Name: De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 13 s
Description: Aprenda a visualizar receptores únicos em células vivas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total. Este método permite analisar mobilidade, tamanhos de complexos e interações transientes em biologia celular.

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O desenvolvimento deste protocolo foi apoiado por doações do Conselho Europeu de Pesquisa (Advanced Grant TOPAS para M.J.L.) e da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grants CA 1014/1-1 para D.C. e SFB487 para M.J.L.). T.S. foi apoiado pela Fundação Alexander von Humboldt.

1. Exemplo de Preparação <ol><li> Limpeza Coverslip NOTA: Trabalhar sob uma coifa. <ol><li> Use uma pinça limpa para colocar lamínulas de vidro (24 mm de diâmetro) em um suporte lamela que separa lamelas individuais. </li><li> Colocar o suporte com lamelas para uma proveta, e adicionar clorofórmio até as lamelas são cobertas. Cobrir a proveta com folha de alumínio para reduzir a evaporação e sonicado num banho de ultra-sons durante 1 hora à temperatura ambiente. Retire o suporte a lamela para fora do copo e deixe as lamelas seco. </li><li> Repetir o passo 1.1.2, com uma solução de NaOH 5M em vez de clorofórmio. </li><li> Retire o suporte da lamela em um novo recipiente e lavar três vezes com água destilada. Coloque lamelas limpas em uma placa de cultura de células de vidro cheio com etanol a 100%. </li></ol></li><li> Preparação de amostras de calibração <ol><li> Dissolver corante fluorescente no solvente apropriado. </li><li> Prepara-se uma diluição em série 1:10 do corante fluorescente variandoentre 1 pM a 1 nM em filtro esterilizado (0,22 mM) de água. </li><li> Tome lamelas limpas armazenados em etanol a 100% e lava-se com água, esterilizada por filtração. Mancha 20 ul de cada diluição do corante fluorescente em uma lamela limpa separado. Deixe as lamelas secar sob um capuz estéril. Proteja as lamelas da luz e poeira até o uso. Usar estas amostras para avaliar a intensidade de moléculas fluorescentes individuais (ver etapa 3). </li></ol></li><li> A transfecção <ol><li> Cultura de células CHO no meio de uma mistura 1:1 / nutriente de Eagle modificado por Dulbecco F-12 (DMEM/F12) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C, em . 5% de CO 2 NOTA: Utilize a mídia livre de fenol-vermelho durante todo o experimento para minimizar autofluorescência. </li><li> Tome lamelas limpos a partir da solução de etanol a 100%, lavá-las com uma solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), e colocar uma lamela em cada poço de uma cultura de células de 6 poços plcomeu. </li><li> Trypsinize, e contar as células CHO semente a uma densidade de 3 x 10 5 células / poço na placa de 6 poços de cultura de células contendo as lamelas. Permitir que as células crescem numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 24 horas, a fim de atingir aprox. 80% de confluência, o que representa a densidade celular óptima para transfecção. </li><li> Para cada poço, diluída de 2 ug de ADN de plasmídeo desejado (por exemplo., SNAP-tag β receptor 2-adrenérgico) e 6 uL de Lipofectamine 2000, em dois tubos separados contendo 500 ul de meio de Optimem. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Combina-se as soluções a partir do passo 1.3.4 em um tubo e misturar para obter uma mistura de transfecção. Incubar a mistura de transfecção em TA durante 20 min. </li><li> Durante a incubação (1.3.5), levar as células CHO e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml / poço de meio de vermelho de fenol livre de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, mas sem antibióticos. </li><li> Adicionar toda a transfecçãomistura de iões (1 ml) a partir do passo 1.3.5, gota a gota a cada poço, e abane a placa para trás e para assegurar a mistura completa. </li><li> Incubar durante 2 a 4 horas a 37 ° C, em 5% de CO 2 e proceder imediatamente a seguir para o passo seguinte NOTA:. Estas condições de transfecção foram optimizados para conseguir densidades de receptores &lt;0,45 partícula / iM de 2, que são adequadas para uma única imagiologia molécula. Ajustes podem ser necessários quando se utiliza diferentes células, construções ou reagentes. </li></ol></li><li> De marcação de proteínas <ol><li> Dilui-se 1 ml de solução de estoque fluoróforo-BG em 1 ml de meio de DMEM/F12 suplementado com FBS a 10% para obter uma concentração final de 1 uM. Levar as células transfectadas da incubadora e lavar duas vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. Substituir PBS com 1 ml de solução de fluoróforo 1 uM-BG e incubar durante 20 min a 37 ° C, 5% de CO 2 num incubador. </li><li> Após a incubação, lavar as células trêsvezes com meio DMEM/F12 suplementado com FBS a 10%, de cada vez seguido de 5 minutos de incubação a 37 ° C. Dê uma lamela (com células marcadas) com uma pinça e colocá-lo em uma câmara de imagem. </li><li> Lavar duas vezes com 300 ul de tampão de imagem. Adicionar 300 mL de tampão de imagem fresca e proceder de imediato à imagem (parte 2). </li></ol></li></ol> 2. Aquisição de Imagem NOTA: Use uma reflexão interna total de fluorescência (TIRF) microscópio, equipado com um objetivo de imersão em óleo de alta abertura numérica (por exemplo, 100X magnification/1.46 abertura numérica.), Lasers adequados (por exemplo, 405 nm, 488 nm, 561 nm e 645 lasers de diodo nm), um elétron multiplicação Charge Coupled Device (EMCCD) câmera, uma incubadora e um controle de temperatura para visualizar moléculas fluorescentes individuais. <ol><li> Defina os parâmetros desejados, ou seja, de microscópio., Linha laser, ângulo TIRF (este parâmetro controla a penetraçãoprofundidade ção do campo evanescente), tempo de exposição, taxa de quadros e número de imagens por filme 10. Mantenha o controle do aquecedor / incubadora e temperatura sempre para evitar desvios de temperatura e condensação de umidade. </li><li> Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objetivo 100X do microscópio. Coloque a câmara de imagens com as células marcadas para o suporte da amostra do microscópio, e trazer as células em foco com uma iluminação de campo claro. </li><li> Mudar para iluminação TIRF. Mantenha a potência do laser tão baixo quanto possível para permitir a pesquisa para a célula desejada, mas, ao mesmo tempo que minimiza o fotobranqueamento. </li><li> Selecione a célula desejada e multa ajustar o foco. Defina a potência do laser para um nível que permite a visualização de fluoróforos individuais. Adquirir seqüência de imagens e salvar o arquivo de seqüência de imagens raw como. Tiff. </li></ol> 3. Calibration (fluoróforos individuais sobre vidro e monoméricas / Controles Receptores diméricas) <ol><li> Monte cada sampl calibraçãoe preparados como descrito em 1.2, no câmara de imagem. Colocar cada amostra ao microscópio e escolher a amostra contendo manchas limitada de difração bem separados que lixívia em uma única etapa NOTA:. Estes pontos representam moléculas de corante fluorescente. </li><li> Adquirir sequências de imagens TIRF como descrito no passo 2 Importante:. Os mesmos parâmetros de formação de imagens devem ser usadas em todas as experiências, incluindo aqueles para a calibração. </li><li> Realizar a detecção e acompanhamento de análise conforme detalhado na 4,1-4,2. Extrai-se a intensidade de cada uma das partículas como descrito em 4.2.6. A partir destes dados, calcular a média (μ) e desvio padrão (σ) da intensidade de fluoróforos individuais. </li><li> Opcional: executar a mesma análise sobre as células transfectadas com um receptor de superfície celular monomérica (. Por exemplo, CD86), N-terminal etiquetado com uma ou duas cópias de SNAP 10 e marcado com o fluoróforo derivado-BG. Follow o procedimento acima descrito para o fluoróforo único em vidro. Estimativa da eficiência de marcação, tal como descrito em Calebiro, D. et al. 10 </li></ol> 4. Image Analysis <ol><li> Preparação seqüência de imagens <ol><li> Utilize um software de processamento de imagem (por exemplo., ImageJ) para cortar as imagens. </li><li> Salve quadros individuais como separado. Imagens TIFF em uma nova pasta, indicando em cada imagem o número do quadro. </li><li> Medir a área de superfície da célula através da elaboração de uma região de interesse (ROI) ao longo do contorno de uma célula e utilizando a ferramenta da medida em ImageJ ou um instrumento semelhante, em outro software. Utilizar este valor para calcular a densidade da partícula, dividindo o número total de partículas no início do filme pela área da superfície da célula. </li></ol></li><li> Detecção