Name: Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a identificar regiões CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica usando sequenciamento baseado em domínio de ligação a metil-CpG. Este método oferece cobertura genômica completa sem viés e independente de PCR.

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Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa Sueco, a Sociedade Sueca do Câncer, a Fundação Knut e Alice Wallenberg (KAW) e FoU VästraGötalandsregionen.

A aprovação ética para coletar as amostras CLL é de 2007-05-21, com o seguinte número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos os pacientes com CLL foram diagnosticados de acordo com os critérios recentemente revisados 8 , e as amostras foram coletadas no momento do diagnóstico. Os pacientes do estudo foram incluídos em diferentes departamentos de hematologia na parte ocidental da Suécia, após o consentimento por escrito ter sido obtido. Somente amostras de células mononucleares de sangue periférico de CLL (PBMC) com uma porcentagem de tumor de células leucêmicas ≥ 70% foram selecionadas neste estudo. 1. Preparações <ol><li> Isolar PBMCs para extrações de DNA de CLL e amostras de sangue periférico saudáveis ​​normais usando um kit de isolamento comercial (veja a Tabela de Materiais ), de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Autoclave tubos de 1,5 mL. Decongela todos os reagentes no kit de ligação de DNA metilado (veja a Tabela de Materiais ). &lt;/ Li&gt; <li> Use água livre de DNase para preparar 10 mL de tampão de lavagem de pérola 1x a partir do buffer de lavagem 5x fornecido pelo kit para lavar esferas e diluir a proteína MBD fornecida pelo kit. </li><li> Obtenha ou prepare os seguintes itens com antecedência: acetato de sódio 3 M, etanol absoluto e etanol a 70% para precipitação de DNA ( Tabela de Materiais ). </li></ol> 2. Extração de DNA genômico e sonicação <ol><li> Use um kit de extração de DNA comercialmente disponível ( Tabela de Materiais ) para isolar DNA genômico de amostras de PBMC pacientes e normais de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar o DNA genômico usando um espectrofotômetro a 260 nm. NOTA: A capacidade da coluna de extração de DNA é 5-6 milhões de células, máximo; Portanto, é importante usar mais de uma coluna para amostras com mais de 5 milhões de células. Eluir o ADN duas vezes em volumes iguais totalizando 100 μL de tampão Tris EDTA (TE) 10 mM. A proteína MBD-biotina utilizada no metiloKit de mineração para sequenciação de MBD não se liga ao DNA de cadeia simples. Assim, é muito importante manter o DNA eluído congelado ou a 4 ° C para preservar a sua natureza de cadeia dupla. </li><li> Diluir 5 μg de DNA genômico de cada amostra para um total de 200 μL usando tampão TE (pH 8), dando uma concentração final de 25 ng / μL. </li><li> Execute sonicação em tubos especialmente projetados usando um sonicator ( Tabela de Materiais ) por um total de 30 ciclos (30 segundos e 30 segundos por ciclo, depois de cada 5 ciclos, gire rapidamente os tubos para coletar as amostras para a parte inferior). NOTA: Isso produzirá DNA fragmentado variando entre 150 pb e 300 pb, o que é ótimo para este protocolo. </li><li> Verifique o intervalo de sonicação para todas as amostras antes de prosseguir para a próxima etapa de sequenciação de MBD executando 1 μL das amostras de DNA fragmentadas e uma escada de tamanho de DNA em um gel de agarose 2% pré-moldado comercialmente disponível usando equipamento de imagem de eletroforese de DNA. Visualize tEle usou um transiluminador UV padrão. </li></ol> 3. Preparação de grânulos antes da ligação com proteína MBD-biotina <ol><li> Ressuspenda os grânulos de estreptavidina magnética do tubo de estoque fornecido pelo kit, fazendo pipetas suavemente para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea. Não vorteie as contas ou deixe secar. </li><li> Coloque 50 μL de pérolas (para cada 5 μg de amostra de DNA fragmentada) em tubos de 1,5 mL separados, limpos e rotulados. Adicione 50 μL de 1x tampão de lavagem de contas para atingir o volume final de 100 μL. NOTA: Ao usar pequenas marcas de reação em cadeia de polimerase de 0,5 mL (PCR) para