Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar diretamente a atividade das proteínas de ligação ao DNA em células bacterianas vivas. Isso é feito visualizando células que expressam uma proteína fluorescente fotoativada fundida a uma proteína de ligação ao DNA de interesse. A segunda etapa do procedimento é adquirir um filme de proteínas individuais sendo fotoativadas durante a imagem.

Em seguida, os dados são analisados para determinar as localizações das proteínas e rastrear proteínas dentro de células individuais. Os eventos de ligação ao DNA são identificados pela mudança no coeficiente de difusão de proteínas individuais quando elas entram em contato com os cromossomos. Em última análise, os resultados podem fornecer uma medida quantitativa das interações do DNA da proteína no nível de uma única célula, contando o número de proteínas ligadas e difusoras por célula.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de reparo de DNA, como as taxas de reparo in vivo e a distribuição espacial dos locais de reparo. Agora vamos demonstrar o método medindo a atividade de reparo da DNA polimerase em células de e coli vivas Primeiro, faça lamínulas sem partículas fluorescentes de fundo em um forno a 500 graus Celsius por uma hora. Queime um estoque de lamínulas de espessura número 1,5, armazene-as em temperatura ambiente em papel alumínio.

Eles são bons para as próximas semanas. Em seguida, concentre um mililitro de E coli da fase exponencial inicial em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro da cepa. AB 1157 poli a PA m cereja centrifugue as células a 2.300 G por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 20 microlitros de meio residual e transforme as células em solução. Em seguida, faça uma solução de aros de baixa fluorescência a 1,5% em água destilada. Misture 500 microlitros do aeros derretido com 500 microlitros de dois x meio mínimo, pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes para experimentos de danos ao DNA usando sulfonato de metilmetano ou MMS, tomando precauções.

Adicione 8,3 microlitros de MMS aos 500 microlitros de meio mínimo antes de misturá-lo com o aros antes que a mistura esfrie. Espalhe-o sobre uma lamínula queimada. Espalhe uniformemente e centralizado sem fazer bolhas.

Alise a almofada com uma segunda lamínula queimada. Depois de resfriado, remova a tampa superior da almofada e adicione um microlitro de suspensão de células concentradas. Imobilize as células cobrindo a almofada com uma nova lamínula queimada e pressionando suavemente para baixo.

As células devem ser visualizadas dentro de 45 minutos antes de secarem. Para estender esse tempo, a almofada pode ser selada dentro de uma junta de silicone para experimentos de danos ao DNA. Antes de obter imagens das células, incube-as na almofada por 20 minutos.

Em um recipiente umidificado à temperatura ambiente, o microscópio possui um laser de ativação de foto de 405 nanômetros e um laser de excitação de 561 nanômetros. A sensibilidade de molécula única é alcançada excitando apenas quatro fluorados dentro de uma seção fina acima da superfície da lamínula usando iluminação altamente inclinada, a emissão de fluorescência é registrada em uma câmera CCD de multiplicação de elétrons. Coloque a amostra no microscópio stage e coloque as células em foco.

Sob iluminação de luz transmitida, defina um campo de visão recortado para reduzir o tamanho dos dados e aumentar a velocidade de leitura da câmera. Cubra a amostra da luz ambiente e ligue o ganho da câmera CCD multiplicadora de elétrons para detecção de quatro flúor único. Defina a taxa de quadros para 15,26 milissegundos por quadro.

Isso inclui a leitura da câmera de 0,26 milissegundos Os tempos de exposição precisam ser suficientemente curtos para observar pontos fluorescentes nítidos com pouco movimento estridente. Por outro lado, os rastros precisam ser amostrados em intervalos de tempo suficientemente longos para distinguir claramente as moléculas ligadas das difusoras. Agora exiba os dados da câmera para verificar o sinal de fundo escuro.