e rastreamento de partículas NOTA: Use um software não comercial, como u-track 13, trabalhando em Matlabmeio ambiente, para detectar e rastrear partículas receptores individuais automaticamente. NOTA: O algoritmo de u-pista é baseado no método de rastreamento de várias hipóteses. Esta abordagem liga partículas entre quadros por construir matrizes de custo, onde as probabilidades, que uma dada partícula em um quadro corresponde a uma dada partícula do próximo quadro, aparece, desaparece ou funde / divide com / a partir de outras partículas são atribuídos. A solução que minimize os custos a nível global, ie., Aquele com a maior probabilidade, é finalmente selecionado. Isso também permite o acompanhamento de um partícula desaparecer temporariamente, um fenômeno típico causado pelo fluoróforo piscar. A última versão do u-track (2.1.0) tem interfaces gráficas que facilitam a execução dessas análises. <ol><li> No prompt de comando do Matlab, digite "movieSelectorGUI" para abrir a interface de seleção de filmes. Siga as instruções para criar umanovo banco de dados filme a partir das imagens separadas salvas anteriormente (ver 4.1.2). </li><li> Fornecer o tamanho do pixel em nm, intervalo de tempo em segundos, abertura numérica, profundidade de bits da câmara e comprimento de onda de emissão do fluoróforo, necessário para a detecção e monitoramento de partículas. Salve o banco de dados do filme. </li><li> A partir da interface de seleção de filmes, executar a análise, a escolha de "partículas individuais" como o tipo de objetos. Uma nova janela aparecerá onde os parâmetros utilizados para detecção e rastreamento de partículas pode ser definido. Comece com os parâmetros padrão. Mais tarde, ajustar esses parâmetros, se a qualidade da detecção e / ou rastreamento não é satisfatório (por exemplo, algumas partículas não são detectados ou faixas são fragmentados) Opcional:. Sob as configurações de rastreamento, marque "resultados de rastreamento Exportar para o formato matriz" para armazenar as coordenadas e as amplitudes de todas as partículas em uma única matriz (campo denominado "trackedFeaturedInfo"). Para uma descrição detalhada destes parâmetros, consulte a documentação do u-track. </li><li> Execute o algoritmo de detecção. Este algoritmo determina automaticamente a localização ea intensidade acima do fundo de cada ponto de difração limitada (ou seja., Complexos de receptores individuais / receptores) por montagem de uma função gaussiana bidimensional com desvio padrão igual à função de ponto de difusão do microscópio em torno maxima intensidade local . Em seguida, execute o algoritmo de rastreamento. Armazenar os resultados das análises de um arquivo de esteira.. </li><li> Use a rotina "movieViewer", contido no pacote u-track, ou os personalizados semelhantes a visualizar as pistas e verificar a qualidade de detecção e rastreamento. </li><li> Abra o ficheiro de esteira. Ver a posição e amplitude (isto é., Intensidade) das partículas controladas em cada trama. Os dados gerados no passo 4.2.4 estão contidas no domínio tracksCoordAmpCG do ar tracksFinalray e / ou em trackedFeaturedInfo. A partir do número total de partículas detectada calcular a densidade das partículas dividindo este valor pela área da superfície da célula medida em 4.1.3. </li><li> Opcional: Utilize a partícula coordena ao longo do tempo (ver 4.2.6) para analisar o movimento das partículas de receptores. Calcular os deslocamentos médios quadrados (MSD) e coeficientes de difusão (D), utilizando Matlab ou software similar. Para cada partícula e de cada intervalo de tempo (Δ t) considerado, calcular o deslocamento médio quadrático (MSD) utilizando a seguinte fórmula: <img align="middle" alt="Equação 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq1.jpg"> onde Δ t é o intervalo de tempo em quadros, N é o número de etapas analisadas, x e y são x e y da partícula coordenadas no quadro indicado pelo índice. Use o MSD sobre parcelas de tempo para avaliar o tipo de movimento de uma dada partícula: relações linearesindicam uma difusão livre (isto é., movimento browniano), uma curvatura positiva (isto é., a curva se parece com uma parábola) sugere movimento dirigido, uma curvatura negativa é um indicativo de movimento confinado 14. No caso de partículas