Um de alta capacidade: Plataforma celular Microarray para Análise correlativa da diferenciação celular e forças de tração

O objetivo geral desta plataforma de microarray celular é correlacionar as medições da diferenciação celular e das forças de tração em função do contexto microambiental. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia de tecidos, permitindo investigações fundamentais da biologia de células-tronco e otimização de protocolos de diferenciação. As principais vantagens dessa técnica incluem seu rendimento, capacidade de variar pistas bioquímicas e biofísicas e leituras de endpoint por microscopia imunofluorescente e de força de tração, ou TFM.

Embora tenham usado esses métodos, aqueles que entendem a diferenciação do progenitor hepático podem ser prontamente aplicados a outros tipos de células arteriais e contextos de tecidos. A demonstração visual desse método é crítica, pois o sucesso experimental depende da integração do protocolo de arranjo com substratos de hidrogel de alta qualidade e microscopia de força de tração. Para fabricar esferas fluorescentes contendo hidrogéis de poliacrilamida em uma placa de Petri com fundo de vidro silanizada de 35 mm para avaliação ao vivo das interações do substrato celular usando TFM, primeiro prepare substratos de vidro em soluções conforme descrito no protocolo de texto.

Coloque placas de Petri com fundo de vidro de 35 mm silanizadas em uma bandeja de secagem de vidro e pipete 20 microlitros de grânulo de pré-polímero 9 para 1 na solução do fotoiniciador no centro de cada prato. Cubra delicadamente cada prato com uma lamínula circular de 12 mm, evitando a criação de bolhas. Para distribuir as esferas fluorescentes na superfície do hidrogel, inverta a louça e deixe-a em temperatura ambiente por 20 minutos.

Ainda invertido, expor a placa a 365 nanômetros UVA por 10 minutos. Otimize o tempo de polimerização conforme necessário. Em seguida, mergulhe os hidrogéis em tampão HEPES de 1 molar e deixe-os em temperatura ambiente no escuro durante a noite.

Remova as lamínulas cuidadosamente com uma navalha, tomando cuidado para não danificar os hidrogéis polimerizados. Desidrate os hidrogéis a 50 graus Celsius em uma placa quente até secar. Os hidrogéis podem ser armazenados em temperatura ambiente no escuro por três meses.

Preparar tampões para imprimir as biomoléculas e para a placa de origem, conforme descrito no protocolo de texto. Depois de carregar os pinos limpos conforme descrito no protocolo de texto, prepare o microarrayer e programe-o usando o software do fabricante. Em seguida, ligue a unidade umidificadora.

Ajuste o ponto de ajuste para 65% de umidade relativa e espere até que o reômetro corresponda ao ponto de ajuste. Coloque a placa de origem no adaptador apropriado. Em seguida, coloque os substratos de hidrogel desidratados no adaptador apropriado.

Ajuste os parâmetros do programa para refletir com precisão o layout da placa de origem, o design da matriz e o formato desejado. Inicie a fabricação da matriz. Verifique com frequência não inferior a uma vez por hora se a umidade não caiu abaixo de 65% de umidade relativa e se os pinos não estão entupidos.

Se a umidade cair inesperadamente, faça uma pausa para encher o umidificador e limpar os tubos de condensação associados. Se os pinos estiverem entupidos, pause a matriz para limpá-los ou substitua-os por pinos pré-limpos. Quando o programa estiver concluído, coloque as matrizes fabricadas em uma caixa de slides ou microplaca coberta com papel alumínio.

Deixe as matrizes em temperatura ambiente a 65% de umidade relativa durante a noite. Em nossa experiência, as dificuldades mais comuns estão relacionadas à fabricação de matrizes. Recomendamos confirmar a qualidade técnica e a robustez das matrizes fabricadas usando moléculas marcadas com fluorescência, corantes gerais de proteínas e imunofluorescentes.

No dia seguinte à fabricação, mergulhe as placas de Petri de 35 mm em 3 mL de penicilina-estreptomicina a 1% volume por volume em PVS. Exponha os substratos dispostos em UVC por 30 minutos. Em seguida, troque a solução de penicilina-estreptomicina por meios de cultura de células.

Depois de coletar e contar as células, semeie as células em matrizes a 3 mL por placa de Petri de 35 mm. Incube as culturas de matriz a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por duas a 24 horas ou até a formação de ilhas de células bem povoadas. A densidade e o tempo de semeadura podem ser ajustados dependendo das células e da aplicação específica.

