Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

O objetivo geral deste procedimento é isolar simultaneamente cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos viáveis do coração de ratos para suas análises individuais in vitro. Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo cardiovascular sobre os mecanismos de sinalização envolvidos na hipertrofia cardíaca, lesão de isquemia e reperfusão, função endotelial e fibrose cardíaca. A principal vantagem dessa técnica é que todas as principais células cardíacas podem ser isoladas simultaneamente, reduzindo potencialmente os custos de pesquisa associados e o número de animais experimentais.

Depois de uma descarga de água destilada e uma descarga de 50 mililitros de meio Powell, substitua o meio por 80 mililitros de meio Powell fresco e use uma pipeta de vidro Pasteur do cilindro de vidro para perfundir continuamente o meio com carbogênio. Em seguida, use dois pares de pinças curvas finas para montar um coração de rato recém-colhido através da aorta no sistema de perfusão de Langendorff e coloque a extremidade da cânula do sistema de perfusão entre o primeiro ramo aórtico e a válvula aórtica. Fixe a aorta com uma pinça de crocodilo.

Abra a válvula da cânula e, em seguida, fixe o coração com uma sutura cirúrgica. Deixe 35 mililitros do meio de perfusão passarem pela gota do coração, removendo qualquer sangue residual. Coloque o funil de coleta sob o coração e inicie a bomba peristáltica para recircular o meio de perfusão do funil de coleta para o reservatório.

Adicione a solução de colagenase ao meio de perfusão e perfunda o coração com a solução de colagenase recirculante por 30 minutos. No final da digestão, use uma tesoura para remover o coração do sistema Langendorff e coloque-o em uma placa de Petri de vidro. Agora remova os átrios e qualquer resto de tecido adiposo do coração.

Para evitar a contaminação das células epiteliais, use duas pinças para retirar cuidadosamente o pericárdio. Corte o coração ao meio e coloque as metades no picador de tecido. Pique o coração duas a três vezes e transfira os pedaços de tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo 12 mililitros de tampão de digestão da perfusão de Langendorff.

Digerir os fragmentos de tecido em banho-maria durante cinco a 10 minutos, misturando ocasionalmente com uma pipeta de plástico descartável de cinco mililitros. Em seguida, filtrar a suspensão celular através de uma peneira de 100 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o sistema de perfusão com um mínimo de um litro de água destilada seguido de 100 mililitros de hidróxido de sódio normal 0,1 por 30 minutos, depois lave o sistema com mais dois a três litros de água destilada e seque o aparelho com ar lavado.

Colete as células filtradas por centrifugação e use uma pipeta descartável para transferir cuidadosamente a célula endotelial e o sobrenadante contendo fibroblastos para um novo tubo de 50 mililitros. Ressuspenda o pellet em seis mililitros de solução de cálcio um. Após um minuto, recolher as células com uma segunda centrifugação e ressuspender o sedimento em seis mililitros de solução de cálcio dois.

Após um minuto, diluir a suspensão celular com a adição de 12 mililitros de solução de cálcio três e misturar bem inclinando-se suavemente. Após outra centrifugação, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de meio CCT pré-aquecido. Em seguida, alíquota de um mililitro de células para cada uma das 20 placas estéreis de cultura de células de 35 milímetros pré-revestidas com laminina e coloque as células em uma incubadora de cultura de células livre de dióxido de carbono, substituindo o meio por dois mililitros de meio CCT fresco para remover quaisquer células mortas após duas horas.

Agora centrifugue a célula endotelial e o fibroblasto contendo sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1,5 mililitros de tampão de isolamento de células endoteliais. Transfira as células para um tubo de amostra de dois mililitros e adicione o anticorpo CD31 anti-rato de camundongo às células para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius com rotação de ponta a ponta. No final da incubação, adicione grânulos IGG anti-rato Pan para uma incubação de 20 polegadas a quatro graus Celsius, com rotação de ponta a ponta.

No final da incubação do grânulo, coloque as células em um rack magnético por dois minutos e use uma pipeta de um mililitro para remover cuidadosamente o sobrenadante contendo principalmente fibroblastos. Veja os fibroblastos em uma placa de cultura de 10 centímetros contendo 10 mililitros de meio de cultura de células de fibroblastos e coloque as células em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem ao tubo de células endoteliais e tampe o tubo.

Agite suavemente as células quatro a cinco vezes para ressuspender as contas. Em seguida, retorne o tubo ao ímã e remova o tampão de lavagem após um minuto. Após a última lavagem, substitua o tampão de lavagem por um mililitro de meio de cultura de células endoteliais MV2 e semeie as células endoteliais em um único poço de uma placa de 12 poços, para sua cultura noturna na incubadora de cultura de células.

No final da incubação de fibroblastos, lave as células anexadas com um volume apropriado de PBS pré-aquecido duas a três vezes. Em seguida, adicione meio de cultura de células de fibroblastos frescos pré-aquecidos às células e devolva os fibroblastos à incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, substitua o sobrenadante na cultura de células endoteliais por meio de cultura de células endoteliais fresco e retorne as células à incubadora, substituindo o meio a cada dois ou três dias, até a semiconfluência.

Em seguida, lave a cultura de células de fibroblastos anexadas com PBS fresco pré-aquecido, como acabamos de demonstrar, e alimente as células com meio fresco pré-aquecido. O procedimento de isolamento de cardiomiócitos produz uma população de células cardíacas estriadas de 70 a 80% puras, viáveis, em forma de bastonete. A análise da oscilação intracelular do cálcio de cardiomiócitos isolados carregados com fura AM, em resposta à repurfusão de isquemia em cardiomiócitos, pode então ser realizada, bem como a análise das alterações na sinalização de cálcio em células endoteliais isoladas de esferas magnéticas e fibroblastos, após a adição de ATP.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de configurar este sistema de perfusão corretamente e fixar imediatamente o coração no sistema assim que estiver pronto. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da pesquisa cardiovascular explorarem a sinalização envolvida em diferentes fisiopatologias cardiovasculares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão dos princípios básicos do isolamento e cultura de células cardíacas. Não se esqueça de que trabalhar com instrumentos cirúrgicos e reagentes de cultura de células pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso cuidadoso dos instrumentos e o uso de luvas, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.