a lavagem de esferas, é usado cerca de 150-200 μL de tampão de lavagem por tubo, conforme mencionado no protocolo do kit. No entanto, no caso de tubos de 1,5 mL, adicione pelo menos 250 μL a 300 μL de tampão de lavagem por tubo para a lavagem de contas. </li><li> Coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto para permitir que todas as pérolas magnéticas se concentrem na parede interna do tuboDe frente para o ímã. Remova o líquido, sem tocar as contas, usando uma pipeta de 200 μL. </li><li> Remova os tubos do suporte magnético, adicione 250 μL de tampão de lavagem de bead 1x e misture as contas suavemente com uma pipeta. </li><li> Repita as etapas 3.3 e 3.4 pelo menos 4-5 vezes para todas as amostras e finalmente ressuspenda em 250 μL de 1x tampão de lavagem de contas. Mantenha-os no gelo. </li></ol> 4. Vinculando a proteína MBD-biotina às contas lavadas <ol><li> Adicione 35 μL de proteína MBD (7 μL para 1 μg de amostra de DNA) para separar os tubos e levar o volume total até 250 μL usando 1x tampão de lavagem de contas. </li><li> Adicione 250 μL de proteína MBD diluída aos 250 μL de pérolas lavadas e deixe-as na rotação de ponta a ponta à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Depois de misturar as contas e as proteínas durante 1 h, lave a biotina de proteína MBD ligada com esferas magnéticas de estreptavidina. <ol><li> Coloque os tubos no suporte magnético por 1 min e remova tEle liquido sem tocar as contas usando uma pipeta. Adicione 250 μL de 1x tampão de lavagem de talão e coloque os tubos em um misturador de rotação durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Repita a etapa 4.3.1 mais duas vezes e, finalmente, ressuspenda as pérolas MBD-biotina lavadas em 200 μL de 1x tampão de lavagem de contas, tornando as contas prontas para a captura de DNA metilado. NOTA: Lavar 2-3 vezes desta maneira remove todas as contas de proteína MBD não ligadas ao fundo e melhora a ligação eficiente de pérolas de proteína MBD acopladas com DNA genômico fragmentado. </li></ol> 5. Binding MBD-biotin Beads with Fragmented Genomic DNA <ol><li> Em um tubo limpo de 1,5 mL sem DNase, adicione 100 μL de tampão de lavagem 5x e 180 μL do DNA genômico fragmentado (passo 2.3). Traga o volume final para 500 μL usando água livre de DNase. </li><li> Adicione 380 μL de água livre de DNase aos 20 μL restantes do DNA genômico fragmentado e congelá-los. Use essas amostras como DN de entradaA controla e precipita-os mais tarde, juntamente com as amostras de DNA metiladas eluídas finais (ver passo 7.1). </li><li> Coloque os tubos contendo pérolas MBD-biotina lavadas (passo 4.4) em um suporte magnético por 1 min e retire o líquido sem perturbar as esferas. Adicionar 500 μL de DNA genômico fragmentado diluído no tampão de lavagem de grânulos. </li><li> Selar todos os tubos firmemente com filme de parafina e deixá-los durante a noite a 4 ° C em um suporte de rotação de ponta a ponta a 8-10 rpm. NOTA: A reacção de ligação ao ADN e à biotina-pérola pode ser feita durante 1 h à temperatura ambiente, mas deixar a 4 ° C durante a noite pode melhorar a recuperação do ADN metilado final. </li></ol> 6. Removendo o ADN não ligado e Elutando o DNA Metilado das Beads <ol><li> Após a reacção de ligação ADN e MBD-bead, coloque os tubos no suporte magnético durante 1 minuto para concentrar todas as contas na parede interior do tubo. </li><li> Remova o líquido sobrenadante com uma pipeta sem tocarAs contas e salve esta fração de amostra de DNA não ligada no gelo. </li><li> Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem de talão às pérolas e coloque os tubos no suporte giratório durante 3 min à temperatura ambiente. Coloque os tubos no suporte magnético e remova o líquido. Repita a lavagem outra duas vezes para remover o DNA residual não ligado. </li><li> Após a lavagem final, adicione 200 μL de tampão de eluição com alto teor de sal (NaCl 2,000 mM), fornecido no kit para eluir o DNA. </li><li> Coloque os tubos no suporte giratório durante 15 minutos à temperatura ambiente. Coloque-os no suporte magnético por 1 min e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo e limpo de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 