Name: Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intracardíaca guiada por ultrassom de células-tronco mesenquimais humanas em modelo murino de doença de Crohn. Este método melhora o direcionamento celular ao intestino inflamado com alta taxa de sucesso e mínima mortalidade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maneesh Dave é suportado pelo departamento de defesa grant PR141774 e o Crohn e a colite Foundation of America carreira desenvolvimento Award. O laboratório de Fabio Cominelli é suportado pelo NIH concede DK042191 (FC), DK055812 (FC), DK091222 (F.C.) e DK07948 (FC). O laboratório de Arnold Caplan é suportado em parte pela David L. e E. Virginia Baldwin Foundation. Agências de fomento não tinham qualquer papel no estudo de análise ou escrita do manuscrito. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores.

todos os procedimentos no estudo e experimentos de ratos foram aprovados pela Case Western Reserve University &#39; s institucionais Cuidado Animal e Comissão de utilização. Os procedimentos foram realizados em associação para avaliação e acreditação dos cuidados com animais de laboratório (AAALAC) credenciado facilidade. O BM foi aspirado sob um protocolo aprovado Conselho de revisão institucional hospitais Universidade na instalação de núcleo de células-tronco na Case Western Reserve University, após consentimento informado.
 1. cultura e derivado de transdução da medula óssea humana células-tronco mesenquimais (hMSCs) Nota: O isolamento de hMSCs é descrito detalhadamente em anteriores Publicações 15 , 20.
<ol><li>Cultura isolada hMSCs em Dulbecco &#39; suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) glicose (DMEM-LG) s Eagle modificado médio-baixo. Cultura de células em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2 em T175 frascos com 25 mL de meio de crescimento. Substitua o médio a cada 3-4 dias. No dia 14, execute a passagem principal do hMSCs.
	<ol><li>Quando as células alcançar 80% de confluência, remover completamente o meio velho e lave delicadamente as células com 5 mL de tampão fosfato salina (PBS; para frascos de cultura de tecidos de 75 cm).</li>
		<li>Remover a PBS do recipiente e adicionar 4 mL de ácido de 0,25% do trypsin-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Lugar o frasco de volta na incubadora a 37 ° C durante 5-10 min. manter o tempo de exposição mais breve possível.</li>
		<li>Quando a maioria das células se tornaram bem-arredondado ou ter retirado o prato de cultura, pare a reação adicionando um volume de soro bovino bezerro igual a metade do volume de tripsina.</li>
		<li>Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de tamanho adequado. Centrifugar as células a 400 x g por 5 min e em seguida, Retire cuidadosamente o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em 5 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS) e contar as células com um hemocytometer. 
		Nota: Neste momento, as células podem ser repicagem ou transfectadas com triplo repórter.</li>
	</ol></li> <li>Executar a transdução de hMSCs com repórter triplo.
	<ol><li>Células semente 1.5 x 10 6 um T175 balão. Cultura de células em 25 mL de meio de crescimento em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Esperar 24 h para as células anexar.</li>
		<li>Fazer um vírus cocktail em tubos de 15 mL, conforme descrito na referência 18.
		<ol><li>Lentivirus de degelo a 37 ° C em uma água de banho. Adicione 160 µ l de uma solução de sulfato de proteamine 5 mg/mL em Dulbecco &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) a 8 mL de meio de cultura (DMEM-LG + 10% FBS) para uma concentração final de 100 µ g/mL. Vórtice de 3 s. Adicione uma multiplicidade de vírus de infecção (MOI) de 5 (1º vez descongelado) .</li>
		</ol></li> <li>Remover o meio do frasco de cultura celular (passo 1.2.1) e adicionar o coquetel de vírus para as células. Incubar durante 10 h a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 4 mL de sulfato de proteamine 100 µ g/mL em 4 mL de DMEM-LG + 10% FBS e incube por um adicional h. 14</li>
	<li>Parar a transdução após 24 h, substituindo com 25 mL de meio (DMEM-LG + 10% FBS).</li>
