Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

O objetivo geral deste procedimento é estudar o perfil de metilação global e identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica usando sequenciamento de última geração. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, como a identificação dos potenciais genes de assinatura específicos da LLC, patogênese da doença e prognóstico. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece cobertura completa de todo o genoma da metilação de CpG de maneira imparcial e independente de PCR.

Para começar, use um kit de extração de DNA disponível comercialmente para isolar o DNA genômico do paciente e amostras normais de células mononucleares do sangue periférico de acordo com o protocolo do fabricante. Depois de quantificar o DNA genômico conforme descrito no protocolo de texto, diluir 5 microgramas de DNA genômico de cada amostra, até um total de 200 microlitros usando tampão TE, dando uma concentração final de 25 nanogramas por microlitro. Em seguida, execute a sonicação em tubos especialmente projetados, usando um sonicador, por um total de 30 ciclos de 30 segundos ligados e 30 segundos desligados.

Após cada cinco ciclos, gire brevemente os tubos para coletar as amostras para o fundo. Verifique a faixa de sonicação para todas as amostras usando eletroforese de DNA, conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar as esferas magnéticas de estreptavidina, primeiro suspenda-as novamente do tubo de estoque fornecido pelo kit.

Pipete suavemente as esferas para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea. Para cada cinco microgramas de amostra de DNA fragmentada, coloque 50 microlitros das contas em tubos separados, limpos e rotulados de 1,5 mililitro. Adicione 50 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X para atingir um volume final de 100 microlitros.

Coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto para permitir que todos os grânulos magnéticos se concentrem na parede interna do tubo voltado para o ímã. Remova o líquido sem tocar nas contas, usando uma pipeta de 200 microlitros. Em seguida, remova os tubos do suporte magnético, adicione 250 microlitros de tampão de lavagem de contas 1X e misture as esferas suavemente com uma pipeta.

Depois de repetir essas etapas pelo menos quatro vezes para todas as amostras, finalmente ressuspenda as amostras em 250 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X. Mantenha as amostras no gelo. Para ligar a proteína MBD-biotina aos grânulos lavados, primeiro adicione 35 microlitros de proteína aos tubos separados e aumente o volume total para 250 microlitros usando o tampão de lavagem de grânulos 1X.

Adicione 250 microlitros de proteína MBD diluída aos 250 microlitros de grânulos lavados e deixe-os em rotação de ponta a ponta à temperatura ambiente. Depois de misturar as esferas em proteína por uma hora, lave as esferas de estreptavidina magnética ligadas à proteína, colocando os tubos no suporte magnético por um minuto. Remova o líquido sem tocar nas esferas usando uma pipeta.

Em seguida, adicione 250 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X e coloque os tubos em um misturador rotativo por cinco minutos em temperatura ambiente. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes antes de ressuspender os grânulos de MBD-biotina lavados em 200 microlitros de tampão de lavagem de grânulos 1X, deixando os grânulos prontos para a captura de DNA metilado. Em um tubo limpo de 1,5 mililitro sem DNase, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem de mililitros e 180 microlitros do DNA genômico fragmentado.

Traga o volume final para 500 microlitros usando água livre de DNase. Adicione 380 microlitros de água livre de DNase aos 20 litros restantes do DNA genômico fragmentado. Congele as amostras para processá-las posteriormente e use-as como controles de DNA de entrada.

Coloque os tubos contendo esferas de MBD-biotina lavadas em um suporte magnético por um minuto e remova o líquido sem perturbar as contas. Em seguida, adicione 500 microlitros de DNA genômico fragmentado diluído em tampão de lavagem de esferas. Sele todos os tubos firmemente com filme de parafina e deixe-os durante a noite a 4 graus Celsius em um suporte de rotação de ponta a ponta de 8 a 10 rotações por minuto.