que difundem livremente, calcular o coeficiente de difusão (D) de cada partícula de pelo ajuste dos dados MSD obtidos com a seguinte equação: <img align="middle" alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq2.jpg"></li></ol></li><li> Cálculo de tamanho de partícula com o método de montagem de Gauss Observação: Uma vez que a distribuição de intensidade de amostras de calibração (fluoróforos individuais em vidro e / ou os receptores monoméricos marcados com fluorescência) é conhecida, realizar um ajuste de Gauss misto sobre a distribuição das intensidades de partículas no início de uma sequência de imagens para determinar o tamanho dos complexos de receptores (isto é., o número de receptores por partículas) 10. Execute estas análises utilizando Matlab ou ssoftware imilar. <ol><li> Calcula-se a intensidade de cada partícula a média da intensidade da partícula do primeiro quadro para o quadro antes da primeira mudança na intensidade ocorreu (na maioria dos casos uma diminuição devido à fotodegradação). </li><li> Realizar um encaixe Gaussian misto de acordo com a seguinte equação: <img align="middle" alt="Equação 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51784/51784eq3.jpg"> onde φ (i) é a frequência de partículas tendo intensidade i, n é o número de componentes, α n é um parâmetro que contribui para a altura do componente de n, e μ σ são a média e o desvio padrão da intensidade de referência fluoróforos individuais . (calculada tal como descrito no passo 3) NOTA: Determinar tele número máximo de componentes (n max) para cada seqüência de imagens, aumentando progressivamente até o máximo n adição de um componente que já não produzem um melhor encaixe estatisticamente, como julgado por um teste F. </li><li> Opcional: (., Por exemplo, nos últimos 60 quadros de uma seqüência de quadros 400) Execute um ajuste de Gauss misto na distribuição de intensidade obtidos nos últimos quadros do filme. Substitua μ e σ com os valores obtidos após este ajuste, que fornecem estimativas refinados para esses parâmetros, e repita o passo 4.3.2. </li><li> Calcula-se a área sob a curva (AUC) de cada um dos componentes do encaixe Gaussian misto. Calcular a abundância relativa de partículas de receptores de diferentes tamanhos (isto é, monómero, dímero, trímero, etc), dividindo o valor de AUC de cada componente pela AUC de toda a distribuição. </li><li>Opcional: usar dados de diferentes células e as densidades de partículas correspondentes (calculados como descrito no ponto 4.2.6) para gerar parcelas onde a distribuição de partículas com tamanho diferente está correlacionada com a densidade de partículas 10. </li></ol></li><li> Cálculo de tamanho de partícula com o método de passo a montagem NOTA: Usar uma análise de ajuste passo como um método alternativo para determinar o tamanho dos complexos de receptores 10. A base para esta análise é o de que a destruição induzida pela luz (fotodegradação) de uma única resultados fluoróforo no seu desaparecimento instantâneo - assim partículas contendo fluoróforos n se espera que a produção de lixívia, progressivamente um perfil de intensidade com o n passos. <ol><li> Extrato de perfis de intensidade de cada partícula do arquivo mat. Gerado por u-track ou software de detecção / rastreamento semelhante (ver 4.2.6). </li><li> Usar um algoritmo de ajuste de fase, tal como o apresentadona ref. 10, para contar o número de passos de branqueamento para cada partícula. </li><li> Opcional: utilizar os resultados para gerar distribuições mostrando a abundância relativa de partículas de tamanho diferente do receptor e correlacioná-los com uma densidade de partícula tal como anteriormente descrito para os resultados da instalação de Gauss misto (ver 4.3). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo descrito permite a análise do arranjo espacial, a mobilidade e o tamanho dos complexos de receptores da superfície celular no nível de molécula única. Em comparação com a utilização de proteínas fluorescentes, marcação com fluoróforos orgânicas pequenas, que são mais claras e mais fotoestável, tem a vantagem de permitir a visualização ampliada das partículas de receptores individuais. Uma vez que os níveis extremamente baixos de expressão são atingidos (&lt;0,45 mM partículas do receptor / 2), as ...