	<li>Eficiência de transdução confirmar através da avaliação da expressão de mRFP por citometria de fluxo 18. 
	Nota: Aqui, hMSCs que foram transfectadas com mais de 65%, utilizaram-se eficiência.</li>
	<li>Expandir as células, substituindo com 25 mL de meio fresco (DMEM-LG + 10% FBS) duas vezes por semana. Cultura de células em 37 ° C, 95%, umidade e 5% de CO 2. Passagem de células após atingirem 80% confluência.</li>
	<li>Uma vez que o número de células desejado for atingido, executar tripsinização por etapas 1.1.2 - 1.1.4.</li>
	<li>Contar as células e suspendê-las em PBS estéril (1x) na concentração final de 1 x 10 6 células/75 µ l. manter as células no gelo para o transporte para a máquina de ultra-som. Para experiências, usar hMSCs de passagem os números 2-5.</li>
</ol> 2. Guiada por ultra-som intracardíaco injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo Nota: uso SAMP1/YitFc com estabelecido pequeno-intestinal inflamação e idade e gênero-correspondência AKR/J ratos para as experiências. Manter os ratos SAMP e AKR condições específicas isentos de organismos patogénicos, alimentá-los chow padrão de laboratório e mantê-los em ciclos de 12 h claro/escuro. Aqui, as injeções cardíacas guiada por ultra-som foram realizadas em uma sala de ultrassom isentos de organismos patogénicos cardíaco dedicado localizada na unidade de pesquisa animal da CWRU que foi desinfectada com um desinfectante e lavada com álcool a 70%. Laboratório pesquisa pessoal deve usar equipamento de protecção pessoal, incluindo vestidos, máscaras com escudos de olho e luvas estéreis durante as injeções intracardíacos. O calor do corpo do mouse deve ser mantido para a duração do processo.
<ol><li>Configurar o ultra-som sistema de imagem antes de anestesiar o mouse. Para este protocolo, use a máquina de ultra-som projetada para ecocardiograma de rato.
	<ol><li>Girar sobre o poder e inicializar o transdutor (30 MHz) para configurar o novo estudo.</li>
	</ol></li> <li>Anestesiar o mouse em uma câmara de indução usando 3-4% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de 0,2 - 0,5 L/min manter o animal para todo o processo com 2% de isoflurano em 100% de oxigênio através de um cone de nariz. Confirmar anesthetization apropriado antes de executar a imagem latente por beliscar o dedo do pé, rolando o mouse e observar a ausência de movimento. 
	Nota: Pomada oftálmica deve ser aplicada aos olhos após a indução da anestesia para evitar a secura da córnea. Transferi os ratos anestesiados para as máquinas de imagem (ou seja, o sistema de imageamento bioluminescência e ultra-som), onde receberão uma dose de manutenção de isoflurano anestésico. Determinar a anestesia começar a altura e a profundidade da anestesia, observando a falta de reação à pitadas na cauda e pé almofada a cada 10 min para toda a duração da anestesia.</li>
	<li>Definir a temperatura do gel tabela e ultra-som de imagem a 37 ° C.</li>
	<li>Remover completamente a pele sobre a área do tórax do mouse anestesiado usando o creme depilatório.</li>
	<li>Coloque o mouse em cima da mesa da imagem latente em posição supina e fixar ambos os membros superiores e inferiores com fita adesiva para evitar o movimento do corpo durante o procedimento. Usar um monitor de eletrocardiograma durante o procedimento para todos os mouses.</li>
	<li>Limpar a pele da área do tórax, usando um cotonete de iodopovidona/10% seguido de um cotonete de etanol 70%. Aplicar uma camada espessa de gel para a área do tórax do mouse.</li>
	<li>Montar o transdutor no suporte e ajustar sua posição até o ventrículo esquerdo é claramente visível no campo de visão.</li>
	<li>Carga 150 µ l de suspensão de células hMSC transduzidas (2 x 10 6 hMSCs em 150 µ l de PBS estéril) em uma seringa de 1 mL com uma 28-G agulha e fixar a seringa no suporte apropriado. Para visualizar o sangue pulsante, manter uma coluna de ar pequena na seringa. Para evitar a aglutinação, suspender as células antes da injeção.</li>
	<li>Avançar a seringa no sentido do tórax do mouse, ajustar a trajetória da agulha usando a orientação de ultra-som e introduza o ventrículo esquerdo.</li>
	<li>Seguindo a orientação da imagem do ultra-som, penetrar a agulha da seringa através do espaço intercostal e no ventrículo esquerdo do mouse. 
