Name: Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Aprenda a produzir esferoides celulares 3D por agregação usando metilcelulose, uma matriz não proteica solúvel em água. Este método versátil permite isolamento rápido e aplicações em ensaios de migração e invasão celular.

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Os autores agradecem a M. Gordon, do Centro de Imagens Biomédicas da Queen's University, pela assistência. Este trabalho foi apoiado por bolsas operacionais da Sociedade de Pesquisa do Câncer do Canadá (19439) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (MOP-142303) (LMM), e por Bolsas de Pós-Graduação de Ontário e bolsas de estudo do Programa de Treinamento do Instituto de Pesquisa Terry Fox em Pesquisa Transdisciplinar do Câncer (SMM, EYL), e por uma Bolsa de Verão do Júri Craig (SMM).

<ol><li>Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+vs.+three-dimensional+in+vitro+tumor+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays.</a> Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).</li>
<li>Albini, A., Noonan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27chemoinvasion%27+assay%2C+25+years+and+still+going+strong%3A+the+use+of+reconstituted+basement+membranes+to+study+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+for+tissue+engineering+and+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. (51), (2011).</li>
<li>Handschel, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+of+micromass+culture+technology+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Prospects of micromass culture technology in tissue engineering.</a> Head Face Med. 3, 4(2007).</li>
<li>Stuckhoff, A. P., DelValle, L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781627036399">Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology</a>. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).</li>
<li>Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylcellulose+protects+the+ability+of+anchorage-dependent+cells+to+adhere+following+isolation+and+holding+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension.</a> Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biol. 10, 29(2012).</li>
<li>Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+of+breast+cancer+cells%3A+How+to+go+three-dimensional%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional.</a> Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC 8, 9 para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes animais, MC é inerte, nã...

Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e célula-célula que contribuem para o crescimento de tecido de tumor ou 1, 2, 3. O uso de esferóides multicelulares é uma abordagem recente que reproduz de forma mais precisa a arquitectura compacta de crescimento celular in vivo em 1,4. Os esferóides podem ser utilizados para investigar interacções célula-matriz de células normais, mas também podem actuar como análogos de tumor para modelar as características de progressão tumoral, tais como o crescimento metastático ou resistência a drogas 4. Os esferóides podem ser formados pela proliferação de células individuais embebidas numa matriz de 5, ou mais rapidamente, através da promoção da agregação de várias células de modo a formar um conjunto único de células (por exemplo, gota em suspensão, os métodos de centrifugação) 6, 7. técnicas de agregação de células existentes pode exigir materiais caros ou equipamento especializado. Além disso, estes esferóides possuem uma vasta gama de tamanhos e morfologias e pode ser difícil de produzir em grandes quantidades, tornando a comparação entre condições de crescimento ou tratamentos difíceis. Finalmente, esferóides gerados por estes métodos podem ser difíceis de isolar a partir do extracel proteicolular matriz em que se encontram inseridas para utilização em outras aplicações. Aqui, nós descrevemos um método de agregação celular robusta e facilmente controlável para a rápida formação de esferóides de células dimensionados de forma consistente utilizando placas disponíveis comercialmente de fundo em U de células-repelente e uma matriz de promoção de adesão inerte, celulose de metilo. Uma vez formados, estes esferóides multicelulares são prontamente isolados para utilização numa vasta gama de aplicações. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides através da proliferação de células, o que pode ser utilizado para avaliar outros processos celulares. Aqui, mostramos ensaios de invasão celular, quantificados pela técnica de imunofluorescência, e um ensaio anoikis, como exemplos de aplicações destes dois protocolos de formação esferóide diferentes.

<table><tbody><tr><td><forte>Buffers</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Fosfato tamponado salina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>Usado para PBS+ tampão de lavagem; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de cálcio</td></tr><tr><td>Solução de cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Usado para tampão de lavagem PBS+; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de magnésio</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Para formação de esferoides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well Placa repelente de células com fundo em U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td>Para cultura de linhas celulares SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1</td></tr><tr><td>F12K Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2112722</td><td>Para cultura de linha celular TT</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Filtro Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td>antes de usar para remover contaminantes particulados</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>Prepare em água a 100 mg / mL</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Para cultura de linhas celulares HCT-116, BxPC-3</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td>Tampão de dissociação</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>For Invasion Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Type I Collagen</td><td>Corning Incorporated</td><td>354231</td><td>Stock 3,1 mg/mL; Mantenha no gelo quando em uso</td></tr><tr><td>DMEM Vermelho Fenol Livre Baixa Glicose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054-20</td><td>Menos fluorescência de fundo em comparação com o meio suplementado com Vermelho de Fenol</td></tr><tr><td>Fator Neurotrófico Derivado da Linha de Células Gliais</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Quimioatrativo</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Para Microscopia de Imunofluorescência</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1.5</td><td>Microscopia Eletrônica</td> de Lamínula Sciences <td>72225-01</td><td>Para montagem de esferoides excisados</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Usado para corar actina a 1:200</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino Bioshop</td><td>Canada Incorporated</td><td>ALB001</td><td>Usado em tampão de bloqueio BSA</td></tr><tr><td>Dabco 33-LV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>290734</td><td>Antifade</td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>GLY001</td><td>Usado no meio de montagem MOWIOL</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Freeware, NIH-Usado</td><td></td> <td>para análise de imagem&nbsp;</td></tr><tr><td>Microslides</td><td>VWR International</td><td>48312-024</td><td>Para montagem de esferoides excisados</td></tr><tr><td>MOWIOL 4-88</td><td>EMD-Millipore</td><td>475904</td><td>Usado no meio de montagem MOWIOL</td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>EMD-Millipore</td><td>PX0055-3</td><td>Usado no tampão de fixação</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bioshop Canada Incorporated</td><td>TRX777</td><td>Usado no tampão de permeabilização</td></tr></tbody></table>

