Name: Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a usar uma interface gráfica para rastrear dinamicamente a concentração de proteínas em filopódios celulares. Este método computacional permite analisar protrusões e localização proteica em células como neurônios, HeLa e COS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores reconhecem o financiamento do DFG (EXC-1003 a MG).

1. Cultura celular <ol><li> Cultura HeLa ou células COS no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose, L-alanina-L-glutamina dipeptídico, piruvato, 10% de soro bovino fetal e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Os neurônios culturais em meios culturais sem L-glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, suplementados com 0,5-diperptídeo L-alanina-L-glutamina, suplementos neuronais sem soro e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Uma vez que se alcança 40% de confluência, transfira células com construções de escolha usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transfectadas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 15-18 h. </li><li> Para reduzir as alterações no pH e na osmolaridade (devido à evaporação) durante a aquisição da imagem, encha as câmaras de cultura de células (antes da imagem) até 90% com meio pré aquecido a 37 ° C contendo 20% de 4- (2-hidroxietil) -1 -piperazino-etossulfónico (HEPES). SelarNa tampa, aplique uma fina camada de graxa de vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente sobre a câmara de cultura que contém as células transfectadas. </li></ol> 2. Aquisição de imagens NOTA: O comprimento do filopodia varia de 2-10 μm 13 . Filopodia cresce a uma velocidade média de 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 . <ol><li> Adquira imagens usando um microscópio com objetivo 60X ou 100X e sem binário de pixels (aqui, um microscópio confocal de disco giratório). Use taxas de aquisição superiores a 1 Hertz (Hz) para rastrear a dinâmica filopodial. Para minimizar os artefatos fora de foco, imagens filopodia perto da membrana basal ( ou seja , superfície do substrato). </li><li> Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser, de modo que a relação sinal / ruído (SNR) seja maior que 4. Evite a saturação de canais individuais ( ou seja, valores de pixels de255 para imagens de 8 bits e 65,535 para imagens de 16 bits), pois isso impedirá a análise de imagem subseqüente. </li><li> Para evitar o sangramento, use apenas etiquetas de fluorescência compatíveis com linhas laser e filtros do microscópio (para detalhes veja a referência 15 ). </li></ol> 3. Pré-processamento de imagem NOTA: Use ImageJ ou outro software disponível para pré-processar imagens 16 , 17 . <ol><li> Se a amostra estiver em movimento, corrija a deriva lateral usando o software disponível ( por exemplo, https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) antes da análise. Exclua filmes com deriva axial (ou seja, movimento em direção z). </li><li> Fundo correto ( ou seja, valores de cinza de áreas fora da célula), branqueamento ( ou seja, perda contínua, se a intensidade de fluorescência devido ao dano a proteínas de fluorescência) e possíveis cortes de sangramento ( ou seja, sinal de uma gripeSonda de orescência nos dois canais) usando o software disponível ( por exemplo, http://imagej.net/Category:Plugins e 16 , 17 ). Nota: as intensidades de fluorescência dos canais individuais não são alteradas pelo software. </li><li> Para garantir a análise de imagem subsequente, guarde os filmes correspondentes a canais específicos de proteínas em escala de cinza como formato de arquivo empilhado &#39;.tiff&#39; na pasta de trabalho. NOTA: As dimensões (tamanho, comprimento) das pilhas devem ser iguais para todos os canais. </li></ol> 4. Análise de imagem - Etapa 1: carregar imagens NOTA: O software descrito aqui foi escrito em Matlab (conhecido como software de programação) e será executado somente com este programa. <ol><li> Baixe a pasta compactada contendo todos os arquivos necessários para análise de imagens a partir do seguinte site: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwestamos/. Descompacte e copie arquivos na pasta de trabalho. </li><li> Uma vez instalado, abra o software de programação e execute &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. GUI Window # 1 irá abrir como mostrado na Figura 2A . </li><li> Carregue os arquivos &quot;.tiff&quot; empilhados salvos correspondentes a uma proteína específica de interesse na GUI Window # 1 usando os botões &lt;1b&gt; para a proteína A, &lt;1c&gt; para a proteína B, &lt;1d&gt; para a proteína C. Veja a Figura 2 e a Tabela 1 para detalhes. NOTA: A Proteína A mostrada na GUI A Janela # 1 atua como o canal de referência para a análise ratiométrica final. </li><li> Crie uma imagem