Depois de permitir a formação de ilhas de células, lave as culturas de matriz duas vezes com 3 mL de meio de cultura de células pré-aquecido. Neste ponto, os controles e tratamentos apropriados de interesse podem ser adicionados ao sistema biológico. Troque a mídia das matrizes a cada um ou dois dias para manter a concentração de quaisquer tratamentos.

Dentro de um a cinco dias após o início das culturas de matriz, realize uma avaliação ao vivo das interações do substrato celular usando o TFM. Mova as placas de Petri de 35 mm contendo culturas de matriz para um microscópio fluorescente invertido incubado com uma platina robótica para medições de TFM. Em um prato, marque as posições e os planos de foco de ilhas de células individuais usando microscopia de contraste de fase.

Mude para microscopia fluorescente vermelha distante para visualizar as contas. Em seguida, retorne a cada uma das posições salvas na etapa anterior e corrija a coordenada z do plano de foco, de modo que apenas a primeira camada de contas abaixo da ilha celular esteja em foco. Salve as novas coordenadas e prossiga para a geração de imagens automatizadas de todas as ilhas de células para capturar o contraste da fase de pré-dissociação e as imagens fluorescentes vermelhas distantes.

Em seguida, adicione cuidadosamente 150 microlitros de solução BSA/SDS ao prato e aguarde cinco minutos para permitir a dissociação celular completa do substrato. Monitore a dissociação celular usando microscopia de contraste de fase. Depois que as ilhas celulares forem dissociadas do substrato, retorne às posições marcadas e verifique se a primeira camada de contas ainda está em foco.

Se essas contas estiverem fora do plano devido à deformação induzida pela tração gerada pela célula, corrija a coordenada z do plano focalizado para que fiquem novamente em foco. Salve as coordenadas z corrigidas e repita a imagem automatizada de todas as ilhas para capturar as imagens fluorescentes vermelhas distantes pós-dissociação. Repita essas etapas para os pratos restantes.

Os ligantes de entalhe conjugados com proteína A / G recortaram um e delta como um mostraram melhor retenção em hidrogéis. A apresentação do ligante notch também impulsionou a diferenciação dos progenitores hepáticos em direção a um destino de células do ducto biliar, conforme indicado pela presença do marcador verde de células do ducto biliar. A resposta aos ligantes notch foi quantificada para cinco proteínas de matriz extracelular, ou MEC, e mostrou que a resposta dos progenitores hepáticos aos ligantes depende do contexto da MEC.

Pequenos knockdowns de RNA em grampo de cabelo foram utilizados para gerar progenitores sem os ligantes delta como um e um irregular. As células foram então apresentadas com os ligantes de entalhe irregulares um e delta como um e delta como quatro. A resposta ao ligante de entalhe arranjado variou dependendo da expressão intrínseca da célula de qualquer ligante.

Essas imagens mostram a diferenciação dos progenitores hepáticos como dependente da rigidez do substrato e da composição da MEC. A análise quantitativa revelou que o colágeno quatro suporta a diferenciação em substratos macios e rígidos, enquanto a fibronectina suporta apenas a diferenciação em substratos rígidos. Mapas de calor representativos sugerem que o estresse de tração sustentado com baixa rigidez do substrato no colágeno quatro promove a diferenciação em células do ducto biliar.

Esse achado foi confirmado pela quantificação dos valores médios da raiz quadrada média da tensão de tração. Este vídeo e o protocolo que o acompanha forneceram as principais etapas para a fabricação de hidrogéis e matrizes, para a realização de cultura de células nos substratos dispostos e para a medição das interações do substrato celular usando microscopia de força de tração. Depois de se familiarizar com as técnicas, cada experimento pode ser concluído em menos de uma a duas semanas, se realizado corretamente.

Em contração com este método, as culturas de células devem ser usadas para validar condições de matriz de alta pontuação usando PCR qualitativo, immunoblotting, eixos de mecanobiologia em escala padrão ou outras técnicas complementares de biologia molecular. Esta plataforma versátil pode ser aplicada para a investigação de alto rendimento das funções celulares em um amplo número de contextos celulares e teciduais, incluindo diferenciação de células-tronco e biologia de células cancerígenas.