação de monómero de acrilamida e reduzir a toxicidade celular. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Células não anexar a matrizes. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentar a densidade de sementeira inicial e tempo. Use um tipo de célula mais fortemente aderente. </td></tr><tr><td> Pobre deposição dematriz ou condição biomolécula. </td><td> Pins limpas de partículas e agregados, confirmar parâmetros de impressão, e avaliar manchas de marcadores fluorescentes, por exemplo, dextrano rodamina conjugada. </td></tr><tr><td> A especificidade das interacções célula-matriz. </td><td> Diferentes tipos de células aderem especificamente para alguns, mas não outras proteínas de ECM. Testar várias proteínas ECM diferentes, com suas células. </td></tr><tr><td> matriz de armazenamento abaixo do ideal após a fabricação. </td><td> Recomendamos armazenar matrizes fabricadas durante a noite a 65% de umidade relativa e temperatura ambiente, em parte para evitar mudanças de fase durante o congelamento. A adesão celular é sensível a ambas humidade, temperatura, e tempo de armazenamento; certifique-se estes parâmetros são consistentes / otimizado para suas experiências. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Destacamento de hidrogel a partir de substrato de vidro durante a cultura de células. </td><td> Pobre limpeza slide e silanização. </td><td> Substitua soluções de trabalho para a limpeza de slides esilanização. </td></tr><tr><td> hidrogel Overdehydrated. </td><td> Não deixe hidrogéis de desidratação em uma chapa quente por mais de 15-30 min. </td></tr><tr><td> 4. Análise de Dados. </td><td> Alta variabilidade entre os pontos em duplicado e slides. </td><td> A variabilidade na fabricação matriz. </td><td> Verifique se os pinos e cabeçote de impressão estão limpos. Confirmar função do umidificador. Visualizar e quantificar local e matriz qualidade utilizando marcadores fluorescentes. matrizes loja como recomendado acima. </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Solução de problemas.

diferenciação celular é regulada por uma série de fatores do microambiente, incluindo ambas as propriedades da composição da matriz e material de substrato. Descrevemos aqui uma técnica utilizando microarrays de células em conjunto com microscopia de força de tracção para avaliar tanto a diferenciação de células e as interacções célula-substrato biomecânicas como uma função do contexto microambiental.

Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

O objetivo geral desta plataforma de microarranjo celular é correlacionar medições de diferenciação celular e forças de tração em função do contexto microambiental. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de engenharia de tecidos, permitindo tanto investigações básicas da biologia de células-tronco quanto a otimização de protocolos de diferenciação. As principais vantagens desta técnica incluem seu alto rendimento, capacidade de variar sinais bioquímicos e biomecânicos e leituras finais por imunofluorescência e microscopia de força de tração, ou TFM.Embora tenham utilizado este método, aqueles que compreendem a diferenciação de progenitores hepáticos poderão aplicá-lo facilmente a outros tipos celulares arteriais e contextos teciduais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o sucesso experimental depende da integração do protocolo de arranjo com substratos de hidrogel de alta qualidade e com a microscopia de força de tração. Para fabricar hidrogéis de poliacrilamida contendo microesferas fluorescentes em uma placa de Petri de fundo de vidro silanizado de 35 mm para avaliação em tempo real das interações célula-substrato utilizando TFM, primeiramente prepare os substratos de vidro em soluções conforme descrito no protocolo textual.Coloque as placas de Petri com fundo de vidro silanizado de 35 mm em uma bandeja de secagem de vidro e pipete 20 microlitros de solução de pré-polímero com esferas na proporção de 9 para 1 até o iniciador fotossensível no centro de cada placa. Cubra cuidadosamente cada placa com uma lamínula circular de 12 mm, evitando a formação de bolhas. Para distribuir as esferas fluorescentes à superfície do hidrogel, inverta as placas e deixe-as à temperatura ambiente por 20 minutos.Com o recipiente ainda invertido, exponha a placa à luz UVA de 365 nanômetros por 10 minutos. Otimize o tempo de polimerização conforme necessário. Em seguida, imerja os hidrogéis em tampão HEPES 1 molar e deixe-os à temperatura ambiente, no escuro, durante a noite.Remova as lamínulas cuidadosamente com uma lâmina, tomando cuidado para não danificar os hidrogéis polimerizados. Desidrate os hidrogéis a 50 graus Celsius em uma placa aquecedora até ficarem secos. Os hidrogéis podem ser armazenados à temperatura ambiente, no escuro, por até três meses.Prepare os tampões para imprimir as biomoléculas e para a placa de origem conforme descrito no protocolo textual. Após carregar os pinos limpos conforme descrito no protocolo textual, prepare o microarrayer e programe-o utilizando o software do fabricante. Em seguida, ligue a unidade umidificadora.Ajuste o ponto de referência para 65% de umidade relativa e aguarde até que o reômetro atinja o ponto de referência. Coloque a placa fonte no adaptador apropriado. Em seguida, coloque os substratos de hidrogel desidratados no adaptador apropriado.Ajuste os parâmetros do programa para refletir com precisão o layout da placa de origem, o design do arranjo e o formato desejado. Inicie a fabricação do arranjo. Verifique, com frequência não inferior a uma vez por hora, se a umidade não caiu abaixo de 65% de umidade relativa e se os pinos não estão entupidos.Se a umidade tiver caído inesperadamente, interrompa a montagem para encher o umidificador e limpar os tubos associados da condensação. Se os pinos estiverem entupidos, interrompa a montagem para limpar os pinos ou substituí-los por pinos pré-limpos. Quando o programa estiver concluído, coloque as matrizes fabricadas em uma caixa para lâminas ou em uma placa microtituladora coberta com papel alumínio.Deixe as matrizes em temperatura ambiente e 65% de umidade relativa durante a noite. Em nossa experiência, as dificuldades mais comuns estão relacionadas à fabricação das matrizes. Recomendamos confirmar a qualidade técnica e a robustez das matrizes fabricadas utilizando moléculas marcadas com fluorescência, corantes gerais para proteínas e imunofluorescência.No dia seguinte à fabricação, mergulhe as placas de Petri de 35 mm com os arranjos em 3 mL de penicilina-estreptomicina a 1% volume por volume em PVS. Exponha os substratos dispostos em UVC por 30 minutos. Em seguida, substitua a solução de penicilina-estreptomicina por meio de cultura celular.Após coletar e contar as células, semeie-as em arranjos a 3 mL por placa de Petri de 35 mm. Incube as culturas em arranjos a 37 graus Celsius e 5%CO2 por duas a 24 horas, ou até a formação de ilhas celulares bem povoadas. A densidade de semeadura e o tempo podem ser ajustados conforme o tipo celular e a aplicação específica.Após permitir a formação de ilhas celulares, lave as culturas do arranjo duas vezes com 3 mL de meio de cultura celular pré-aquecido. Neste ponto, os controles apropriados e os tratamentos de interesse podem ser adicionados ao sistema biológico. Troque o meio dos arranjos a cada um ou dois dias para manter a concentração de quaisquer tratamentos.De um a cinco dias após o início dos cultivos em matriz, realize uma avaliação em tempo real das interações entre células e substrato utilizando a MTF. Transfira as placas de Petri de 35 mm contendo os cultivos em matriz para um microscópio invertido com fluorescência e câmara de temperatura controlada, equipado com estágio robótico para medições de MTF. Em uma placa, marque as posições e os planos de foco de ilhas individuais de células utilizando microscopia de contraste de fase.Altere para microscopia fluorescente em vermelho distante para visualizar as microesferas. Em seguida, retorne a cada uma das posições salvas na etapa anterior e corrija a coordenada z do plano de foco, de modo que apenas a primeira camada de microesferas abaixo da ilha celular esteja em foco. Salve as novas coordenadas e prossiga para a aquisição automatizada de imagens de todas as ilhas celulares, capturando as imagens de contraste de fase e fluorescentes em vermelho distante da fase pré-dissociação.Em seguida, adicione cuidadosamente 150 microlitros da solução de BSA/SDS à placa e aguarde cinco minutos para permitir a dissociação completa das células do substrato. Monitore a dissociação celular utilizando microscopia de contraste de fase. Após as ilhas celulares terem sido dissociadas do substrato, retorne às posições marcadas e verifique se a primeira camada de microesferas ainda está em foco.Se essas microesferas estiverem fora do plano devido à deformação induzida pela tração gerada pelas células, corrija a coordenada z do plano focalizado para que elas voltem a estar em foco. Salve as coordenadas z corrigidas e repita a aquisição automatizada de imagens de todas as ilhas para capturar as imagens fluorescentes vermelhas distantes pós-dissociação. Repita esses passos para as lâminas restantes.Ligantes da notcha conjugados com proteína A/G, jagged um e delta like um, demonstraram retenção melhorada em hidrogéis. A apresentação dos ligantes da notcha também induziu a diferenciação de progenitores hepáticos rumo a um destino de célula de ducto biliar, conforme indicado pela presença do marcador verde de células de ducto biliar. A resposta aos ligantes da notcha foi quantificada para cinco proteínas da matriz extracelular, ou ECM, e mostrou que a resposta dos progenitores hepáticos aos ligantes depende do contexto da ECM.A inativação por RNA de pequeno cabelo foi utilizada para gerar progenitores sem os ligantes semelhantes à delta um e jagged um. Em seguida, as células foram expostas aos ligantes notch jagged um, semelhante à delta um e semelhante à delta quatro. A resposta ao ligante notch disposto em matriz variou conforme a expressão intrínseca à célula de qualquer um dos ligantes.Essas imagens mostram a diferenciação de progenitores hepáticos dependente tanto da rigidez do substrato quanto da composição da matriz extracelular (ECM). A análise quantitativa revelou que o colágeno IV favorece a diferenciação em substratos macios e rígidos, enquanto a fibronectina só suporta a diferenciação em substratos rígidos. Mapas térmicos representativos sugerem que a tensão de tração sustentada em baixa rigidez do substrato com colágeno IV promove a diferenciação em células de ducto biliar.Essa descoberta foi confirmada pela quantificação dos valores médios quadráticos médios das tensões de tração. Este vídeo e o protocolo acompanhante forneceram as etapas principais para a fabricação de hidrogéis e matrizes para realização de cultivo celular em substratos em matriz e para medir as interações célula-substrato utilizando microscopia de força de tração. Após familiarizar-se com as técnicas, cada experimento pode ser concluído em apenas uma a duas semanas, se realizado corretamente.Em contraste com este método, culturas celulares devem ser utilizadas para validar condições de matriz com alto desempenho por meio de PCR qualitativa, eletroforese imunológica, eixos de mecanobiologia em escala padrão ou outras técnicas complementares de biologia molecular. Esta plataforma versátil pode ser aplicada na investigação de alto rendimento de funções celulares em um amplo número de contextos celulares e teciduais, incluindo diferenciação de células-tronco e biologia de células cancerígenas.

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