superpuesta da célula a partir dos canais de proteína clicando em &lt;1a&gt;. </li><li> Clique em &lt;2a&gt; para atribuir o primeiro quadro e &lt;2b&gt; para o último quadro usado para análise. </li><li> Opcionalmente, coloque a região de interesse (ROI) contendo o filopodium de interesse usando o botão &lt;2h&gt;, gire a imagem.Toque o botão &lt;2i&gt; ou elimine regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho de mão livre &lt;2j&gt;. NOTA: Para simplificar a análise de imagens, recomenda-se isolar o ROI ( isto é , cortar, girar, excluir) juntamente com as outras etapas de pré-processamento (resta, correção de branqueamento, etc.) usando o ImageJ. </li><li> Mova o controle deslizante &lt;2c&gt; para cada quadro para controle de qualidade e verifique se o filopodium permanece claramente visível durante todo o filme. </li></ol> 5. Análise de imagem - Etapa 2: gerar rastreamento <ol><li> Clique no botão &lt;3a&gt; na Janela GUI # 1 para abrir a janela GUI # 2 (veja a Figura 2B ). </li><li> Clique no botão &lt;4&gt; na Janela GUI # 2 para gerar a máscara do corpo celular sobreposto (gerado na Janela GUI # 1 depois de clicar em &lt;1a&gt;). O programa também gera o limite da máscara, onde o casco convexo é implementado para obter os vértices. </li><li> CliBotão ck &lt;5&gt;; Um cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base (de onde a distância da ponta filopodial é medida) seguida pela ponta do filopodia no quadro onde aparece pela primeira vez. Para fazer isso, mova o controle deslizante na janela # 2). NOTA: Para minimizar erros na saída de dados, coloque o ponto base verticalmente abaixo da ponta filopodial ao longo do eixo. Posicionar o ponto base em outros locais ( por exemplo, deslocados lateralmente) pode introduzir uma polarização direcional em valores de fluorescência dentro do corpo da célula. </li><li> Selecione o comprimento do limiar (acima do qual o filopodia se dobrará) usando &lt;6c&gt;. Nota: Este comprimento é definido como a distância entre o ponto base (selecionado usando &lt;5&gt;) e o limite do corpo da célula ( ou seja, a região de onde o filopodia começa a crescer). A distância é medida é em pixels. </li><li> Especifique o número de segmentos usados ​​para aproximar a forma do filopodia na caixa &lt;6a&gt;. NOTA: o mO número mínimo de segmentos depende do comprimento máximo alcançado pelo filopodium, mas também como o filopodium se dobra. Não selecione um número de segmentos maiores do que o número de pixels entre a base e a ponta ( ou seja, o comprimento do limiar). Selecionando mais segmentos do que o limite definido na etapa 5.4. ( Ou seja, o número de pixels entre a base e a ponta) resultará em uma superestimação do comprimento do filopodium. </li><li> Especifique a largura da varredura, que atua como scanner horizontal para colocar os nós, em &lt;6b&gt;. NOTA: Estes nós são usados ​​pelo programa para ajustar a linha que une a base e a ponta com o corpo do filopodium ( ou seja, para criar a espinha dorsal). Como ponto de partida, coloque um valor em pixels igual ao comprimento máximo multiplicado por um fator de <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> Especifique o raio de varredura (em pixels) na caixa &lt;6d&gt;. Use um valor que é aproximadamente 50% maior do que o obServido deslocamento da ponta entre moldura. NOTA: Usar um raio de varredura muito grande pode pegar os pontos do casco convexo indesejados em quadros onde não existe uma dica filopodial real ( por exemplo , movimento fora do plano ou SNR baixo). </li><li> Especifique o ângulo de flexão na caixa &lt;6e&gt;. NOTA: O limiar de ângulo é determinado pelo ângulo máximo que o filopodium está dobrando durante toda a análise. Especificar o limite de ângulo ajuda o software a excluir o rastreamento de estruturas indesejadas que crescem do lado da filopodia quando o filopodia se dobra em direção ao corpo celular. O programa funciona de forma confiável para filopodia com ângulos basculantes inferiores a 45 graus do eixo vertical. </li><li> Para iniciar o rastreamento, clique no botão &lt;Seguir e analisar&gt; na janela GUI # 2. Clique na caixa &quot;Histórico rastreio&quot; na GUI Janela # 2 para salvar todo o protocolo de rastreamento para futuras referências. NOTA: Após o procedimento de rastreamento ser concluído, o comprimento do filopodium em cada quadro é armazenado emA folha chamada &#39;length_vel&#39; de &#39;dynamics.xlsx&#39; para futuras referências. Da mesma forma, todos os outros parâmetros de rastreamento são armazenados na folha denominada &#39;parameters&#39; de &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li><li> Opcionalmente, se o filopodia não for detectado automaticamente em todos os quadros, use as seguintes etapas para corrigi-lo manualmente. <ol><li> Visite