Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

NARRADOR O objetivo geral deste método é gerar com eficiência grandes quantidades de esferóides celulares robustos por agregação celular para seu uso em uma variedade de ensaios baseados em células. A principal vantagem desta técnica é que utiliza uma matriz solúvel em água não proteica para agregação celular e formação de esferóides, o que permite um isolamento fácil e rápido dos esferoides. Este método pode ajudar a obter novos insights em biologia celular sobre os efeitos das interações célula-célula e célula/matriz no crescimento do tecido em um microambiente tridimensional.

NARRADOR Antes de preparar os agregados, aqueça 50 mililitros de água ultrapura a 80 graus Celsius e adicione 10 gramas de pó de metilcelulose. Agite a suspensão até que as partículas estejam uniformemente dispersas. Em seguida, adicione água fria ultrapura a um volume final de 100 mililitros e armazene as partículas durante a noite a 4 graus Celsius até que a solução fique clara e cor de palha, sem sólidos visíveis.

Passe a solução por um filtro de 0,45 micrômetros para remover quaisquer fragmentos não dissolvidos e dilua 1:5 miligramas por mililitro da solução filtrada no meio de cultura apropriado. Em seguida, filtre o meio suplementado com metilcelulose através de um filtro de 0,22 micrômetro. Em seguida, em um gabinete de biossegurança, lave uma subcultura de 70% de confluência com PBS e conecte as células com três mililitros de tampão de associação tripsina-EDTA em uma incubadora de cultura de células.

Após alguns minutos, inspecione as células sob um microscópio óptico com uma ampliação de 10x. Quando as células forem retiradas da placa, neutralize a reação com sete mililitros de meio de cultura suplementado com soro. Transferir a solução celular para um novo tubo de 15 mililitros e, em seguida, recolher as células libertadas por centrifugação.

A causa mais comum de uma formação de esferóides malsucedida, além de partículas contaminantes, é o uso de concentrações abaixo do ideal de metilcelulose ou soro para a agregação e crescimento de sua linhagem celular específica. NARRADOR - Usando uma micropipeta P1000 com uma ponta de filtro, triture o palete três a cinco vezes com um mililitro do meio de formação esferóide, pressionando a ponta da pipeta contra o fundo do tubo em um pequeno ângulo, enquanto pipeta lentamente sem expelir todo o conteúdo da ponta para cortar o pellet. Após a contagem, dilua a suspensão celular para uma concentração de uma vez 10 elevado ao quarto de células por mililitro e enxágue um reservatório de pipeta multicanal estéril com água ultrapura filtrada para remover qualquer poeira e fibras.

Dispense as células no reservatório e use pontas de filtro para transferir 100 microlitros das células para cada poço de uma placa repelente de células de fundo em U de 96 poços, misturando a suspensão celular periodicamente para evitar que as células se assentem no fundo do reservatório. Quando todas as células estiverem assentadas, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos e inspecione os poços diariamente quanto à formação de esferoides. As células devem se depositar no fundo de cada poço dentro de seis horas e geralmente se agregar em um esferóide dentro de 24 a 48 horas.

Para confirmar a formação de um esferóide bem-sucedido, use uma ponta P10 sob um microscópio óptico para pipetar suavemente o meio sobre o esferoide. Os esferóides devidamente formados se soltarão da placa e rolarão, confirmando sua estrutura 3-D. Para incorporar os esferoides no colágeno, use pipetagem reversa para revestir uniformemente o fundo de cada poço de uma lâmina de câmara de cultura de tecidos de oito poços com um mínimo de 50 microlitros de colágeno neutralizado por poço.

Quando todos os poços estiverem cobertos, coloque a lâmina da câmara em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros cheia de água ultrapura em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e incube a placa de cultura de tecidos de 10 centímetros a 37 graus Celsius por cerca de uma hora. Quando o colágeno estiver polimerizado, use uma ponta de filtro P1000 para transferir cuidadosamente os esferoides pré-formados para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. É fundamental que as camadas de base de colágeno sejam incubadas até que estejam completamente polimerizadas para evitar perturbar o colágeno ao adicionar os esferoides ou o meio.

Narrador Colete os esferóides colhidos em uma microcentrífuga de mesa e use uma pipeta P200 para remover os sobrenadantes, absorvendo qualquer excesso de sobrenadante por inversão de tubo em uma toalha de papel limpa, conforme necessário. Usando uma ponta de pipeta P200 de diâmetro largo, ressuspenda imediatamente os esferoides em 50 microlitros de colágeno neutralizado e transfira cuidadosamente as misturas de colágeno esferóide para cada poço da lâmina da câmara de cultura de tecidos de oito poços. Retorne a lâmina para a incubadora até que o colágeno seja polimerizado.

Após cerca de uma hora, adicione lentamente pelo menos 100 microlitros de meio de cultura aquecido contendo o tratamento apropriado de interesse para cada poço para outra incubação. Em seguida, use um microscópio de fluorescência para adquirir seções de imagens ópticas através dos esferóides invasores. Usando este protocolo, os esferóides podem ser gerados a partir de uma variedade de linhagens celulares.

Sob as condições apropriadas de tratamento com metilcelulose e soro, as células individuais se estabelecem e aderem juntas no centro do poço para formar esferóides com uma aderência mínima ao fundo do poço. Algumas linhagens celulares são capazes de aderir a placas repelentes de células na ausência ou em baixas concentrações de metilcelulose, resultando na formação de um esferóide cercado por uma monocamada celular. Em geral, concentrações mais altas de metilcelulose impedem que as células adiram ao poço.

Mas uma concentração muito alta de metilcelulose reduz a adesão célula a célula e impede que as células se estabeleçam no fundo do poço, resultando na formação de agregados soltos e numerosos esferóides satélites. Os esferoides embebidos em colágeno podem ser tratados com um quimioatraente para induzir a invasão de células individuais do esferóide para a matriz circundante. Os esferoides fixados embebidos em colágeno podem ser visualizados por microscopia de campo claro para quantificar a distância e o número de células invasoras, ou por microscopia de imunofluorescência para visualizar as estruturas invasivas formadas pelas células migratórias.

É importante dar tempo suficiente para que as células se agreguem em esferoides estruturalmente sólidos que sejam robustos o suficiente para sua manipulação sem fragmentação e que possam ser facilmente coletados para uso em ensaios subsequentes. Nosso protocolo de crescimento celular pode ser adaptado para vários ensaios de biologia celular. Por exemplo, assentar as células em meios suplementados com altas concentrações de metilcelulose pode ser usado para avaliar a resistência celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar esferoides celulares tridimensionais por agregação, o que será uma ferramenta valiosa para muitas aplicações de biologia celular.