Guiada por ultra-som intracardíaca injeção de células-tronco mesenquimais humanas para aumentar Homing para o intestino para uso em modelos murino de doenças intestinais inflamatórias Experimental

O objetivo geral deste procedimento é usar células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana intracardíaca guiadas por ultrassom ou injeção de HMSC em um modelo de camundongo da doença de Crohn experimental, para observar o homing do HMSC ao intestino. Este método pode ajudar a responder às principais questões no campo da doença inflamatória intestinal, sobre a necessidade de aumentar a localização do HMSC no intestino delgado durante a inflamação. A principal vantagem dessa técnica é que ela facilita uma alta taxa de sucesso de entrega de HMSC com mobilidade e mortalidade mínimas do camundongo.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter problemas porque várias variáveis podem afetar o resultado do procedimento. Exigindo muita compreensão do estagiário da biologia das células-tronco mesenquimais humanas. Demonstrando os procedimentos estará Paola Menghini, pós-doutoranda do nosso laboratório.

Em uma instalação específica livre de patógenos, configure o protocolo do sistema de imagem de ultrassom do ecocardiograma do camundongo e inicialize o transdutor de 30 megahertz. Em seguida, confirme o nível apropriado de sedação beliscando o dedo do pé e aplique pomada nos olhos do animal. Use creme depilatório para remover os pelos sobre o tórax e coloque o animal na mesa de imagem de 37 graus Celsius em decúbito dorsal.

Prenda os membros com fita adesiva para evitar movimentos durante o procedimento e desinfete a pele exposta do tórax com iodo povidona a 10% e etanol a 70%. Aplique uma camada espessa de gel de ultrassom de 37 graus Celsius na pele e monte o transdutor no suporte, ajustando a posição do transdutor até que o ventrículo esquerdo fique claramente visível no campo de visão. Em seguida, ressuspenda suavemente 2 x 10 para as sextas células-tronco mesenquimais humanas transduzidas em 150 microlitros de PBS estéril para gerar uma suspensão celular homogênea e carregue as células em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 28.

Injete menos de 150 microlitros de suspensão celular por camundongo para evitar sobrecarga de volume e morte. Prenda a seringa em um suporte de seringa. Em seguida, avance a seringa em direção ao tórax do camundongo usando a orientação por ultrassom para ajustar a trajetória da agulha conforme necessário e penetrar a ponta da agulha através do espaço intercostal até o ventrículo esquerdo.

A visualização adequada da agulha na imagem ultrassonográfica é fundamental para garantir uma trajetória e inserção adequadas da agulha no ventrículo esquerdo, uma injeção bem-sucedida e evitar amortecimento cardíaco e morte. A ponta deve ser claramente visível dentro do ventrículo esquerdo e a colocação adequada pode ser confirmada pelo fluxo de sangue arterial fresco para a seringa. Aplique uma leve pressão no êmbolo para injetar lentamente a suspensão HMSC por um período de dois minutos.

Quando todas as células tiverem sido injetadas, retire suavemente a agulha e coloque o animal em uma gaiola limpa em uma almofada pré-aquecida com monitoramento até a recuperação total. 24 horas após a injeção, inicialize o sistema de imagem de bioluminescência e abra um novo estudo no software de imagem in vivo. Para definir os parâmetros de imagem no painel de controle, clique na configuração de sequência.

No modo de imagem, selecione luminescente e fotografia. Defina os tempos de exposição de 0,5 segundos a 10 minutos, o lance para médio e o f/stop para um. Defina o filtro de excitação para bloquear, o filtro de emissão para abrir e o campo de view para ver para dois mouses.

Em seguida, clique no painel de controle de aquisição para adicionar a sequência configurada ao assistente de imagem. Em seguida, injete no primeiro camundongo 300 microlitros de d-luciferina. Aplique pomada nos olhos dos animais e transfira o camundongo para a câmara de imagem in vivo.

10 minutos após a injeção de D-luciferina, clique em Adquirir para iniciar a aquisição da imagem. Depois que todos os camundongos forem fotografados, colha todo o trato gastrointestinal, gânglios linfáticos mesentéricos, pulmões, baço e fígado de cada animal. Em seguida, imagine os órgãos como acabamos de demonstrar, para imagens de bioluminescência de animais inteiros.

O HMSC pode ser transduzido com o repórter triplo com alta eficiência, preservando as propriedades das células-tronco e permitindo sua visualização em tempo real por imagens de bioluminescência. A análise ex-vivo das células-tronco intracardíacas liberadas confirma que essa raiz de administração facilita o retorno do HMSC ao intestino delgado inflamado dos camundongos experimentais com doença de Crohn. O HMSC é injetado em animais de controle e livres de inflamação, no entanto, não se acumulam no intestino delgado.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em menos de 15 minutos por mouse, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar a imagem do ultrassom para ajustar a trajetória da agulha. Uma técnica inadequada e uma trajetória incorreta podem levar ao tamponamento cardíaco por derrame pericárdico hemorrágico e morte.

Após este procedimento, outros métodos, como histologia e microscopia de estúdio 3D, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, por exemplo, um aumento do retorno do HMSC ao intestino delgado aumenta essa eficácia terapêutica. Essa técnica permitirá que pesquisadores no campo da DII experimental explorem todos os seus modelos de camundongos, como a trajetória do TNF, que podem ser injetados com HMSCs para melhorar o retorno ao intestino delgado. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a injeção intracardíaca guiada por ultrassom de HMSC em camundongos e de como usar imagens bioluminescentes para analisar uma má distribuição e homing.

Não se esqueça de que trabalhar com MSCs humanas pode ser perigoso e que precauções como o uso de luvas e máscara facial com proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.