	Nota: Ponta de agulha da seringa deve ser claramente visível no ventrículo esquerdo na imagem ultra-sonográficos. O posicionamento adequado deve ser confirmado ainda mais pela saída de sangue arterial fresco para a seringa. Estes são sinais de uma bem sucedida inserção.</li>
	<li>Injetar a suspensão de células de hMSC muito lentamente mais de 2 min, aplicando suave pressure.</li>
	<li>Após a injeção de células suspensas, delicadamente, retirar a agulha, limpe o gel de ultra-som e solte o mouse das restrições fita.</li>
	<li>Colocar o animal em uma gaiola nova e limpa com uma almofada pré-aquecido. 
	Nota: Após a conclusão do procedimento, um ambiente quente deve ser fornecido aos ratos até se recuperar. Aquecimento excessivo deve ser evitado, desde que a vasodilatação periférica compromete a recuperação. Os ratos devem ser acompanhados de perto e isolados de outros ratos até sua recuperação total, indicada pela sua capacidade de manter a prostração esternal.</li>
	<li>Monitorar o animal até que eles alcancem a completa recuperação da anestesia e diariamente até o final do experimento.</li>
</ol> 3. Imagens de bioluminescência (BLI) de hMSCs <ol><li>imagem os ratos 24 h após a injeção intracardíaca no sistema de imagem a bioluminescência. Inicie o na vivo software de imagem. Inicializar o sistema de imagem e abrir um novo estudo.
	<ol><li>No painel de controle, defina os parâmetros de imagem clicando &#34; sequência instalação. &#34; no modo de imagem, selecione &#34; luminescência &#34; e &#34; fotografia. &#34; definir os tempos de exposição de 0,5 s a 10 min. definir o binning para &#34; médio &#34; e a F / Para de &#34; 1. &#34; definir o filtro de excitação &#34; bloco &#34; e o filtro de emissão para &#34; aberto. &#34; definir o campo de visão &#34; C &#34; para dois ratos. Adicionar a configuração de sequência para o assistente de imagem clicando no painel de controle de aquisição.</li>
	</ol></li> <li>Ligue a bomba de oxigênio e o conjunto do isoflurano para 2,5% em câmara de indução e o cone de nariz dentro da máquina.</li>
	<li>Injetar o i.p. de rato com 300 µ l de D-luciferina (12,5 mg/mL).</li>
	<li>Colocar o mouse na câmara de indução de anestesia.
	<ol><li>Após 2-3 min, transferir o mouse para o na vivo de imagens de câmara, com a cabeça do cone de nariz no colector de anestesia. Aplica a pomada óptica para proteger os olhos durante a imagem latente. Para vários mouses de imagem, use o defletor de luz negra para evitar a reflexão da luz em ratos adjacentes.</li>
	</ol></li> <li>Clique o &#34; adquirir &#34; o botão para iniciar a aquisição de imagem 10 min após a injeção de luciferina-D.</li>
	<li>Repita os passos 3.3-3.5 para imagem mais ratos.</li>
	<li>Após a aquisição imagem na vivo, eutanásia os ratos por inalação de CO 2 seguida por deslocamento cervical, para confirmar a morte. Efectuar a análise ex vivo.
	<ol><li>Se a análise ex vivo é executada Depois de 20 min, repetir a injeção de luciferina (passo 3.3) antes de sacrificar os ratos; o sinal BLI pode diminuir 20 min após a injeção de luciferina.</li>
	</ol></li> <li>Dissecar os ratos para remover o aparelho todo gastrointestinal (i.e., do estômago para o reto), linfonodos mesentéricos (MLN), pulmões, baço e fígado. Colocá-los em placas de Petri usando pinças e tesouras de 2 , 4.</li>
	<li>Coloque a placa de Petri contendo os órgãos explantados na câmara de imagens e adquirir imagens BLI por etapas 3.1-3.6.</li>
	<li>Após a aquisição da imagem, transferir os órgãos explantados para moldes de amostra contendo ideal da temperatura de corte (OCT) composto. Cryofreeze os moldes a-80 ° C, usando gelo seco. Executar a imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-luciferase seções congeladas para confirmar a presença de hMSCs 16.</li>
	<li>Para a quantificação da intensidade de luz, use a região da ferramenta de interesse (ROI) na ferramenta paleta 16 , 19. Selecione o quadro ROI e movê-lo para a região de interesse na imagem. Clique &#34; medição de ROI &#34; e salvar os dados no formato de arquivo SEQ. Exportar os dados como um arquivo. txt e usar software estatístico para realizar testes estatísticos básicos para quantificação 16.</li>
</ol>