o respectivo quadro usando o controle deslizante na Janela # 2 e selecione manualmente a ponta do filopodium. Nota: Os quadros, onde nenhum ponto convexo do casco são detectados, serão representados por uma região azul na janela de rastreamento da janela GUI # 2. É obrigatório verificar o botão &#39;Histórico rastreio&#39; antes que o programa de rastreamento fosse iniciado para acessar as coordenadas nodais nesse quadro. </li><li> Selecione os pontos de referência (base seguido de dica) usando &lt;6f&gt; na janela da GUI # 2. Especifique os outros parâmetros, como &quot;comprimento da varredura&quot;, &quot;Medição precisa após&quot; e &quot;ângulo de flexão máximo&quot;; Para esse quadro como descrito nos passos 5.4-5.8. </li><li> Clique no botão &lt;6i&gt; para salvar os novos parâmetros (específicos desse quadro). As etapas devem ser repetidas para todos os quadros indicados pela região azul. </li><li> Quando terminar, reinicialize o procedimento de rastreamento usando &lt;7&gt;. NOTA: Esta correção também pode ser usada se o programa mudar repentinamente de um filopodial para outro dentro de um filme. Como alternativa, considere cortar filmes que contenham filopodios múltiplos. </li></ol></li></ol> 6. Análise de Imagem - Passo 3: Análise de Proteínas Spatio-temporais <ol><li> Para a análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por &lt;8b&gt; seguida do canal de proteína de interesse (&lt;8c&gt; e / ou &lt;8d&gt; e / ou &lt;8e&gt;). Nota: É obrigatório selecionar Proteína A antes da análise ratiométrica (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; e / ou &lt;9c&gt;), pois a Proteína A é usada como referência. </li><li> Clique em &lt;8a&gt;Para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial usando o traço gerado no passo 5.9. </li></ol> 7. Análise de imagem - Etapa 4: análise de proteína métrica <ol><li> Marque a caixa &lt;9b&gt; ou &lt;9c&gt; e clique no botão &lt;9a&gt; para obter o gráfico ratiométrico espaço-temporal. NOTA: Para evitar a falsa representação da concentração relativa de proteína, a imagem ratiométrica não é plotada como X / Y, mas como log (X / Y). Para uso futuro, o gráfico ratiométrico é exportado em arquivos de formato &#39;.png&#39; e &#39;.fig&#39;, e os dados do gráfico em bruto são armazenados no arquivo &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li></ol> 8. Análise da imagem - Passo 5: Análise de ponta filopodial <ol><li> Marque a caixa &lt;8f&gt; e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limiar da base usando &lt;8g&gt; e &lt;8h&gt;. Clique em &lt;botão pressionar&gt; para salvar dados no arquivo &#39;dynamics.xlsx&#39;. Clique em &lt;Analisar Intensidades de Proteínas&gt; para gerar oRastro de intensidades de proteína da ponta filopodial e para economizar para análise ratiométrica. NOTA: O comprimento da ponta determina o número de pixels na ponta utilizada para a análise. O software retornará o valor de intensidade média dos pixels na ponta sobre cada quadro. O comprimento do limiar determina a distância mínima da base à ponta acima da qual o filopodium (ponta filopodial) começa a crescer (e quando o programa começa a rastrear o valor da intensidade da ponta). Portanto, o comprimento da ponta deve ser menor do que o comprimento do limiar. </li><li> Clique na proporção desejada a ser analisada usando &lt;9d&gt; ou &lt;9e&gt;. </li><li> Clique no botão de comparação &lt;9a&gt; para gerar os dados ratiométricos. </li></ol>

<ol><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li>
<li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+dendritic+spines%3A+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li>
<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116(2014).</li>
<li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li>
<li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33(2010).</li>
<li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li>
<li>Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+H+%22Models+for+the+Perception+of+Speech+and+Visual+Form%3A+Proceedings+of+a+Symposium%22">Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium</a>. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li>
<li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li>
<li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+filopodial+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATtrack%3A+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).</li>
<li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li>
<li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li>
<li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li>
<li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuronGrowth%2C+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li>
