Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e quantificar diretamente a atividade de proteínas de ligação ao DNA em células bacterianas vivas. Isso é realizado por meio da visualização de células que expressam uma proteína fluorescente fotoativada fundida a uma proteína de ligação ao DNA de interesse. O segundo passo do procedimento consiste em adquirir um vídeo de proteínas individuais sendo fotoativadas enquanto são observadas.

Em seguida, os dados são analisados para determinar localizações proteicas e rastrear proteínas dentro de células individuais. Eventos de ligação ao DNA são identificados pela alteração no coeficiente de difusão de proteínas individuais ao entrarem em contato com cromossomos. Em última instância, os resultados podem fornecer uma medida quantitativa das interações proteína-DNA em nível de célula única, contando o número de proteínas ligadas e difusíveis por célula.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de reparo de DNA, como as taxas de reparo in vivo e a distribuição espacial dos sítios de reparo. Agora demonstraremos o método medindo a atividade de reparo da DNA polimerase uma em células vivas de E. coli. Primeiro, prepare lamínulas sem partículas fluorescentes de fundo em um forno a 500 graus Celsius por uma hora. Queime um estoque de lamínulas de espessura número 1,5 e armazene-as à temperatura ambiente em folha de alumínio.

Eles são bons por semanas consecutivas. Em seguida, concentre um mililitro de E. coli em fase exponencial inicial em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro da linhagem AB 1157 poly A PA m cherry e centrifugue as células a 2.300 ×g por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 20 microlitros de meio residual, e vortexe as células até completa dissolução. Em seguida, prepare uma solução de ágar a 1,5% de baixa fluorescência em água destilada. Misture 500 microlitros do ágar fundido com 500 microlitros de meio mínimo 2x, pipetando suavemente para cima e para baixo algumas vezes, para experimentos de dano ao DNA utilizando metil metano sulfonato ou MMS, tomando as devidas precauções.

Adicione 8,3 microlitros de MMS aos 500 microlitros de meio mínimo antes de misturar com os aros, antes que a mistura esfrie. Espalhe sobre uma lamínula aquecida. Distribua uniformemente e no centro, sem formar bolhas.

Achate o suporte com uma segunda lamínula queimada. Após o resfriamento, remova a lamínula superior do suporte e adicione um microlitro de suspensão celular concentrada. Imobilize as células cobrindo o suporte com uma nova lamínula queimada e pressionando suavemente para baixo.

As células devem ser imagiadas dentro de 45 minutos antes que dessequem. Para prolongar esse tempo, a lâmina pode ser selada dentro de uma junta de silicone para experimentos de Dano ao DNA. Antes de imagiar as células, incube-as na lâmina por 20 minutos.

Em um recipiente umidificado à temperatura ambiente, o microscópio possui um laser de fotoativação de 405 nanômetros e um laser de excitação de 561 nanômetros. A sensibilidade em nível de molécula única é alcançada ao excitar apenas as fluorocromos dentro de uma fina seção acima da superfície da lamínula utilizando iluminação altamente inclinada; a emissão de fluorescência é registrada em uma câmera CCD com multiplicação eletrônica. Coloque a amostra sobre a platina do microscópio e coloque as células em foco.

Sob iluminação com luz transmitida, defina um campo de visão recortado para reduzir o tamanho dos dados e aumentar a velocidade de leitura da câmera. Proteja a amostra da luz ambiente e ligue o ganho da câmera CCD de multiplicação eletrônica para detecção individual de fluoro quatro. Ajuste a taxa de quadros para 15,26 milissegundos por quadro.

Isso inclui o tempo de leitura da câmera de 0,26 milissegundo. Os tempos de exposição precisam ser suficientemente curtos para observar pontos fluorescentes nítidos com pouca difusão por movimento. Por outro lado, as trajetórias precisam ser amostradas em intervalos de tempo suficientemente longos para distinguir claramente as moléculas ligadas das que estão em difusão. Agora, exiba os dados da câmera para verificar o sinal de fundo escuro.