<ol><li>Duijvestein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+interferon-gamma+enhances+the+therapeutic+activity+of+mesenchymal+stromal+cells+in+animal+models+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with interferon-gamma enhances the therapeutic activity of mesenchymal stromal cells in animal models of colitis.</a> Stem Cells. 29 (10), 1549-1558 (2011).</li>
<li>Sala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cells+Reduce+Colitis+in+Mice+via+Release+of+TSG6%2C+Independently+of+Their+Localization+to+the+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cells Reduce Colitis in Mice via Release of TSG6, Independently of Their Localization to the Intestine.</a> Gastroenterology. 149 (1), 163-176 (2015).</li>
<li>Gonzalez, M. A., Gonzalez-Rey, E., Rico, L., Buscher, D., Delgado, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+by+inhibiting+inflammatory+and+autoimmune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses.</a> Gastroenterology. 136 (3), 978-989 (2009).</li>
<li>Dave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+murine+interstitial+cells+of+cajal+suppress+cellular+immunity+and+colitis+via+prostaglandin+e2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells for murine interstitial cells of cajal suppress cellular immunity and colitis via prostaglandin e2 secretion.</a> Gastroenterology. 148 (5), 978-990 (2015).</li>
<li>Manieri, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosally+transplanted+mesenchymal+stem+cells+stimulate+intestinal+healing+by+promoting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis.</a> J. Clin. Invest. 125 (9), 3606-3618 (2015).</li>
<li>Kontoyiannis, D., Pasparakis, M., Pizarro, T. T., Cominelli, F., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+on%2Foff+regulation+of+TNF+biosynthesis+in+mice+lacking+TNF+AU-rich+elements%3A+implications+for+joint+and+gut-associated+immunopathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-rich elements: implications for joint and gut-associated immunopathologies.</a> Immunity. 10 (3), 387-398 (1999).</li>
<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra0804647">Inflammatory bowel disease.</a> N. Engl. J. Med. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li>
<li>Dave, M., Papadakis, K. A., Faubion, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+inflammatory+bowel+disease+and+molecular+targets+for+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol.+Clin.+North+Am%22%5BJournal%5D)">Immunology of inflammatory bowel disease and molecular targets for biologics.</a> Gastroenterol. Clin. North Am. 43 (3), 405-424 (2014).</li>
<li>Dave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell+Therapy+for+Inflammatory+Bowel+Disease%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell Therapy for Inflammatory Bowel Disease: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 21 (11), 2696-2707 (2015).</li>
<li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+%28Cx601%29+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn%27s+disease%3A+a+phase+3+randomised%2C+double-blind+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), (2016).</li>
<li>Lee, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+hMSCs+improve+myocardial+infarction+in+mice+because+cells+embolized+in+lung+are+activated+to+secrete+the+anti-inflammatory+protein+TSG-6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6.</a> Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).</li>
<li>Gao, J., Dennis, J. E., Muzic, R. F., Lundberg, M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+in+vivo+distribution+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+after+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion.</a> Cells Tissues Organs. 169 (1), 12-20 (2001).</li>
<li>English, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mesenchymal+stromal+cell+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation.</a> Immunol Cell Biol. 91 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Pizarro, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAMP1%2FYitFc+mouse+strain%3A+a+spontaneous+model+of+Crohn%27s+disease-like+ileitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">SAMP1/YitFc mouse strain: a spontaneous model of Crohn's disease-like ileitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 17 (12), 2566-2584 (2011).</li>
<li>Lennon, D. P., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Isolation of human marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Exp. Hematol. 34 (11), 1604-1605 (2006).</li>
<li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+transplantation+and+long-term+engraftment+of+intra-arterially+delivered+clonally+derived+mesenchymal+stem+cells+to+injured+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow.</a> Mol. Ther. 22 (1), 160-168 (2014).</li>
<li>Dennis, J. E., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+ceramic+vehicles+for+rat-marrow-derived+%28Rattus+norvegicus%29+osteogenic+cell+delivery%3A+effects+of+pre-treatment+with+fibronectin+or+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Implantol%22%5BJournal%5D)">Porous ceramic vehicles for rat-marrow-derived (Rattus norvegicus) osteogenic cell delivery: effects of pre-treatment with fibronectin or laminin.</a> J. Oral Implantol. 19 (2), 106-115 (1993).</li>
<li>Lin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+lentiviral+transduction+of+human+mesenchymal+stem+cells+that+preserves+proliferation+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient lentiviral transduction of human mesenchymal stem cells that preserves proliferation and differentiation capabilities.</a> Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 886-897 (2012).</li>
<li>Love, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mesenchymal+stem+cell+transplant+by+bioluminescence+and+PET%5BTitle%5D)+AND+%22PET.+J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging of mesenchymal stem cell transplant by bioluminescence and PET.</a> PET. J. Nucl. Med. 48 (12), 2011-2020 (2007).</li>
<li>Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cells+with+osteogenic+potential+from+human+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow.</a> Bone. 13 (1), 81-88 (1992).</li>
<li>Ishizaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+cell+transplantation+provides+timing-dependent+cell+distribution+and+functional+recovery+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial cell transplantation provides timing-dependent cell distribution and functional recovery after stroke.</a> Stroke. 44 (3), 720-726 (2013).</li>
<li>Schenk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+chemotactic+protein-3+is+a+myocardial+mesenchymal+stem+cell+homing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Monocyte chemotactic protein-3 is a myocardial mesenchymal stem cell homing factor.</a> Stem Cells. 25 (1), 245-251 (2007).</li>
<li>Hayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+implantation+of+mesenchymal+stem+cells+has+beneficial+effects+on+healing+of+experimental+colitis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Topical implantation of mesenchymal stem cells has beneficial effects on healing of experimental colitis in rats.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 326 (2), 523-531 (2008).</li>
<li>Kodani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+colonoscopy+in+mice+to+evaluate+the+severity+of+colitis+and+colorectal+tumors+using+a+validated+endoscopic+scoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system.</a> J. Vis. Exp. (80), e50843(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este estudo descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em um modelo do CD experimental rato pequeno-intestinal. Esta técnica tem muito alta taxa de sobrevivência e de sucesso, como a trajetória da agulha pode ser ajustada com base em imagens de alta resolução, em tempo real do ventrículo esquerdo do mouse, fornecida pelo ultra-som. A vantagem da entrega para o ventrículo esquerdo é que hMSCs são então distribuídos intra arterially e ignorar a circulação venosa, evitando assim a a...