<li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para rastrear a dinâmica do crescimento filopodial e a análise das concentrações relativas de proteína nessas estruturas dinâmicas através do algoritmo convexo-casco. Usando o software, até 3 canais podem ser comparados por pares em uma única execução, pelo que as concentrações relativas de dois canais ( ou seja, proteínas) são determinadas ao longo do ciclo de extensão / retração e armazenadas como arquivos de imagem e dados em pastas separadas. Além das operações de ro...

O controle espaço-temporal das proteínas reguladoras da actina está associado à dinâmica do filopodium 1 , 2 . O rastreamento da concentração de proteína resolvida espacialmente ao longo do comprimento todo filopodial através do tempo é, portanto, crucial para avançar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à iniciação, alongamento, estabilização ou colapso dessas estruturas dinâmicas 3 , 4 . Ao contrário da análise de proteínas no citossolo, onde muitas mudanças de formas de células ocorrem em uma escala maior, filopodia são micro estruturas dinâmicas que constantemente se curvam 5 e se dobram, impedindo a análise usando uma abordagem simples, como uma varredura de linha. Diferentes soluções de software para rastrear a forma filopodial estão disponíveis 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, software para o rastreamento ratiométrico da dinâmica das proteínas dentro do corpo celular foi desenvolvido 10 , 11 . Para combinar o rastreamento automatizado da forma filopodial e da análise da proteína espaço-temporal, recentemente desenvolvemos um software de análise de imagem baseado no algoritmo convexo-casco 12 . Este novo método de análise, que é operado através de uma interface de usuário gráfica (GUI), combina pela primeira vez, a concentração relativa de proteína ao longo do comprimento filopodial e da velocidade de crescimento, permitindo assim a medição precisa da distribuição da proteína espaço-temporal independente do movimento desses Estruturas dinâmicas 12 . A idéia por trás do software (o código fonte está disponível gratuitamente, veja abaixo) é que um dos vértices do casco convexo coincidirá com a ponta do filopodium ( Figura 1A ). Ao olhar para o quadro subsequente paraO vértice mais próximo do casco convexo, a dica móvel pode ser rastreada em todo o filme. Uma vez que a ponta é detectada em cada quadro, sua posição é usada para desenhar um eixo juntando a ponta com um ponto de referência na base do filopodium ( Figura 1B ). Finalmente, o uso de pontos nodais equidistantes, cujas posições são determinadas pelo pixel médio com intensidade máxima ao longo da linha ortogonal ao eixo, são usados ​​para determinar uma espinha dorsal que segue a forma filopodial. Aproveitando esse backbone adaptativo, é gerado um kymograph para rastrear o crescimento filopodial e as concentrações de proteína para até três canais ao longo do comprimento filopodial ( Figura 1C ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Figura 1: Princípio de Trabalho do Software de Análise de Imagem. ( A ) O algoritmo por tráso software. No Passo 1, o usuário especifica a referência (base) e o vértice (a ponta) do filopodium. Na Etapa 2-1, a espinha dorsal do filopodium é obtida usando o pixel médio com valor de intensidade máxima. Na Etapa 3, a espinha dorsal é usada para o perfil de intensidade da proteína espacial. Na Etapa 2-2, o software acompanha automaticamente a ponta no quadro subseqüente. Todo o procedimento itera. ( B ) Instantâneo do algoritmo com filopodium real que apresenta elementos importantes, como o casco convexo que está sendo usado para o rastreamento. ( C ) Visão geral dos parâmetros que podem ser medidos com o algoritmo. Esta figura foi modificada a partir da referência 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> O software de análise de imagem é operado no Matlab (conhecido como software de programação) por meio de um uso gráficoR interface. Para maximizar a flexibilidade e a robustez para a configuração experimental particular, o usuário pode ajustar uma série de parâmetros de rastreamento ( por exemplo, ângulo de flexão permitido e movimento entre moldura) e também fazer algumas correções nos filmes ( por exemplo , corte, rotação, remoção de objetos indesejados) ( Figura 2A e Tabela 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Não. </td><td> Obrigatório </td><td colspan="5"> Descrição </td><td> Nome (em GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando o arquivo .tiff empilhado que representa o corpo da célula (com caixa marcada) ou crie o corpo celular sobreposto a partir de canais </td><td> Corpo celular </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 1 </td><td> Proteína 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 2 </td><td> Proteína 