De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar receptores únicos na superfície de células vivas e analisar sua localização, movimento e associação dinâmica em complexos supramoleculares. Isso é conseguido expressando receptores marcados com snap em níveis muito baixos na superfície das células vivas e marcando-os com fluoróforos orgânicos brilhantes para permitir a detecção de uma única molécula. Como segunda etapa, as células são visualizadas por microscopia de fluorescência de reflexão interna total, que permite adquirir uma sequência de imagem rápida de partículas receptoras individuais que se movem na superfície da célula.

Em seguida, algoritmos automatizados de detecção e rastreamento são aplicados à sequência de imagens para obter a posição e a intensidade de cada partícula receptora ao longo do tempo. São obtidos resultados que mostram uma análise precisa do tamanho dos complexos receptores neste exemplo, beta dois receptores adrenérgicos com base em um ajuste gaussiano misto da distribuição de intensidade das partículas no início da sequência de imagens. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como a forma como nossos receptores se organizam em domínios od da superfície das células vivas.

Como eles interagem uns com os outros para formar dímeros e oligômeros, e como os eventos dinâmicos na base da sinalização do receptor estão realmente ocorrendo. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos bioquímicos e microscopia padrão é que ela investiga o comportamento de receptores únicos no ambiente natural, permitindo-nos estudar aspectos importantes que normalmente estão ocultos nas medições de conjunto. As lamínulas das amostras devem ser extensivamente limpas para minimizar a fluorescência de fundo Durante a imagem, use uma pinça limpa para colocar 24 milímetros de diâmetro.

A tampa de vidro desliza em um suporte de lamínula que separa as lamínulas individuais. Coloque o suporte com lamínulas em um béquer e adicione clorofórmio até que as lamínulas estejam cobertas. Cubra o copo com papel alumínio para reduzir a evaporação e sonicar em um banho.

Sonicar durante uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, retire o porta-lamínulas do copo e deixe secar as lamínulas. Em seguida, coloque o suporte com as lamínulas em outro béquer e adicione cinco molares de solução de hidróxido de sódio até que as lamínulas estejam cobertas.

Como antes, cubra o copo com papel alumínio e sonice por uma hora em temperatura ambiente, transfira o porta-lamínula para um novo béquer e lave três vezes com água destilada. Por fim, coloque as lamínulas limpas em uma placa de cultura de células de vidro cheia de etanol 100%. Aqui são mostradas as lamínulas antes e depois da limpeza, visualizadas por fluorescência de reflexão interna total ou microscopia de grama.

As amostras de calibração Cal são usadas para estimar a intensidade de moléculas fluorescentes únicas durante a microscopia de grama. Para preparar as amostras, dissolva o corante fluorescente no solvente apropriado. Preparar uma diluição de uma a 10 séries do corante fluorescente, variando de um picamolar a um anomolar.

Em água esterilizada com filtro. Lave as lamínulas previamente limpas, transferindo-as para uma placa de cultura de células cheia de água esterilizada com filtro. Depois disso, coloque cada lamínula em um poço de uma placa de cultura de células de seis poços e espere até que sequem 20 microlitros de cada diluição de corante fluorescente em uma lamínula limpa separada.

Deixe as lamelas secarem sob um capuz estéril. Proteja as lamínulas da luz e poeira até o uso antes da transfecção. Prepare uma placa de cultura de células de seis poços Lave as lamínulas limpas com PBS estéril e coloque uma lamínula em cada poço da placa de cultura de células de seis poços.

As células CHO a serem transfectadas para este estudo são cultivadas a 37 graus Celsius em 5% de CO2 em uma mistura de nutrientes médios de águia modificada com ECCOs um para um F 12 suplementada com 10% de penicilina e estreptomicina de soro bovino fetal após tripsina e contando as células seguindo métodos padrão semeadas a uma densidade de três vezes 10 elevado a quintas células por poço. Na placa de cultura de células do sexto poço contendo as lamínulas, deixe as células crescerem em uma incubadora por 24 horas para atingir aproximadamente 80% de fluência de co, que é a densidade celular ideal. Para transfecção.

O aspecto mais difícil deste protocolo é atingir um nível de expressão extremamente baixo de receptores de membrana na superfície celular para garantir o sucesso. A condição de transfecção. Por exemplo, a quantidade de mais mídia NA e o tempo após a transfecção devem ser otimizados no dia da transfecção.

Prepare os reagentes de transfecção para cada um diluindo dois microgramas do DNA xadrez desejado em 500 microlitros de meio ideal em outro tubo. Para cada poço, diluir seis microlitros de Lipectomia 2000 em 500 microlitros de meio Optum. Incube ambos os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos.

Após cinco minutos, combine as duas soluções em um tubo e misture para obter uma mistura de transfecção. Incube a mistura de transfecção em temperatura ambiente por 20 minutos. Enquanto isso, prepare as células CHO.

Lave as células duas vezes com PBS pré-avisado Após a segunda lavagem, substitua o PBS por um mililitro por poço de meio D-M-E-M-F 12 sem vermelho de fenol suplementado com 10% de FBS, mas sem antibióticos. Adicione um mililitro da mistura de transfecção, gota a gota em cada poço e balance suavemente a placa para frente e para trás para garantir uma mistura completa. Incube a 37 graus Celsius em 5%CO2 por duas a quatro horas antes de prosseguir imediatamente para a rotulagem da proteína.