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e intestino e é pensada para resultar de uma resposta inadequada do sistema imunológico do host para micróbios intestinais7,8. Estudos recentes têm mostrado que murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) podem suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal1,3,4,5. Existem vários ensaios clínicos em curso que usam MSCs humanas derivadas da medula óssea ou tecido adiposo para tratar pacientes com doença inflamatória intestinal (IBD), que inclui CD9. Duas rotas para a terapia MSC têm sido utilizadas nestes ensaios clínicos: uma envolve a infusão sistêmica (ou seja, por via intravenosa) de MSCs para IBD luminal (incluindo CD) e o outro envolve a aplicação/injeção localizada de células-tronco na fístula trato de pacientes com CD perianal. Em uma recente meta-análise da terapia MSC para IBD, sistêmica (ou seja, por via venosa) terapia MSC para IBD luminal (incluindo CD) foi eficaz em até 40% (95% CI: 7-79%) dos pacientes, Considerando que a eficácia era muito maior, em 61% (95% CI: 36-85%), quando os MSCs foram injetados localmente os doentes de fístula CD9. Um multicêntrico III fase recente randomizado placebo controlado de células-tronco adiposas alogênico injetado diretamente a fístula perianal de CD pacientes mostrou estatisticamente significativa evidência clínica e radiológica de fístula perianal, cura, corroborando os achados da meta-análise10. As razões para a baixa eficácia da terapia MSC administrada por via intravenosa para CD luminal foi investigado inadequadamente, mas uma razão pode ser a orientação inadequada do MSCs para o local da inflamação. Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que apenas uma pequena percentagem de MSCs (1-5%) injetada por via intravenosa alcançar o cólon inflamado; os MSCs restantes são filtrados pelos pulmões (efeito de primeira passagem)1,2 ,5,11,12. Vários estudos murino, portanto, tem usado a via intraperitoneal (i.p.) para administração de MSC em modelos animais de colite4. No entanto, eles também têm demonstrado que somente uma pequena fração das células alcançar e engraft do cólon e que a eficácia é relacionado com a secreção de fatores solúveis parácrina, como a proteína do gene fator de necrose tumoral-inducible 6 (TSG-6)2. O mecanismo MSC de imunossupressão e cura envolve uma abordagem de várias frentes que envolve parácrina; fatores de proximidade-independente de célula, como TSG-6; e celular fatores dependentes de proximidade, como programado morte-ligante 1 (PD-L1); ou 1 irregulares. Portanto, localização de MSC para o site da inflamação pode resultar em maior eficácia9,13. De fato, um estudo recente mostrou que MSCs implantados diretamente no local da lesão do cólon resultaram na cura através da secreção de promover a angiogênese vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Por outro lado, observou-se um efeito de cura mínimo após injeção intravenosa5. Para aumentar a sua localização para o site da inflamação (ou seja, o intestino delgado em ratos SAMP), foi desenvolvida esta técnica de Injeção intracardíaca guiada por ultra-som para administração de MSC no ventrículo esquerdo. Guiada por imagem injeção garante uma injeção exata, o que leva a uma maior taxa de sucesso e a diminuição da morbidade e mortalidade. Além disso, a injeção de MSCs no ventrículo esquerdo distribui-las para circulação arterial, onde eles podem alcançar o intestino inflamado antes de tornar-se preso nos pulmões.
Neste estudo, MSCs derivadas da medula óssea humanas (hMSCs) foram usados para injeção no modelo murino de CD14SAMP-1/YitFc (SAMP). Totem é um modelo murino espontâneo bem caracterizado de inflamação crônica que se desenvolve a inflamação intestinal-pequeno com cerca de 100% de penetrância14. A inflamação se desenvolve em resposta a microflora na ausência de qualquer manipulação genética, química ou imunológica e muito semelhante à humana CD11. Sexo e idade-correspondente livre de inflamação AKR/J (AKR) ratos, os ratos de controlo parental da SAMP, foram utilizados neste estudo.
Os hMSCs foram isoladas e expandidas em laboratório de amostras de medula óssea (BM) obtidos de doadores normais, não identificados, após consentimento informado usando validado e publicado anteriormente protocolos15,16. Após isolamento e expansão, a capacidade MSC em osteogênica, adipogenic, e chondrogenic diferenciação foi avaliada em laboratório por vários ensaios15. Realizou-se o ensaio funcional osteogênico implantando cubos de cerâmicos da matriz de fosfato tricálcico/hidroxiapatita contendo hMSCs por via subcutânea em imunocomprometidos de ratos SCID CB17-Prkdc17. O ensaio de cubo demonstra a osteogênese e condrogênese potencial e é considerado o último teste de avaliação individual de preparações de MSC17. Para visualizar hMSCs na vivo após a injeção, lentivirus foi usado para transduce hMSCs com construção de gene repórter triplo que consiste de luciferase de vaga-lume (fl), proteína monomérica fluorescente vermelha (mRFP) e herpes simplex vírus timidina quinase (ttk ), impulsionado por um vírus (mnd) de sarcoma mieloproliferativa modificados promotor18. A luciferase de vaga-lume no repórter triplo é uma enzima que luciferina injetado coverts para oxyluciferin em hMSCs e produz fótons/luz branca. Isso é detectado pela câmera sensível dispositivo de carga acoplada (CCD) (bioluminescência) em um na vivo óptico de imagem de sistema, que permite a visualização de hMSCs ao vivo em ratos. Bioluminescência imaging (BLI) é uma técnica sensível que pode ser usada em série para controlar as células e para análise ex vivo . O uso de um promotor forte mnd conduz a expressão contínua da construção de gene de fusão tripla repórter e permite a imagem latente de hMSCs injetado por mais de 16 semanas19. Os hMSCs são difíceis de transduce e ter um rendimento baixo transdução. Usando um protocolo otimizado, a eficiência de transdução de hMSCs foi melhorada e a expressão do transgene foi reforçada18. Usando a expressão de mRFP (um dos genes repórter triplo) na citometria de fluxo, demonstrou-se a capacidade de transduce hMSCs com uma alta eficiência de até 83%. Ensaios de diferenciação e na vivo o cubo ensaios demonstraram a capacidade do transduzidas hMSCs de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos17.

