Geração de esferóides a partir de linhagens celulares: um método de cultura celular tridimensional (3D)

Cultive a linha celular desejada como uma monocamada 2D aderente. Remova o meio de cultura e lave com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Em seguida, adicione tripsina e incube enquanto as células se desprendem da superfície do frasco e se tornam redondas. Adicione meios frescos para neutralizar a tripsina e suspender as células. Transfira a mistura para um tubo cônico e use uma centrífuga para pellet as células.

Substitua o sobrenadante por meio novo e ressuspenda o pellet da célula. Use um hemocitômetro para contar o número de células e calcular uma concentração de trabalho. Em seguida, transfira a quantidade certa de mistura de células para uma placa de poço de adesão ultrabaixa de fundo redondo e incuba. As células se depositam no fundo e se agregam. Eles acabarão se ligando um ao outro e formarão um conjunto compacto de células 3D, o esferóide.

No protocolo de exemplo, veremos como gerar esferóides 3D a partir de uma linha celular de câncer de cólon e como a imagem ao vivo é aplicada para rastrear sua formação. Comece lavando a linha de células de câncer colorretal de interesse com cinco mililitros de PBS e removendo as células do fundo do frasco com 0,5 mililitros de tripsina por cinco minutos a 37 graus Celsius. Depois de confirmar o descolamento ao microscópio, neutralize a enzima de dissociação celular com 10 mililitros de meio completo e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio completo fresco para contagem e ressuspenda as células a uma concentração de 1,5 vezes 10 elevado ao terço de células por mililitro.

Em seguida, semeie 20 microlitros de células em cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços e coloque a placa em um aparelho de imagem automatizado dentro de uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de CO2 e 95% de umidade. Faça login no software de aquisição do aparelho e selecione Agendar para adquirir, Iniciar Adicionar embarcação, Digitalizar na programação e Criar embarcação, Novo. Em seguida, selecione Tipo de varredura, Esferóide e selecione os canais de campo claro e fluorescência apropriados de interesse. Defina a ampliação para 10 vezes e selecione o modelo da placa e sua posição na gaveta do aparelho de imagem. Selecione a posição dos poços a serem fotografados e insira a descrição do experimento, incluindo o nome, o tipo de células e o número de células.

Para a Configuração de análise, selecione Adiar análise até mais tarde, clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e selecione Definir intervalo do grupo de varredura selecionado e defina Adicionar varreduras a cada quatro horas e Para um total de 24 horas. Em seguida, defina a hora de início para pelo menos uma hora após a incubação no aparelho de imagem automatizado. Para verificar o progresso do crescimento do esferoide, a cada dois dias, faça login no software de imagem e selecione Exibir exames recentes. Clique duas vezes no experimento de interesse e selecione Campo claro no painel Canais de imagem. Em seguida, use a ferramenta Medir recursos de imagem para medir o diâmetro dos esferoides. Adicionando 50 microlitros de meio completo por poço no quarto dia para limitar qualquer meio de efeitos de aparição.