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 3 </td><td> Proteína 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Redefine tudo para arquivos de imagem empilhados pré-carregados </td><td> Restabelecer </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem para determinar a moldura inicial para análise na janela GUI # 2 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem para determinar o quadro final para análise na janela GUI # 2 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem representando curdaQuadro nt </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> O valor cinza dos pixels abaixo do qual todos os pixels serão definidos como zero </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> O valor cinza dos pixels acima do qual todos os pixels serão definidos como valores máximos </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Defina os valores de intensidade dos pixels especificados em &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; </td><td> Conjunto </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5"> Jogue o filme ajustado pela intensidade </td><td> Toque </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Cortar imagem </td><td> Colheita </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Girar imagem </td><td> Girar </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">Eliminar regiões na pilha inteira </td><td> Eliminar regiões </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para abrir a &#39;Janela de análise&#39; (janela GUI # 2) </td><td> Janela de rastreamento </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o tamanho de um pixel em microns </td><td> Digite o tamanho do pixel </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para gerar a imagem limite / borda do corpo celular sobreposto </td><td> fronteira </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para selecionar a base e a ponta do filopodia </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o número de segmentos ou nós </td><td> Número de segmentos </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o comprimento da varredura (perpendicular ao eixo) </td><td> Largura de digitalização </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar </td><td> Precise Meas after </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o raio do círculo de detecção da ponta (ou seja, a área onde o vértice pode ser localizado no próximo quadro) </td><td> Radius of tip detection </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Insira o ângulo máximo que o filopodium pode dobrar do eixo vertical </td><td> Limiar de ângulo </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Adicione pontos de referência para a base e a dica para esse quadro específico </td><td> Selecione referência </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 g </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar esse quadro específico </td><td> Precise Meas after </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o raio do círculo de detecção para esse quadro específico </td><td> Radius of tip detection </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> Depois de inserir todos os parâmetros para o quadro específico, clique para armazenar os valores na memória e no arquivo para referência adicional </td><td> Adicionar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para excluir os parâmetros manualmente configurados para essa moldura </td><td> Excluir </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para excluir todos os parâmetros armazenados manualmente usando o &quot;painel de recursos opcionais&quot; para todos os quadros </td><td> Restabelecer </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique antes de rastrear para armazenar todos os resultados de rastreamento na memória para futuras referências </td><td> Traço de história </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para iniciar o rastreamento </td><td> Acompanhar e Analisar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para iniciar o rastreamento da intensidade do canal protéico </td><td> Analisar Intensidades de Proteínas </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para rastrear a intensidade do canal protéico ao longo do comprimento filopodial </td><td> Filopodias inteiras </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína de referência ou proteína A </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Cheque para rastrear a intensidade média da proteína naE dica </td><td> Ponta principal </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o comprimento da dica </td><td> Comprimento da ponta </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite a distância mínima da base acima da qual a ponta começa a formar </td><td> limite </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para salvar os resultados da análise de ponta líder para arquivar </td><td> Botão de apertar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para iniciar a análise da proteína ratiométrica </td><td> Comparar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína B com respeito a A </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína C em relação a A </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína B com respeito a A na ponta </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína C com respeito a A na ponta </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5"> Escolha outro mapa de cores (padrão: Jetplot) </td><td> Mapa de cores </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Edite o mapa de cores </td><td> Editar o mapa de cores </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Visão geral de todas as funções presentes na GUI Windows # 1 e # 2. Uma vez que isso é realizado, o programa cria um casco convexo e rastreia automaticamente a dica ao longo do filme. Parâmetros extraídos do filme, como um kymograph ratiométrico, velocidade de crescimento e comprimento filopodial aÉ exibido e também armazenado na pasta de trabalho como imagens e como arquivos de dados. Outros parâmetros, tais como vida útil filopodial, taxa de crescimento e taxa de retração, podem então ser extraídos e analisados ​​a partir dos arquivos de dados armazenados ( Figura 2B ). <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Figura 2: Interface gráfica do usuário para usar o software de análise de imagem. ( A ) GUI Janela # 1 é usada para carregar e processar imagens. O programa pode carregar até 3 canais de proteína, pelo que 2 canais são comparados em par. A janela vem com características obrigatórias (azuis) e opcionais (verde) para pré-processamento das imagens antes do rastreamento ( B ) GUI A Janela # 2 é usada para rastrear análises de proteínas filopodium e spatio-temporais e métricas. Novamente, os recursos opcionais estão marcados em verde. Esta figura foi modificadaDa referência 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para preparação de amostras e manipulação de software. Começamos com instruções detalhadas sobre cultura de células e aquisição de filmes otimizados para análise de imagens. Esta seção sobre aquisição de dados é seguida por uma descrição detalhada para operar o software de análise de imagem. Ao longo do protocolo, apresentamos etapas críticas e recursos opcionais que devem ser considerados ao coletar e processar dados. Finalmente, analisamos filopodia de sistemas modelo diferentes com o software de análise de imagem, antes de fechar com uma comparação do software de análise de imagem descrito com outros programas disponíveis para quantificação filopodial e uma discussão sobre limitações e direção futura.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>10% Soro bovino fetal</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>1% penicilina/estreptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (solução de estoque 1M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Citrino-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Institute DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Instituto DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 células</td><td>Leibniz Instituto DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Andor</td><td>DU888 Unidade Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia são protrusões celulares dinâmicas, semelhantes a dedos, associadas à migração e à comunicação célula-célula. Para entender melhor os complexos mecanismos de sinalização subjacentes à iniciação filopodial, alongamento e posterior estabilização ou retração, é crucial determinar a atividade da proteína espaço-temporal nessas estruturas dinâmicas. Para analisar a função de proteína em filopodia, desenvolvemos recentemente um algoritmo de rastreamento semi-automatizado que se adapta às mudanças de forma filopodial, permitindo análises paralelas da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteína ao longo de todo o comprimento filopodial. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para otimizar o gerenciamento de células, a aquisição de imagens e a análise de software. Além disso, fornecemos instruções para o uso de recursos opcionais durante a análise de imagem e representação de dados, bem como diretrizes de solução de problemas para todos os passos críticos ao longo do caminho. Finalmente, também incluímos uma comparação do dEscreveu software de análise de imagem com outros programas disponíveis para quantificação de filopodia. Juntos, o protocolo apresentado fornece uma estrutura para análise precisa da dinâmica de proteínas em protrusões filopodiais usando software de análise de imagem.