<table><tbody><tr><td>DMEM-LG&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-091</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Proteamine</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P4020-1G</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Goldbio</td><td>luck-500</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bobine</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cutlure de tecido de 175 cm</td><td>Corning</td><td>431080</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cutlure de tecido de 75 cm</td><td>Corning</td><td>430720</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga</td><td>Crysalgen</td><td>23-2265</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tissue-Plus O.C.T. Fisher</td><td>HealthCare</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold Standard</td><td>Tissue-Tek&nbsp;</td>Sistema de Embalagem de Expressão de HIV <td>Lenti-Pac 4557</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GeneCopoeia</td><td>HPK-LvTR-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Ionidine swabs</td><td>Medline</td><td>MDS093901</td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação</td><td>Nair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal Helathcare&nbsp;</td><td>NDC 66794 013 25</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação (Wagner)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Wagner 14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Pomada veterinária</td><td>Puralube NDC</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic 100 gel de transmissão de ultrassom</td><td>Parker laboratories</td><td>01 08</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>camundongos</td> <td>SAMPCentro de Pesquisa de Doenças Digestivas de Cleveland</td> Camundongos AKR Centro de Pesquisa de Doenças Digestivas de Cleveland Sistema de imagem Vevo 770 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Visual Sonics, Toronto, Canadá</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sistema da série de espectro IVIS&nbsp;</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem vivo&nbsp;</td><td>CaliperLifeSciences, PerkinElmer, Waltham, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Repórter triplo</td><td>Gentilmente cedido pelo Dr. Zheng-Hong Lee, CWRU, (citação 19)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias experimental

