Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

O objetivo geral deste software de análise de imagens é a análise paralela da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteínas ao longo de todo o comprimento filopodial. Este método pode realmente nos ajudar a entender questões-chave em biologia celular, especialmente as proteínas individuais envolvidas na extensão e retração de filopódios. A principal vantagem da técnica é que o algoritmo de rastreamento de forma adaptativa fornecido permite a avaliação quantitativa da dinâmica de protrusão e localização de proteínas espacialmente resolvida.

Para começar, cultive neurônios, células HeLa ou COS, em meio suplementado, conforme detalhado no protocolo de texto. Uma vez que 40% de confluência é alcançado, transvect as células com as construções de escolha, usando um reagente de transvecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transvectadas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 15 a 18 horas.

Após a incubação, encha as câmaras de cultura de células até 90% com meio pré-aquecido a 37 graus Celsius, contendo HEPES molar de 20 milimolares, para reduzir as mudanças no pH e na osmolaridade devido à evaporação durante a aquisição da imagem. Para selar a tampa, aplique uma fina camada de graxa a vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente na câmara de cultura que contém as células transvectas. Possivelmente, a parte mais importante para a análise de imagem é a qualidade da imagem.

Uma coisa que temos que cuidar é a relação sinal-ruído, que deve ser superior a quatro e podemos garantir que, ajustando o tempo de exposição da câmera e a intensidade e força do laser, a taxa de quadros deve ser superior a um hertz. Adquira as imagens usando um microscópio com objetiva de 60x ou 100x e sem curvatura de pixels. Use taxas de aquisição não inferiores a um hertz para rastrear a dinâmica filopodial.

Para minimizar artefatos fora de foco, imagem filopodial perto da membrana de manjericão. Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser de forma que a relação sinal-ruído seja maior que quatro. Quando isso estiver concluído, inicie a aquisição da imagem.

Após o pré-processamento da imagem, conforme descrito no protocolo de texto, carregue as imagens baixando a pasta compactada que contém todos os arquivos necessários para a análise da imagem. Descompacte e copie arquivos para a pasta de trabalho. Uma vez instalado, inicie a interface gráfica do usuário abrindo o arquivo chamado, filopodiaAnalysisM3.fig.

Carregue os arquivos TIFF de pilha salvos para proteínas individuais na interface gráfica do usuário ou na GUI. Usando os botões 1B para a proteína A, 1C para a proteína B e, opcionalmente, 1D para a proteína C.Crie uma imagem sobreposta da célula a partir dos canais de proteína clicando em 1A. Em seguida, clique em 2A, para atribuir o primeiro quadro e clique em 2B, para atribuir o último quadro para a análise.

Opcionalmente, recorte a região de interesse ou ROI, contendo o filopódio de interesse usando o botão 2H. Gire a imagem usando o botão 2I ou exclua regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho à mão livre, 2J. Mova o controle deslizante, 2C para cada quadro para controle de qualidade e para verificar se o filopódio permanece claramente visível durante todo o filme.

Para gerar o rastreamento, primeiro clique no botão 3A na janela da GUI um, para abrir a janela da GUI dois. Clique no botão quatro na janela dois da GUI, para gerar a massa do corpo celular sobreposto que foi gerado na janela um da GUI, depois de clicar em 1A. Recomendamos gastar algum tempo otimizando parâmetros, como o número de segmentos, a largura de varredura e o raio de varredura para seu conjunto de dados experimentais.

Mova o controle deslizante na janela número dois, para verificar onde a ponta filopodial aparece pela primeira vez. Em seguida, clique no botão cinco e o cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base de onde a distância da ponta filopodial é medida.

Seguido pela ponta dos filopódios no quadro onde aparece pela primeira vez. Em seguida, selecione o comprimento do limite acima do qual os filopódios se dobrarão, usando 6C. Em seguida, especifique o número de segmentos usados para aproximar a forma dos filopódios na casa 6A.

Especifique a largura de varredura, que atua como um scanner horizontal, para colocar os nós em 6B. Especifique o raio de varredura na caixa 6D, use um valor que seja aproximadamente 50% maior que o deslocamento da ponta entre os quadros observado. Em seguida, especifique o ângulo de dobra na caixa 6E.

Marque o rastreamento do histórico da caixa na janela dois da GUI, para salvar todo o protocolo de rastreamento para referência futura e, em seguida, clique no botão rastrear e analisar para iniciar o rastreamento. Para análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por 8B, seguida pelo canal de proteína de interesse. Clique em 8A, para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial, usando o traço gerado anteriormente.

Para análise de proteína raciométrica, marque a caixa 9B ou 9C e clique no botão 9A para obter o gráfico raciométrico espaço-temporal. Para realizar a análise de ponta filopodial, marque a caixa 8F e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limite a partir da base, usando 8G e 8H. Clique no botão para salvar os dados em um arquivo do Excel chamado dynamics.xlsx.

Em seguida, clique em analisar intensidades de proteína para gerar o traço de intensidades de proteína da ponta filopodial e salvar para análise raciométrica. Clique na proporção desejada a ser analisada, usando 9D ou 9E. Por fim, clique no botão comparar, 9A para gerar os dados raciométricos.

A análise de células COS transvectivas com um marcador para actina filamentosa em vermelho e uma referência citosólica em verde revela saliências filopodiais ricas em actina. Uma série temporal mostra que as saliências filopodiais ricas em actina se estendem e se retraem rapidamente. Usando o software de análise de imagens, os filopódios individuais foram rastreados.

O software de análise de imagem rastreia de forma confiável a extensão filopodial, além das taxas de crescimento e retração de um filopódio individual, os quimígrafos também retratam a concentração de actina normalizada para a referência citosólica. Se usada corretamente, essa técnica permite a análise quantitativa da dinâmica da protrusão e da concentração de proteína espacialmente resolvida ao longo dos filopódios. Ao tentar o procedimento, é importante lembrar a velocidade de aquisição e manter a relação sinal-ruído maior que quatro, sem saturar imagens individuais.