Após a reação de ligação do grânulo de DNA e MBD, coloque os tubos no rack magnético por um minuto para concentrar todos os grânulos na parede interna do tubo. Remova o líquido sobrenadante com uma pipeta sem tocar nas esferas e guarde essa fração de amostra de DNA não ligada no gelo. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem de contas 1X às contas e coloque os tubos no suporte giratório por três minutos em temperatura ambiente.

Depois de remover o líquido usando o suporte magnético, repita a lavagem mais duas vezes para remover o DNA residual não ligado. Após a lavagem final, adicione 200 microlitros de tampão de eluição com alto teor de sal fornecido no kit para eluir o DNA. Em seguida, coloque os tubos no suporte giratório por 15 minutos em temperatura ambiente.

Após a incubação, coloque-os no suporte magnético por um minuto e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo e limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de eluição com alto teor de sal às esferas e repita a eluição girando os tubos em temperatura ambiente por mais 15 minutos. Adicione o segundo eluído ao mesmo tubo contendo os 200 microlitros do primeiro eluidor.

Para precipitar o DNA, adicione um microlitro de glicogênio, 40 microlitros de acetato de sódio de três molares, pH 5,2, e 800 microlitros de etanol absoluto gelado a 400 microlitros de DNA eluído. Adicione também os reagentes aos 400 microlitros previamente congelados de amostras de controle de DNA de entrada. Misture bem os tubos por vórtice antes de incubá-los a 80 graus Celsius negativos durante a noite.

No dia seguinte, centrifugue os tubos a 12.000 vezes g e 4 graus Celsius por 30 minutos. Rejeitar o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o sedimento. Em seguida, adicione 500 microlitros de etanol a 70% e vortex os tubos.

Depois de ter agitado novamente os tubos nas mesmas condições, mas durante 15 minutos, retirar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Em seguida, centrifugue os tubos na velocidade máxima por um minuto à temperatura ambiente e remova completamente o etanol residual usando uma ponta de pipeta. Seque o pellet ao ar por cinco minutos em temperatura ambiente.

Finalmente, adicione 10 microlitros de água livre de DNase ao pellet de DNA antes de prosseguir com a quantificação do DNA metilado, sequenciamento de MBD e análise conforme descrito no protocolo de texto. A análise identificou várias regiões diferencialmente hiper e hipometiladas enriquecidas em amostras de LLC em comparação com controles normais. Essas regiões diferencialmente metiladas foram mapeadas para diferentes classes de genes codificadores e não codificantes de proteínas.

Finalmente, a análise dos dados mostrou sobreposição significativa entre as regiões diferencialmente metiladas associadas à LLC obtidas a partir de duas comparações de controle normal diferentes. Aqui, todos os locais de CpG localizados em regiões-alvo de dois genes diferencialmente metilados foram validados em um grande número de amostras de LLC usando pirosequenciamento. A faixa ideal de sonicação necessária para este método é ilustrada aqui.

Essa faixa de DNA fragmentado é ideal e mais adequada para fins de sequenciamento de próxima geração. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, os fatores cruciais que afetam a recuperação final do DNA são a qualidade e a quantidade do DNA de entrada usado e o alcance do DNA fragmentado após a sonicação.

Decidimos usar este método porque é o primeiro estudo de metilação global da LLC baseado na imunoprecipitação para enriquecer o DNA metilado cobrindo todas as regiões metiladas do genoma. As implicações dessa técnica se estendem ao prognóstico ou à terapia, pois os genes de assinatura diferencialmente metilados identificados podem servir como biomarcadores normais globais e alvos epigenéticos para a terapia. Seguindo este procedimento, o DNA metilado enriquecido pode ser usado para outras aplicações a jusante, como hibridização ou microarrays para comparar facilmente os metalomas entre duas amostras ou entidades de doenças usando um conjunto fixo de locais CpG presentes nas matrizes.

Finalmente, esta é uma técnica econômica para analisar um grande número de amostras de pacientes em busca de sequências metiladas em todo o genoma, incluindo sequências anotadas abrangendo genes codificadores de proteínas, bem como sequências não anotadas abrangendo elementos repetitivos e RNAs longos não codificantes.