Usando células COS transfectadas com um marcador para a actina filamentosa (f-tractin 18 , vermelho) e uma referência citosólica (verde), encontramos protrusões filopodiais ricas em actina ( Figura 3A , painel superior). As séries temporais mostraram que os filopodios se estendiam e retraíam rapidamente ( Figura 3A , painel do meio). Usando o software de análise de imagem, então rastreamos filopodias indi...

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

O objetivo geral deste software de análise de imagens é a análise paralela da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteínas ao longo de todo o comprimento filopodial. Este método pode realmente nos ajudar a entender questões-chave em biologia celular, especialmente as proteínas individuais envolvidas na extensão e retração de filopódios. A principal vantagem da técnica é que o algoritmo de rastreamento de forma adaptativa fornecido permite a avaliação quantitativa da dinâmica de protrusão e localização de proteínas espacialmente resolvida.Para começar, cultive neurônios, células HeLa ou COS, em meio suplementado, conforme detalhado no protocolo de texto. Uma vez que 40% de confluência é alcançado, transvect as células com as construções de escolha, usando um reagente de transvecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transvectadas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 15 a 18 horas.Após a incubação, encha as câmaras de cultura de células até 90% com meio pré-aquecido a 37 graus Celsius, contendo HEPES molar de 20 milimolares, para reduzir as mudanças no pH e na osmolaridade devido à evaporação durante a aquisição da imagem. Para selar a tampa, aplique uma fina camada de graxa a vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente na câmara de cultura que contém as células transvectas. Possivelmente, a parte mais importante para a análise de imagem é a qualidade da imagem.Uma coisa que temos que cuidar é a relação sinal-ruído, que deve ser superior a quatro e podemos garantir que, ajustando o tempo de exposição da câmera e a intensidade e força do laser, a taxa de quadros deve ser superior a um hertz. Adquira as imagens usando um microscópio com objetiva de 60x ou 100x e sem curvatura de pixels. Use taxas de aquisição não inferiores a um hertz para rastrear a dinâmica filopodial.Para minimizar artefatos fora de foco, imagem filopodial perto da membrana de manjericão. Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser de forma que a relação sinal-ruído seja maior que quatro. Quando isso estiver concluído, inicie a aquisição da imagem.Após o pré-processamento da imagem, conforme descrito no protocolo de texto, carregue as imagens baixando a pasta compactada que contém todos os arquivos necessários para a análise da imagem. Descompacte e copie arquivos para a pasta de trabalho. Uma vez instalado, inicie a interface gráfica do usuário abrindo o arquivo chamado, filopodiaAnalysisM3.fig.Carregue os arquivos TIFF de pilha salvos para proteínas individuais na interface gráfica do usuário ou na GUI. Usando os botões 1B para a proteína A, 1C para a proteína B e, opcionalmente, 1D para a proteína C.Crie uma imagem sobreposta da célula a partir dos canais de proteína clicando em 1A. Em seguida, clique em 2A, para atribuir o primeiro quadro e clique em 2B, para atribuir o último quadro para a análise.Opcionalmente, recorte a região de interesse ou ROI, contendo o filopódio de interesse usando o botão 2H. Gire a imagem usando o botão 2I ou exclua regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho à mão livre, 2J. Mova o controle deslizante, 2C para cada quadro para controle de qualidade e para verificar se o filopódio permanece claramente visível durante todo o filme.Para gerar o rastreamento, primeiro clique no botão 3A na janela da GUI um, para abrir a janela da GUI dois. Clique no botão quatro na janela dois da GUI, para gerar a massa do corpo celular sobreposto que foi gerado na janela um da GUI, depois de clicar em 1A. Recomendamos gastar algum tempo otimizando parâmetros, como o número de segmentos, a largura de varredura e o raio de varredura para