Receptores localizados na superfície da célula sentir do ambiente extracelular e responder a uma variedade de estímulos, tais como aromatizantes, iões, pequenos neurotransmissores e hormonas proteicas grandes. A natureza fluida das membranas celulares permite movimentos de receptores e outras proteínas de membrana. Isto é essencial para a formação de complexos de proteínas e a ocorrência de interacções proteína-proteína transitórios, tais como os utilizados pelos receptores para montar em unidades funcionais e transdução de sinais no interior das células. Por exemplo, L-receptores acoplados à proteína (GPCRs), que constituem a maior família de receptores da superfície celular, um, têm sido sugeridos para formar di-/oligomers, que parece estar envolvida na regulação de ajuste entre a transdução de sinal e pode ter conseqüências fisiológicas e farmacológicas importantes 2-5. Microscopia única molécula tem o grande potencial de visualizar diretamente com alta spatiotempresolução por via oral o comportamento dinâmico de receptores individuais localizados na superfície de células vivas, incluindo a sua associação para formar dímeros e complexos moleculares de maior ordem de 6-10. Este oferece várias vantagens em relação aos métodos bioquímicos e de microscopia de padrão, que geralmente relatam o comportamento médio de milhares ou milhões de moléculas. De marcação de proteínas com um fluoróforo suficientemente brilhante e fotoestável é essencial para a microscopia de molécula única. Este protocolo tem vantagem de a marca de SNAP recentemente introduzido 11 para ligar covalentemente as pequenas e brilhantes fluoróforos orgânicos para os receptores da superfície celular. SNAP é uma proteína de 20 kD marcação derivados a partir da reparação do ADN enzima O-DNA alquiltransferase 6-alquilguanina humano, que pode ser irreversivelmente marcado com fluoróforo conjugado benzilguanina (fluoróforo-BG) derivados. CLIP, uma marca ainda mais engenharia derivada da SNAP, pode ser em vez marcado com fluoróforo-cderivados benzilcitosina onjugated 12. O protocolo relatado neste manuscrito explica como a transfectar e etiqueta SNAP-11 com etiquetas receptores com pequenos fluoróforos orgânicos e utilizar de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar os receptores individuais ou complexos de receptores na superfície de células vivas 10. Os resultados do protocolo relatado em&gt; 90% de eficiência de marcação de uma extracelularmente SNAP-tag de proteína da superfície da célula 10. Para mais informações sobre a utilização de dados de molécula única para analisar o tamanho e a mobilidade dos complexos de receptores, bem como para capturar as interacções receptor-receptor transiente, é fornecida. Um fluxo esquemática de todo o protocolo é dada na Figura 1. Como um exemplo, a transfecção de células de ovário de hamster chinês (CHO) com L-receptores acoplados à proteína SNAP-tag (GPCRs) seguido de marcação com um derivado de fluoróforo-BG quanto bem como a sua aplicação a quantify e di-/oligomerization receptor do monitor são descritos. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas da superfície celular, e marcadores fluorescentes (p. ex., CLIP), assim como a outros métodos de transfecção e de rotulagem.

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1585</td><td>CUIDADO: substância tóxica e irritante, bem como um possível carcinógeno</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>CUIDADO: base forte e reagente altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverwash&nbsp;</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111640</td><td>24 mm de diâmetro, 0,13-0,16 mm de espessura</td></tr><tr><td>0,2 mm filtro estéril</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Células CHO</td><td>ATCC, EUA</td><td>ATCC CCL-61</td><td>Linha celular de ovário de hamster chinês</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Nunc</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM/F-12</td><td>GIBCO, Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Meio livre de fenol vermelho</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina - estreptomicina&nbsp;</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P06-07 100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P10-23100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Soro Reduzido Meio</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Benzilguanina conjugada com fluoróforo&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>S9136S</td><td>SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Faça uma solução estoque de 1 mM em DMSO. Armazene a -20 graus C.