Para iniciar este procedimento, diluir um microlitro do derivado de benzoguina conjugado com fluor quatro ou solução estoque de fluoro quatro BG em um mililitro de meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS para obter uma concentração final de um micromolar. Recupere as células transfectadas da incubadora e lave duas vezes com PBS pré-aquecido. Substitua o PBS por um mililitro de uma solução micromolar de flúor e quatro BG e incube a 37 graus Celsius em 5% de CO2 por 20 minutos.

Em seguida, lave as células três vezes com meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS de cada vez, seguido de uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius. Pinças usadas para transferir lamínulas com células marcadas para uma câmara de imagem. Lave duas vezes com 300 microlitros de tampão de imagem.

Adicione 300 microlitros de tampão de imagem fresco e prossiga imediatamente para que as imagens de imagem sejam adquiridas. Usando um microscópio de relva equipado com uma imersão em óleo, objetiva de alta abertura numérica, lasers adequados, um dispositivo acoplado de carga de multiplicação de elétrons, câmera e incubadora e um controle de temperatura. Defina os parâmetros de microscópio desejados, ou seja, a linha do laser, o ângulo do gramado, o tempo de exposição, a taxa de quadros e o número de imagens por filme.

Coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva de 100 x do microscópio. Coloque a câmara de imagem com as células marcadas no suporte da amostra do microscópio e coloque as células em foco. Usando iluminação de campo claro.

Mude para a iluminação do gramado. Mantenha a potência do laser o mais baixa possível para permitir a busca pela célula desejada, mas ao mesmo tempo minimizando o branqueamento da foto. Selecione a célula desejada e tudo bem.

Ajuste o foco. Aumente a potência do laser para um nível que permita a visualização de quatro de flora única. Adquira uma sequência de imagens e salve a sequência de imagens brutas como um arquivo tiff para calibração.

Monte cada amostra de calibração na câmara de imagem e coloque-a no microscópio. Escolha uma amostra contendo difração bem separada. Manchas limitadas que descolorem em uma única etapa.

As sequências de imagens de relva são posteriormente adquiridas da mesma forma demonstrada para as células marcadas. Para preparar uma sequência de imagens, use um software de processamento de imagens, como a Imagem J, para cortar as imagens. Salve quadros individuais como imagens TIFF separadas em uma nova pasta indicando o número do quadro em cada imagem.

A detecção e o rastreamento de partículas são realizados com um software não comercial, como o U Track, em um ambiente MATLAB. No prompt de comando do MATLAB, digite seletor de filme, GUI. Para abrir a interface de seleção de filmes, siga as instruções para criar um novo banco de dados de filmes a partir das imagens separadas salvas anteriormente.

Forneça o tamanho do pixel em nanômetros, intervalo de tempo em segundos, abertura numérica, profundidade de bits da câmera e comprimento de onda de emissão do fluoróforo necessário para detecção e rastreamento de partículas. Salve o banco de dados de filmes da interface de seleção de filmes. Execute a análise escolhendo partículas únicas como tipo de objeto.

Execute o algoritmo de detecção e, em seguida, execute o algoritmo de rastreamento. Use a rotina do visualizador de filmes contida no pacote URAC para visualizar as faixas e verificar a qualidade da detecção e do rastreamento. Abra o arquivo dot MAT para ver a posição e a amplitude das partículas rastreadas em cada quadro.

O tamanho das partículas também pode ser calculado a partir dos dados adquiridos. Aqui é mostrado o primeiro quadro de uma sequência típica de imagens de grama de uma célula transfectada com receptores beta dois adrenérgicos marcados com snap e marcada com um derivado de benzilguina conjugado com flúor quatro. As manchas representam receptores únicos ou complexos de receptores.

Um algoritmo de detecção é aplicado à mesma sequência de imagens e cada partícula detectada é indicada por uma aplicação de círculo azul de um algoritmo de rastreamento. Para a mesma sequência de imagem resulta em trajetórias das partículas individuais indicadas em azul. Os segmentos verdes representam eventos de mesclagem e os segmentos vermelhos representam eventos de divisão.

Esse método também captura eventos dinâmicos. Neste exemplo, duas partículas passam por uma interação transitória, movidas juntas por vários quadros e se dividem novamente. As trajetórias de partículas individuais são usadas para calcular seus coeficientes de difusão.

Este resultado representativo mostra que o receptor beta dois adrenérgicos tem alta mobilidade. Embora o receptor gaba B tenha mobilidade limitada, o tamanho dos complexos receptores pode ser estimado com precisão ajustando as distribuições das intensidades das partículas com um modelo gaussiano misto. Essa análise também pode revelar a coexistência de monômeros e dímeros.

Aqui são mostrados exemplos de branqueamento de partículas receptoras monoméricas em uma etapa e branqueamento de partículas receptoras diamétricas em duas etapas. Esses procedimentos podem ser estendidos e adaptados para trabalhar com outras proteínas da superfície celular, métodos de nivelamento e modelos celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um sono de cobertura limpa, como obter baixos níveis de expressão e rotulagem eficiente com fluors orgânicos brilhantes, bem como como adquirir e analisar imagens de grama, que representam todas as etapas principais para uma única molécula bem-sucedida.