Ultrasound-guided Intracardiac Injection of Human Mesenchymal Stem Cells to Increase Homing to the Intestine for Use in Murine Models of Experimental Inflammatory Bowel Diseases

A doença de Crohn (CD) é uma doença inflamatória crônica comum do pequeno e o intestino. Murino e humanas tronco células mesenquimais (MSCs) têm potencial imunossupressor e foram mostradas para suprimir a inflamação em modelos do rato de inflamação intestinal, mesmo que a via de administração pode limitar sua homing e eficácia 1 , 3 , 4 , 5. aplicação local de MSCs para modelos de lesão do cólon tem demonstrado maior eficácia em atenuar a inflamação no cólon. No entanto, há escassez de dados sobre técnicas para melhorar a localização do MSCs de derivados da medula óssea humanas (hMSCs) para o intestino delgado, o local da inflamação no modelo da doença de Crohn experimental SAMP-1/YitFc (SAMP). Este trabalho descreve uma técnica nova para a injeção intracardíaca guiada por ultra-som de hMSCs em camundongos SAMP, um modelo bem caracterizado espontâneo de inflamação intestinal crônica. Sexo e idade-correspondência, livre de inflamação AKR/J (AKR) os ratos foram usados como controles. Para analisar a biodistribuição e a localização, hMSCs foram transfectadas com um lentivirus contendo um repórter triplo. O repórter triplo consistia de luciferase de vaga-lume (fl), para a imagem latente bioluminescente; proteína monomérica vermelha fluorescente (mrfp), para a classificação de célula; e truncado herpes simplex vírus timidina quinase (ttk), para tratamento de imagens de tomografia por emissão de pósitrons (PET). Os resultados deste estudo mostram que 24 h após a administração intracardíaca, hMSCs localizar-se no intestino delgado de ratos SAMP ao invés de ratos AKR livre de inflamação. Neste romance, guiada por ultra-som de injeção de hMSCs no ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma elevada taxa de sucesso de entrega de celular, permitindo a recuperação rápida de ratos com mínima morbidade e mortalidade. Esta técnica pode ser um método útil para a localização avançada do MSCs em outros modelos de inflamação intestinal-pequeno, como TNFΔRE6. Estudos futuros determinará se a localização de aumentada do hMSCs pela entrega intra-arterial pode levar à maior eficácia terapêutica.

A Figura 1 mostra que a hMSCs pode ser transfectadas com o repórter triplo com uma alta eficiência, preservando suas propriedades de célula-tronco. Transduzidas hMSCs podem ser visualizadas em tempo real por BLI (Figura 1, Figura 3). Neste romance, guiada por ultra-som injeção de hMSCs para o ventrículo esquerdo de ratos SAMP garante uma taxa de sucesso muito alta de injeção, permitindo a recuperação...