seu conjunto de dados experimentais.Mova o controle deslizante na janela número dois, para verificar onde a ponta filopodial aparece pela primeira vez. Em seguida, clique no botão cinco e o cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base de onde a distância da ponta filopodial é medida.Seguido pela ponta dos filopódios no quadro onde aparece pela primeira vez. Em seguida, selecione o comprimento do limite acima do qual os filopódios se dobrarão, usando 6C. Em seguida, especifique o número de segmentos usados para aproximar a forma dos filopódios na casa 6A.Especifique a largura de varredura, que atua como um scanner horizontal, para colocar os nós em 6B. Especifique o raio de varredura na caixa 6D, use um valor que seja aproximadamente 50% maior que o deslocamento da ponta entre os quadros observado. Em seguida, especifique o ângulo de dobra na caixa 6E.Marque o rastreamento do histórico da caixa na janela dois da GUI, para salvar todo o protocolo de rastreamento para referência futura e, em seguida, clique no botão rastrear e analisar para iniciar o rastreamento. Para análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por 8B, seguida pelo canal de proteína de interesse. Clique em 8A, para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial, usando o traço gerado anteriormente.Para análise de proteína raciométrica, marque a caixa 9B ou 9C e clique no botão 9A para obter o gráfico raciométrico espaço-temporal. Para realizar a análise de ponta filopodial, marque a caixa 8F e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limite a partir da base, usando 8G e 8H. Clique no botão para salvar os dados em um arquivo do Excel chamado dynamics.xlsx.Em seguida, clique em analisar intensidades de proteína para gerar o traço de intensidades de proteína da ponta filopodial e salvar para análise raciométrica. Clique na proporção desejada a ser analisada, usando 9D ou 9E. Por fim, clique no botão comparar, 9A para gerar os dados raciométricos.A análise de células COS transvectivas com um marcador para actina filamentosa em vermelho e uma referência citosólica em verde revela saliências filopodiais ricas em actina. Uma série temporal mostra que as saliências filopodiais ricas em actina se estendem e se retraem rapidamente. Usando o software de análise de imagens, os filopódios individuais foram rastreados.O software de análise de imagem rastreia de forma confiável a extensão filopodial, além das taxas de crescimento e retração de um filopódio individual, os quimígrafos também retratam a concentração de actina normalizada para a referência citosólica. Se usada corretamente, essa técnica permite a análise quantitativa da dinâmica da protrusão e da concentração de proteína espacialmente resolvida ao longo dos filopódios. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar a velocidade de aquisição e manter a relação sinal-ruído maior que quatro, sem saturar imagens individuais.

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Neste protocolo de vídeo, rastreamos - em alta velocidade e em três dimensões - lisossomos marcados com fluorescência dentro de células vivas, usando o método de rastreamento orbital em um microscópio modificado de dois fótons.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.

Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Este artigo apresenta um método para análise espiostemporal de sondas móveis, de uma molécula, baseadas em Förster, utilizando microscopia de fluorescência widefield. O kit de ferramentas de software recém-desenvolvido permite a determinação de traços de tempo smFRET de sondas móveis, incluindo a eficiência correta do FRET e as posições moleculares, em função do tempo.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a usar uma interface gráfica para rastrear dinamicamente a concentração de proteínas em filopódios celulares. Este método computacional permite analisar protrusões e localização proteica em células como neurônios, HeLa e COS.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas (Vídeo) | JoVE Journal

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Explorar mais vídeos