Ligue o laser de 561 nanômetros e verifique o sinal de fundo de excitação. Ligue o laser de 405 nanômetros para a fotoativação das proteínas de fusão Paul one PA mCherry e aumente a intensidade até que apareçam pontos fluorescentes de moléculas individuais. Ajuste agora o ângulo do feixe de excitação para iluminar apenas uma fina seção da amostra.

Feche a superfície da lamínula. Este método depende da detecção e localização precisa de proteínas fluorescentes individuais, sendo assim o alinhamento ideal e a sensibilidade do microscópio cruciais para a qualidade dos dados. Para tanto, foque o feixe de laser no plano focal traseiro de uma objetiva de 100 x com abertura numérica 1,4.

Transladar a lente de focagem perpendicularmente ao feixe move o foco para longe do centro do objetivo, fazendo com que o feixe saia do objetivo em um ângulo. Ajuste o feixe para maximizar a intensidade da fluorescência e minimizar o fundo. Encontre um novo campo de visão de células no modo de microscopia de luz transmitida e foque a imagem.

Tire uma foto com a câmera para registrar os contornos celulares. Ligue o laser de 561 nanômetros e bata a autofluorescência celular e os pontos de fundo na lamínula por alguns segundos.

Antes de iniciar a aquisição de dados, comece a aquisição de um filme palm sob excitação contínua de 561 nanômetros. Ligue o laser de 405 nanômetros e aumente gradualmente a intensidade ao longo do filme, atingindo até um watt por centímetro quadrado. Evite intensidades mais altas de 405 nanômetros que possam causar autofluorescência celular.

Preste atenção à densidade das moléculas fluorescentes. É importante manter as taxas de ativação baixas para que os pontos fluorescentes fiquem claramente isolados em cada quadro. Grave cerca de 10.000 quadros por filme, o que, com um campo de visão recortado, normalmente leva até três minutos e ocupa até um gigabyte de espaço em disco rígido.

Observe que, uma vez que um campo de visão tenha sido capturado por imagem, os fluoróforos pa m cherry são irreversivelmente clareados e não podem mais ser observados. Novamente, o procedimento a seguir utiliza um software personalizado no Matlab. Fluoróforos individuais aparecem como funções de dispersão pontual ou psfs.

No vídeo, os PSFs são inicialmente identificados em uma imagem com filtro de passagem de banda utilizando um kernel gaussiano com diâmetro de sete pixels; as posições candidatas correspondem aos PSFs cujas intensidades máximas nos pixels são 4,5 vezes superiores ao desvio padrão do fundo. O pixel localmente mais brilhante por PSF candidato serve como estimativa inicial para ajustar uma função gaussiana elíptica. Os parâmetros livres do ajuste são: posição em X, posição em Y, largura em X, largura em Y, ângulo de rotação, amplitude e deslocamento do fundo.

A máscara gaussiana elíptica leva em consideração o movimento da molécula durante o tempo de exposição, o que desfoca e deforma o gráfico da PSF. As localizações XY resultantes de todos os quadros do filme PAM são projetadas sobre a imagem de microscopia de luz transmitida do mesmo campo de visão; as localizações de Paul um PAM Cherry devem aparecer dentro da área central das células de E. coli. O rastreamento automatizado mede o movimento das proteínas, mas a escolha adequada de uma janela de rastreamento é crucial.

Primeiro, execute o algoritmo de rastreamento para uma variedade de parâmetros da janela de rastreamento. Plote o número de trilhas medidas por célula versus a janela de rastreamento para identificar a menor janela de rastreamento possível que não divida trilhas; exiba as trilhas resultantes na imagem de microscopia de luz transmitida do mesmo campo de visão. Para visualizar a distribuição espacial do movimento de moléculas dentro das células, as trilhas devem exibir difusão confinada dentro de células individuais; se uma fração das trilhas parecer atravessar entre células, isso sugere que moléculas separadas foram incorretamente ligadas porque a janela de rastreamento foi escolhida muito grande e/ou a taxa de fotoativação estava muito alta.