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de imagem:</td><td></td><td></td> <td>137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,3, filtrado estéril</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; NaCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1371</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; KCl</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; CaCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2303</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; MgCl2</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; HEPES</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Imagem</td><td>Sondas Moleculares, Life Technologies</td><td>A-7816</td><td>Câmara de Células Attofluor, para microscopia</td></tr><tr><td>TIRF-M</td><td>Leica</td><td></td><td>Modelo: DMI6000B</td></tr><tr><td>objetiva TIRF</td><td>Leica</td><td>11 506 249&nbsp;</td><td>HCX PL Apo 100x/1.46 Óleo CORR&nbsp;</td></tr><tr><td>Câmera EM-CCD&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>Photometrics Cascade 512B Controlador de</td></tr><tr><td>temperatura</td><td>Pecon</td><td></td><td>Tempcontrol 37-2 digital</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH, EUA</td><td></td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij</td></tr><tr><td>u-track software</td><td>Laboratório de biologia celular computacional, Departamento de Biologia Celular, Harvard Medical School, EUA</td><td></td><td>http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</td></tr><tr><td>Matlab software</td><td>The MathWorks, EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de alta resolução espacial e temporal análise de receptor dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Microscopia única molécula está emergindo como uma abordagem poderosa para analisar o comportamento de moléculas de sinalização, nomeadamente sobre os aspectos (por exemplo., Cinética, a coexistência de diferentes estados e populações, interações transitórias), que são normalmente escondidos em medições Ensemble, como os obtidos com métodos bioquímicos ou microscopia padrão. Assim, os eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor, pode ser acompanhado em tempo real em uma célula viva com alta resolução espaço-temporal. Este protocolo descreve um método baseado na marcação com fluoróforos orgânicas pequenas e brilhantes e de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualizar directamente os receptores individuais sobre a superfície de células vivas. Esta abordagem permite localizar com precisão os receptores, medir o tamanho de complexos receptores, e capturar eventos dinâmicos, como interações receptor-receptor transitórias. O protocolo proporciona uma descrição detalhada de como perform uma experiência única molécula, incluindo a preparação de amostras, aquisição de imagem e análise de imagem. Como um exemplo, a aplicação do presente método para analisar acoplados à proteína G, com dois receptores, ou seja., Β 2-adrenérgicos e γ-aminobutírico tipo ácido B (GABA B) do receptor, é relatado. O protocolo pode ser adaptado para outras proteínas da membrana de células e modelos diferentes, os métodos de transfecção e estratégias de rotulagem.

O protocolo descrito pode ser aplicado a uma variedade de diferentes proteínas de membrana. Como um exemplo, os resultados representativos obtidos com β receptores 2-adrenérgicos e receptores GABAB são relatados 10. Desde sinais fluorescentes de moléculas individuais são fracas, a minimização da fluorescência de fundo é o primeiro passo fundamental para resultados bem sucedidos. Assim, é importante o uso de lamelas extensiva limpeza (Figura 2A), bem como para minimizar a...

Este protocolo descreve como usar a microscopia de fluorescência de reflexão interna total para visualizar e rastrear receptores únicos na superfície de células vivas e, assim, analisar a mobilidade lateral do receptor, o tamanho dos complexos receptores, bem como visualizar as interações transitórias receptor-receptor. Este protocolo pode ser estendido a outras proteínas de membrana.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar receptores únicos na superfície de células vivas e analisar sua localização, movimento e associação dinâmica em complexos supramoleculares. Isso é conseguido expressando receptores marcados com snap em níveis muito baixos na superfície das células vivas e marcando-os com fluoróforos orgânicos brilhantes para permitir a detecção de uma única molécula. Como segunda etapa, as células são visualizadas por microscopia de fluorescência de reflexão interna total, que permite adquirir uma sequência de imagem rápida de partículas receptoras individuais que se movem na superfície da célula.Em seguida, algoritmos automatizados de detecção e rastreamento são aplicados à sequência de imagens para obter a posição e a intensidade de cada partícula receptora ao longo do tempo. São obtidos resultados que mostram uma análise precisa do tamanho dos complexos receptores neste exemplo, beta dois receptores adrenérgicos com base em um ajuste gaussiano misto da distribuição de intensidade das partículas no início da sequência de imagens. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como a forma como nossos receptores se organizam em domínios od da superfície das células vivas.Como eles interagem uns com os outros para formar dímeros e oligômeros, e como os eventos dinâmicos na base da sinalização do receptor estão realmente ocorrendo. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos bioquímicos e microscopia padrão é que ela investiga o comportamento de receptores únicos no ambiente natural, permitindo-nos estudar aspectos importantes que normalmente estão ocultos nas medições de conjunto. As lamínulas das amostras devem ser extensivamente limpas para minimizar a fluorescência de fundo Durante a imagem, use uma pinça limpa para colocar 24 milímetros de diâmetro.A tampa de vidro desliza em um suporte de lamínula que separa as lamínulas individuais. Coloque o suporte com lamínulas em um béquer e adicione clorofórmio até que as lamínulas estejam cobertas. Cubra o copo com papel alumínio para reduzir a evaporação e sonicar em um banho.Sonicar durante uma hora à temperatura ambiente. Após uma hora, retire o porta-lamínulas do copo e deixe secar as lamínulas. Em seguida, coloque o suporte com as lamínulas em outro béquer e adicione cinco molares de solução de hidróxido de sódio até que as lamínulas estejam cobertas.Como antes, cubra o copo com papel alumínio e sonice por uma hora em temperatura ambiente, transfira o porta-lamínula para um novo béquer e lave três vezes com água destilada. Por fim, coloque as lamínulas limpas em uma placa de cultura de células de vidro cheia de etanol 100%. Aqui são mostradas as lamínulas antes e depois da limpeza, visualizadas por fluorescência de reflexão interna total ou microscopia de grama.As amostras de calibração Cal são usadas para estimar a intensidade de moléculas fluorescentes únicas durante a microscopia de grama. Para preparar as amostras, dissolva o corante fluorescente no solvente apropriado. Preparar uma diluição de uma a 10 séries do corante fluorescente, variando de um picamolar a um anomolar.Em água esterilizada com filtro. Lave as lamínulas previamente limpas, transferindo-as para uma placa de cultura de células cheia de água esterilizada com filtro. Depois disso, coloque cada lamínula em um poço de uma placa de cultura de células de seis poços e espere até que sequem 20 microlitros de cada diluição de corante fluorescente em uma lamínula limpa separada.Deixe as lamelas secarem sob um capuz estéril. Proteja as lamínulas da luz e poeira até o uso antes da transfecção. Prepare uma placa de cultura de células de seis poços Lave as lamínulas limpas com PBS estéril e coloque uma lamínula em cada poço da placa de cultura de células de seis poços.As células CHO a serem transfectadas para este estudo são cultivadas a 37 graus Celsius em 5% de CO2 em uma mistura de nutrientes médios de águia modificada com ECCOs um para um F 12 suplementada com 10% de penicilina e estreptomicina de soro bovino fetal após tripsina e contando as células seguindo métodos padrão semeadas a uma densidade de três vezes 10 elevado a quintas células por poço. Na placa de cultura de células do sexto poço contendo as lamínulas, deixe as células crescerem em uma incubadora por 24 horas para atingir aproximadamente 80% de fluência de co, que é a densidade celular ideal. Para transfecção.O aspecto mais difícil deste protocolo é atingir um nível de expressão extremamente baixo de receptores de membrana na superfície celular para garantir o sucesso. A condição de transfecção. Por exemplo, a quantidade de mais mídia NA e o tempo após a transfecção devem ser otimizados no dia da transfecção.Prepare os reagentes de transfecção para cada um diluindo dois microgramas do DNA xadrez desejado em 500 microlitros de meio ideal em outro tubo. Para cada poço, diluir seis microlitros de Lipectomia 2000 em 500 microlitros de meio Optum. Incube ambos os tubos à temperatura ambiente por cinco minutos.Após cinco minutos, combine as duas soluções em um tubo e misture para obter uma mistura de transfecção. Incube a mistura de transfecção em temperatura ambiente por 20 minutos. Enquanto isso, prepare as células CHO.Lave as células duas vezes com PBS pré-avisado Após a segunda lavagem, substitua o PBS por um mililitro por poço de meio D-M-E-M-F 12 sem vermelho de fenol suplementado com 10% de FBS, mas sem antibióticos. Adicione um mililitro da mistura de transfecção, gota a gota em cada poço e balance suavemente a placa para frente e para trás para garantir uma mistura completa. Incube a 37 graus Celsius em 5%CO2 por duas a quatro horas antes de prosseguir imediatamente para a rotulagem da proteína.Para iniciar este procedimento, diluir um microlitro do derivado de benzoguina conjugado com fluor quatro ou solução estoque de fluoro quatro BG em um mililitro de meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS para obter uma concentração final de um micromolar. Recupere as células transfectadas da incubadora e lave duas vezes com PBS pré-aquecido. Substitua o PBS por um mililitro de uma solução micromolar de flúor e quatro BG e incube a 37 graus Celsius em 5% de CO2 por 20 minutos.Em seguida, lave as células três vezes com meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS de cada vez, seguido de uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius. Pinças