Murino estudos em modelos de inflamação do cólon têm demonstrado que uma pequena porcentagem (1-5%) de células-tronco mesenquimais (MSC) injetada por via intravenosa ou intraperitonealmente home ao cólon inflamado1,2. Este estudo mostra que guiada por ultra-som intracardíacos injeções de MSCs resultam em aumentada localização até o intestino.

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

Crohn&#39;s disease (CD) is a common chronic inflammatory disease of the small and large intestines. Murine and human mesenchymal stem cells (MSCs) have ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a injeção intracardíaca guiada por ultrassom de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana, ou HMSC, em um modelo murino de doença de Crohn experimental, a fim de observar a migração direcionada (homing) das HMSC para o intestino. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças inflamatórias intestinais, especialmente sobre a necessidade de aumentar a localização das HMSC no intestino delgado durante a inflamação. A principal vantagem desta técnica é que ela facilita uma alta taxa de sucesso na entrega das HMSC, com mobilidade e mortalidade mínimas nos camundongos.De modo geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque múltiplas variáveis podem afetar o resultado do procedimento, exigindo grande compreensão da biologia das células-tronco mesenquimais humanas por parte do trainee. O procedimento será demonstrado por Paola Menghini, pós-doutoranda do nosso laboratório.Em uma instalação livre de patógenos específicos, configure o protocolo do sistema de imagem por ultrassonografia ecocardiográfica em camundongos e inicialize o transdutor de 30 megahertz. Em seguida, confi

ultrasound-guided-intracardiac-injection-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

Injeção intramiocárdica percutânea guiada por ecocardiografia representa uma modalidade eficiente, confiável e targetable para a entrega de agentes de transferência de genes ou células no coração murino. Seguindo os passos descritos neste protocolo, o operador pode rapidamente tornar-se competente nessa técnica versátil, minimamente invasiva.

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

Buscamos estabelecer um modelo suíno de insuficiência cardíaca induzido pelo bloqueio da artéria circunflexo esquerda e ritmo rápido para testar o efeito e a segurança da administração intramiocárdia de células-tronco para terapias baseadas em células.

Estabelecendo um modelo suíno de insuficiência cardíaca pós-miocárdio para tratamento de células-tronco

As células-hastes são continuamente investigadas como tratamentos potenciais para indivíduos com danos do miocárdio, no entanto, sua diminuição da viabilidade e retenção dentro do tecido lesionado pode afetar sua eficácia a longo prazo. Neste manuscrito descrevemos um método alternativo para a entrega de células-tronco em um modelo murino de lesão de reperfusão de isquemia.

Entrega intramiocárdica atrasada de células-tronco após lesão de reperfusão de Isquemia em um modelo murino

A terapia baseada em células-tronco emergiu como uma estratégia eficiente para reparar tecidos cardíacos feridos após o infarto do miocárdio. Fornecemos uma aplicação in vivo ideal para transplante de células-tronco usando hidrogéis de gelatina que são capazes de ser enzimaticamente intercessos.

Transplante intramial de hidrogéis injetáveis de carregamento de MSC após infarto do miocárdio em um modelo murino

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos 

Este artigo apresenta um protocolo para a entrega precisa guiada por ultrassom de células-tronco vasculares à parede do vaso aórtico. A técnica atinge efetivamente a parede do vaso e promove o reparo vascular em aneurismas e dissecções da aorta.

Entrega de células-tronco guiadas por ultrassom de precisão para reparo vascular em doenças da aorta

Este artigo detalha um protocolo otimizado para injeções intramiocárdicas guiadas por ecocardiografia em modelos de infarto do miocárdio em ratos usando uma agulha de 29 G x 88 mm. Essa técnica garante a administração robusta, precisa e reprodutível de agentes terapêuticos diretamente na zona peri-infarto.

Injeção guiada por ecocardiografia para entrega de células-tronco intramiocárdicas direcionadas e confiáveis em um modelo de infarto do miocárdio em ratos

Aprenda a técnica de injeção intracardíaca guiada por ultrassom de células-tronco mesenquimais humanas em modelo murino de doença de Crohn. Este método melhora o direcionamento celular ao intestino inflamado com alta taxa de sucesso e mínima mortalidade.

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental (Vídeo) | JoVE Journal

Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

Explorar mais vídeos