Ligue o laser de 561 nanômetros e verifique o sinal de fundo de excitação. Ligue o laser de 405 nanômetros para fotoativação das proteínas de fusão de cereja Paul one PA M e aumente a intensidade até que apareçam pontos fluorescentes de moléculas individuais. Agora ajuste o ângulo do feixe de excitação para iluminar apenas uma seção fina da amostra.

Feche a superfície da lamínula. Este método depende da detecção e localização precisa de proteínas fluorescentes únicas, portanto, o alinhamento e a sensibilidade ideais do microscópio serão cruciais para a qualidade dos dados. Para isso, focalize o feixe de laser no plano focal traseiro de uma objetiva de 100 x abertura numérica de 1,4.

Translação da lente de foco perpendicular ao feixe move o foco para longe do centro da objetiva, fazendo com que o feixe saia da objetiva em um ângulo. Aponte para o feixe para maximizar a intensidade da fluorescência e minimizar o fundo. Encontre um novo campo de visão das células no modo de microscopia de luz transmitida e foque a imagem.

Tire uma foto da câmera para registrar os contornos das células. Ligue o laser de 561 nanômetros e branqueie a autofluorescência celular e as manchas de fundo na capa. Deslize por alguns segundos.

Antes de iniciar a aquisição de dados, inicie a aquisição de um filme de palma sob excitação contínua de 561 nanômetros. Ligue o laser de 405 nanômetros e aumente gradualmente a intensidade ao longo do filme, atingindo até um watt por centímetro quadrado. Evite intensidades mais altas de 405 nanômetros que causam autofluorescência celular.

Preste atenção à densidade das moléculas fluorescentes. É importante manter as taxas de ativação baixas, de modo que os pontos fluorescentes sejam claramente isolados em cada quadro. Grave cerca de 10.000 quadros por filme, o que, com um campo de visão recortado, normalmente leva até três minutos e até um gigabyte de espaço no disco rígido.

Observe que, uma vez que um campo de visão tenha sido fotografado, os fluoróforos de cereja pa m são irreversivelmente branqueados e não podem ser observados. Novamente, o procedimento a seguir usa software personalizado no matlab. Fluoróforos únicos aparecem como funções de propagação de ponto ou psfs.

No filme, os psfs são identificados pela primeira vez em uma imagem filtrada por passagem de banda usando um kernel gaussiano com sete posições candidatas de diâmetro de pixels que correspondem a P SFS com intensidades de pixel de pico 4,5 vezes acima do desvio padrão do plano de fundo. O pixel localmente mais brilhante por PSF candidato serve como um palpite inicial para ajustar uma função gaussiana elíptica. Os parâmetros de ajuste livre são posição X y, posição X largura, largura Y rotação, ângulo, amplitude e deslocamento do plano de fundo.

A máscara gaussiana elíptica é responsável pelo movimento da molécula durante o tempo de exposição, o que borra e deforma o gráfico PSF. As localizações XY resultantes de todos os quadros do filme da palma da mão na imagem de microscopia de luz transmitida do mesmo campo de visão localizações de Paul one PAM Cherry devem aparecer dentro da área central das células de e coli. O rastreamento automatizado mede o movimento das proteínas, mas a escolha bem-sucedida de uma janela de rastreamento é crucial.

Primeiro, execute o algoritmo de rastreamento para um intervalo de parâmetros da janela de rastreamento. Plote o número de trilhas medidas por célula versus a janela de rastreamento para identificar a menor janela de rastreamento possível que não divide as trilhas exiba as trilhas resultantes na imagem de microscopia de luz transmitida do mesmo campo de view. Para visualizar a distribuição espacial do movimento da molécula dentro das células, as faixas P one devem exibir a difusão confinada dentro de células únicas se uma fração das faixas parecer cruzar entre as células, o que sugere que moléculas separadas foram erroneamente ligadas porque a janela de rastreamento foi escolhida muito grande e ou a taxa de ativação da foto era muito alta.