Trace a distribuição cumulativa dos comprimentos dos passos entre localizações consecutivas. A curva sobe e se satura suavemente para janelas de rastreamento suficientemente grandes, mas apresenta uma borda de corte se a janela foi escolhida muito pequena. Uma vez escolhida uma janela de rastreamento adequada, as características de difusão de Paul um podem ser analisadas.

Calcule o deslocamento quadrático médio ou MSD entre localizações consecutivas para cada trajetória com um total de n etapas, utilizando apenas trajetórias com pelo menos cinco localizações para reduzir a incerteza estatística do MSD. Em seguida, calcule o coeficiente de difusão aparente por trajetória a partir do MSD. O segundo termo corrige o erro estimado de localização.

Esses são os valores para o segundo termo. Neste exemplo, agora plote um histograma dos valores medidos do coeficiente de difusão provenientes de todas as trajetórias no campo de visão para a pol uma em células não danificadas e para a pol uma em células submetidas ao tratamento com dano no DNA usando MMS; as barras vermelhas identificam a população de moléculas individuais da pol uma que parecem ligadas ao cromossomo e se difundem a menos de 0,15 micrômetros quadrados por segundo. Enquanto isso, as moléculas em difusão livre se movem em torno de 0,9 micrômetros quadrados por segundo.

Após a identificação das moléculas de Pol I ligadas. As posições dos sítios de ligação podem ser visualizadas em células não danificadas e em células com danos no DNA. A fração de trajetórias ligadas em relação ao número total de trajetórias observadas fornece uma medida quantitativa direta da atividade de reparo do DNA pela Pol.

Uma fotoativação in vivo da proteína de fusão Pol um PA m-cherry foi realizada em células vivas de E. coli. A fotoativação podia ser limitada a um único fluoróforo PA m-cherry em uma célula; taxas mais altas de fotoativação revelaram um maior número de moléculas fluorescentes. A análise de localização foi realizada para cada quadro de um filme PALM.

A precisão foi medida utilizando moléculas imóveis em células fixadas ou moléculas ligadas em células vivas, e foi de 40 nanômetros, em concordância com a previsão teórica. Em seguida, o limiar de localização foi definido quando estava muito baixo. Picos aleatórios no ruído de fundo foram incorretamente selecionados como posições candidatas, enquanto, se o limiar fosse muito alto, alguns pontos seriam perdidos.

As localizações resultantes da Paul one ocuparam a área central da célula, recapitulando amplamente a organização espacial do nucleoide de e coli. A maioria das trilhas da Paul one em células não danificadas exibe difusão. Uma célula típica contém várias centenas de trilhas da Paul one, consistente com o número de cópias de aproximadamente 400 moléculas de Paul one por célula de e coli.

Diferentes tipos de movimento molecular podem ser identificados calculando-se os valores de DQM em uma variedade de tempos de atraso: o movimento direcionado produz uma curva parabólica. O movimento browniano é caracterizado por uma linha reta. Uma curva de difusão confinada atinge um platô, e um deslocamento da curva de DQM para partículas imóveis representa a incerteza de localização.

A curva resultante de MSD para Paul um aumentou linearmente em tempos de retardo curtos, indicando movimento browniano, e saturou em tempos de retardo mais longos devido ao confinamento celular. Utilizando esses métodos, a atividade de reparo de DNA de Paul um foi medida em resposta a danos exógenos de alquilação de DNA em células não danificadas. O histograma do coeficiente de difusão de Paul um mostra uma população dominante de moléculas em difusão.

As poucas moléculas ligadas poderiam estar envolvidas na replicação do DNA e na reparação de danos endógenos no DNA sob dano contínuo de 100 milimolares de MMS. A frequência de trilhas com coeficientes de difusão próximos a zero aumenta significativamente. Isso apoia o modelo segundo o qual mais moléculas de Paul um devem estar envolvidas na reparação do DNA na presença de agente mutagênico após este procedimento.

Outros métodos de análise de dados, como localização e agrupamento, podem ser realizados para quantificar a distribuição espacial de proteínas na célula e investigar a presença de complexos proteicos maiores envolvidos na reparação do DNA.