um método celular agregação eficiente e flexível para 3d spheroid produção

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis ​​de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.

Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B). Titulação de ...

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

NARRADOR O objetivo geral deste método é gerar de forma eficiente grandes quantidades de esferoides celulares robustos por agregação celular, para utilização em uma variedade de ensaios baseados em células. A principal vantagem desta técnica é o uso de uma matriz solúvel em água não proteica para agregação celular e formação de esferoides, o que permite um isolamento fácil e rápido dos esferoides. Este método pode ajudar a obter novas perspectivas em biologia celular sobre os efeitos das interações célula-célula e célula/matriz no crescimento tecidual em um microambiente tridimensional.NARRADOR Antes de preparar os agregados, aqueça 50 mililitros de água ultrapura a 80 graus Celsius e adicione 10 gramas de pó de metilcelulose. Agite a suspensão até que as partículas sejam uniformemente dispersas. Em seguida, adicione água ultrapura fria até um volume final de 100 mililitros e armazene as partículas durante a noite a 4 graus Celsius até que a solução fique transparente e com cor amarelada, sem sólidos visíveis.Passe a solução através de um filtro de 0,45 micrômetro para remover quaisquer fragmentos não dissolvidos e dilua na proporção de 1:5 miligramas por mililitro da solução filtr

an-efficient-flexible-cell-aggregation-method-for-3d-spheroid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um método simples e rápida de gerar tecido 3D-como esferóides e sua potencial aplicação para quantificar as diferenças de interações célula-célula.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Os esferoides são um tipo de modelo de cultura de células 3D usado para representar com mais precisão o ambiente de uma célula em comparação com os modelos de monocamada de cultura de células 2D. No protocolo de exemplo, veremos os cientistas gerarem esferóides a partir de uma linha de células de câncer colorretal e aplicarem imagens de células vivas para rastrear o crescimento dos esferoides.

Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Plataforma lab-on-a-CD para geração de esferóides tridimensionais multicelulares

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Este protocolo detalha um método para a produção de três tipos diferentes de esferoides de uma maneira que os torna adequados para triagem e análise de alto conteúdo em larga escala. Além disso, são apresentados exemplos mostrando como eles podem ser analisados nos níveis esferoide e células individuais.

Um método robusto para a produção em larga escala de spheroids para aplicativos de triagem e análise de alto conteúdo

O presente protocolo descreve uma técnica para produzir esferoides de tecido em larga escala de forma econômica usando um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D.

Geração de esferoides de tecido por meio de um dispositivo semelhante a um selo impresso em 3D

Apresentamos um protocolo para o cultivo de esferoides de alta reprodutibilidade e sua caracterização fenotípica usando captura de imagens e proteômica.

Análise Fenotípica Semi-Automatizada de Culturas Funcionais de Células Esferoides 3D

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Os esferoides celulares têm sido considerados um modelo potencial no campo das aplicações biológicas. Este artigo descreve protocolos para geração escalável de esferoides celulares usando um dispositivo de montagem acústica 3D, que fornece um método eficiente para a fabricação robusta e rápida de esferoides celulares uniformes.

Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

Aqui, descrevemos diferentes métodos de formação de esferóides multicelulares para realizar microscopia de células vivas multiparâmetros de acompanhamento. Usando microscopia de imagem de fluorescência (FLIM), autofluorescência celular, corantes de coloração e nanopartículas, é demonstrada a abordagem para análise do metabolismo celular, hipóxia e morte celular em câncer tridimensional (3D) vivo e esferoides derivados de células-tronco.

Produção e Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência de Células Vivas Multiparâmetros (FLIM) de Esferoides Multicelulares

Este estudo apresenta uma metodologia econômica e eficiente para gerar estruturas celulares 3D usando um sistema baseado em carimbos para criar micropoços em moldes de agarose. O sistema promove a formação de esferóides/organoides uniformes, melhorando assim as interações celulares. Essa abordagem reduz a variabilidade experimental e oferece suporte a aplicações em testes de medicamentos e engenharia de tecidos.

Geração de esferoides/organoides tridimensionais a partir de culturas de células bidimensionais usando um novo dispositivo de carimbo

Aprenda a produzir esferoides celulares 3D por agregação usando metilcelulose, uma matriz não proteica solúvel em água. Este método versátil permite isolamento rápido e aplicações em ensaios de migração e invasão celular.

Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

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