Plote a distribuição cumulativa dos comprimentos de passo entre localizações consecutivas. A curva sobe e satura suavemente para janelas de rastreamento suficientemente grandes, mas mostra uma borda de corte se a janela foi escolhida muito pequena. Uma vez escolhida uma janela de rastreamento adequada, as características de difusão do Paul One podem ser analisadas.

Calcule o deslocamento quadrado médio ou MSD entre localizações consecutivas para cada trilha com um total de n passos, use apenas trilhas com pelo menos cinco localizações para reduzir a incerteza estatística do MSD. Em seguida, calcule o coeficiente de difusão aparente por trilha do MSD. O segundo termo corrige o erro de localização estimado.

Estes são os valores para o segundo mandato. Neste exemplo, agora plote um histograma dos valores do coeficiente de difusão medidos de todas as trilhas no campo de visão para pol um em células não danificadas e para pol um em células sob tratamento de danos ao DNA com MMS, as barras vermelhas identificam a população de moléculas individuais de pol um que parecem ligadas ao cromossomo e se difundem a menos de 0,15 mícrons quadrados por segundo. Enquanto as moléculas que se difundem livremente se movem em torno de 0,9 mícrons quadrados por segundo.

Após o Paul ligado, uma molécula foi identificada. As posições dos locais de ligação podem ser visualizadas em células não danificadas e em células com dano mm MS. A fração de rastros ligados em relação ao número total de rastros observados fornece uma medida quantitativa direta da atividade de reparo do DNA de pol.

Uma fotoativação in vivo de proteínas de fusão de cereja pol one PA m foi realizada em células vivas de e coli. A fotoativação pode ser limitada a um único fluoróforo de cereja PA m em uma célula, taxas mais altas de fotoativação revelaram mais moléculas fluorescentes. A análise de localização foi realizada para cada quadro de um filme de palma.

A precisão foi medida usando moléculas imóveis em células fixas ou moléculas ligadas em células vivas, e encontrada em 40 nanômetros de acordo com a previsão teórica. Em seguida, o limite de localização foi definido quando estava muito baixo. Picos aleatórios no ruído de fundo foram erroneamente selecionados como posições candidatas, enquanto que se o limite fosse muito alto, alguns pontos foram perdidos.

As localizações de Paul um resultantes ocuparam a área central da célula, recapitulando amplamente a organização espacial do nucleóide e coli. A maioria dos Paul one tracks em células não danificadas exibe difusão. Uma célula típica contém várias centenas de faixas de Paul um consistentes com o número de cópias de aproximadamente 400 moléculas de Paul por célula e coli.

Diferentes tipos de movimento molecular podem ser identificados calculando os valores de MSD em uma faixa de tempos de atraso, o movimento direcionado fornece uma curva parabólica. O movimento browniano é caracterizado por uma linha reta. Uma curva de difusão confinada atinge um platô e um deslocamento da curva MSD para partículas imóveis representa a incerteza de localização.

A curva MSD resultante para Paul One aumentou linearmente para tempos de atraso curtos indicativos de movimento browniano e saturada em tempos de atraso mais longos devido ao confinamento celular. Usando esses métodos, a atividade de reparo do DNA de Paul, um foi medida em resposta ao dano de alquilação de DNA exógeno em células não danificadas. O histograma do coeficiente de difusão de Paul um mostra uma população dominante de moléculas difusoras.

As poucas moléculas ligadas podem estar envolvidas na replicação do DNA e no reparo de danos endógenos ao DNA sob danos contínuos de 100 milimolares por MMS. A frequência de trilhas com coeficientes de difusão próximos de zero aumenta significativamente. Isso apóia o modelo de que mais moléculas de Paul um devem estar envolvidas no reparo do DNA com mutagênico presente após este procedimento.

Outros métodos de análise de dados, como localização, agrupamento, podem ser realizados para quantificar a distribuição espacial de proteínas na célula e investigar a presença de complexos proteicos maiores envolvidos no reparo do DNA.