usadas para transferir lamínulas com células marcadas para uma câmara de imagem. Lave duas vezes com 300 microlitros de tampão de imagem.Adicione 300 microlitros de tampão de imagem fresco e prossiga imediatamente para que as imagens de imagem sejam adquiridas. Usando um microscópio de relva equipado com uma imersão em óleo, objetiva de alta abertura numérica, lasers adequados, um dispositivo acoplado de carga de multiplicação de elétrons, câmera e incubadora e um controle de temperatura. Defina os parâmetros de microscópio desejados, ou seja, a linha do laser, o ângulo do gramado, o tempo de exposição, a taxa de quadros e o número de imagens por filme.Coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva de 100 x do microscópio. Coloque a câmara de imagem com as células marcadas no suporte da amostra do microscópio e coloque as células em foco. Usando iluminação de campo claro.Mude para a iluminação do gramado. Mantenha a potência do laser o mais baixa possível para permitir a busca pela célula desejada, mas ao mesmo tempo minimizando o branqueamento da foto. Selecione a célula desejada e tudo bem.Ajuste o foco. Aumente a potência do laser para um nível que permita a visualização de quatro de flora única. Adquira uma sequência de imagens e salve a sequência de imagens brutas como um arquivo tiff para calibração.Monte cada amostra de calibração na câmara de imagem e coloque-a no microscópio. Escolha uma amostra contendo difração bem separada. Manchas limitadas que descolorem em uma única etapa.As sequências de imagens de relva são posteriormente adquiridas da mesma forma demonstrada para as células marcadas. Para preparar uma sequência de imagens, use um software de processamento de imagens, como a Imagem J, para cortar as imagens. Salve quadros individuais como imagens TIFF separadas em uma nova pasta indicando o número do quadro em cada imagem.A detecção e o rastreamento de partículas são realizados com um software não comercial, como o U Track, em um ambiente MATLAB. No prompt de comando do MATLAB, digite seletor de filme, GUI. Para abrir a interface de seleção de filmes, siga as instruções para criar um novo banco de dados de filmes a partir das imagens separadas salvas anteriormente.Forneça o tamanho do pixel em nanômetros, intervalo de tempo em segundos, abertura numérica, profundidade de bits da câmera e comprimento de onda de emissão do fluoróforo necessário para detecção e rastreamento de partículas. Salve o banco de dados de filmes da interface de seleção de filmes. Execute a análise escolhendo partículas únicas como tipo de objeto.Execute o algoritmo de detecção e, em seguida, execute o algoritmo de rastreamento. Use a rotina do visualizador de filmes contida no pacote URAC para visualizar as faixas e verificar a qualidade da detecção e do rastreamento. Abra o arquivo dot MAT para ver a posição e a amplitude das partículas rastreadas em cada quadro.O tamanho das partículas também pode ser calculado a partir dos dados adquiridos. Aqui é mostrado o primeiro quadro de uma sequência típica de imagens de grama de uma célula transfectada com receptores beta dois adrenérgicos marcados com snap e marcada com um derivado de benzilguina conjugado com flúor quatro. As manchas representam receptores únicos ou complexos de receptores.Um algoritmo de detecção é aplicado à mesma sequência de imagens e cada partícula detectada é indicada por uma aplicação de círculo azul de um algoritmo de rastreamento. Para a mesma sequência de imagem resulta em trajetórias das partículas individuais indicadas em azul. Os segmentos verdes representam eventos de mesclagem e os segmentos vermelhos representam eventos de divisão.Esse método também captura eventos dinâmicos. Neste exemplo, duas partículas passam por uma interação transitória, movidas juntas por vários quadros e se dividem novamente. As trajetórias de partículas individuais são usadas para calcular seus coeficientes de difusão.Este resultado representativo mostra que o receptor beta dois adrenérgicos tem alta mobilidade. Embora o receptor gaba B tenha mobilidade limitada, o tamanho dos complexos receptores pode ser estimado com precisão ajustando as distribuições das intensidades das partículas com um modelo gaussiano misto. Essa análise também pode revelar a coexistência de monômeros e dímeros.Aqui são mostrados exemplos de branqueamento de partículas receptoras monoméricas em uma etapa e branqueamento de partículas receptoras diamétricas em duas etapas. Esses procedimentos podem ser estendidos e adaptados para trabalhar com outras proteínas da superfície celular, métodos de nivelamento e modelos celulares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um sono de cobertura limpa, como obter baixos níveis de expressão e rotulagem eficiente com fluors orgânicos brilhantes, bem como como adquirir e analisar imagens de grama, que representam todas as etapas principais para uma única molécula bem-sucedida.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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