200 μL de tampão de eluição com alto teor de sal e repetir a eluição por rotação dos tubos à temperatura ambiente durante 15 min. Adicione o segundo eluído ao mesmo tubo contendo os 200 μL do primeiro eluído. NOTA: Os 400 μL finais de DNA eluído total estão agora prontos para a precipitação de etanol para extrair o purificadoDNA adequado para sequenciação da próxima geração. </li></ol> 7. Precipitação de etanol e o enriquecimento de DNA metilado <ol><li> Adicionar 1 μL de glicogênio (20 μg / μL, incluído no kit); 40 μL de acetato de sódio 3 M, pH 5,2; E 800 μL de etanol absoluto gelado para 400 μL de ADN eluído e também para os 400 μL de amostras de DNA de entrada preparadas no passo 5.2. </li><li> Misture bem os tubos por vortex e incuba-os a -80 ° C durante a noite. </li><li> Centrifugue os tubos a 12.000 xg (velocidade máxima) e 4 ° C. Descarte o sobrenadante com cuidado, sem perturbar o sedimento, adicione 500 μL de etanol a 70% e vorteie os tubos. </li><li> Centrifugue novamente à velocidade máxima durante 15 min a 4 ° C e remova o sobrenadante usando cuidadosamente uma pipeta. Recupere os tubos na velocidade máxima durante 1 min à temperatura ambiente e remova completamente o etanol residual usando uma ponta de pipeta. </li><li> Secar ao ar a pastilha por 5 min no quarto tempeRature. Adicione 10 μL de água isenta de DNase ao grânulo de DNA. Proceda à quantificação de DNA metilado (passo 7.6), sequenciação de MBD (passo 7.7) e análise (seções 8 e 9). </li><li> Quantifique as amostras de DNA metiladas recuperadas final usando um kit de quantificação fluorométrica comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais ), de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Nota: Utilizando este protocolo, recuperaram-se 30-50 ng de DNA final de cada amostra. Amostras de DNA estão prontas para enviar em gelo seco para construção de biblioteca a jusante e sequenciação MBD de alto rendimento </li><li> Execute a construção da biblioteca de DNA e a seqüenciamento MBD de alto rendimento usando uma plataforma comercial ( Tabela de Materiais ), conforme descrito na referência 9 . NOTA: Para o controle de qualidade inicial do DNA metilado final, execute preparações de biblioteca usando sequenciação de pares de pares de 50 pb para todas as amostras. Processar os dados brutos para controle de qualidade pós-sequenciação, umS elaborado no passo 8.1 e processá-lo posteriormente usando abordagens de bioinformática e métodos estatísticos, conforme descrito abaixo (etapas 8.2-9.6). </li></ol> 8. Método de análise de bioinformática 1: identificação de regiões diferencialmente metiladas associadas a CLL (cllDMRs) <ol><li> Limpe as leituras obtidas de 49 pb (formato FASTQ) para adaptadores usando ferramentas de controle de qualidade disponíveis, como Trimmomatic 10 ou Cutadapt. Crosscheck a qualidade das leituras ajustadas usando o FastQC toolkit: Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adaptadores.fasta: 2: 30: 10 </li><li> Alinhe os arquivos FASTQ limpos com alinhador de genoma de leitura curta Bowtie contra um genoma de referência 11 . Especifique os parâmetros abaixo: <ol><li> Permitir até dois desajustes (parâmetro Bowtie: -v 2). </li><li> Limite o relatório aos seis melhores alinhamentos por leitura (parâmetro Bowtie: -m 6) para controlarPara leituras multi-mapeamento. Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq&gt; SAMPLE.sam NOTA: Converta os arquivos SAM gerados para amostras individuais após o alinhamento em BAM usando SAMtools. Visão de samtools -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam </li></ol></li><li> Use a análise baseada em modelo do identificador de pico CHIP-Seq (MACS) em amostras alinhadas (BAM) para prever regiões enriquecidas / metiladas dos subgrupos CLL 12 . NOTA: Comparação I: use a amostra de entrada como o grupo controle e as amostras do paciente normal e CLL como grupos de tratamento. Este passo é coletar todos os picos negativos (picos enriquecidos em Entrada / fundo). Comparação II: Use o grupo de amostra Normal como o grupo controle e o grupo de amostra do paciente CLL como grupo de tratamento. Os picos positivos obtidos são regiões hiper-metiladas de CLL e os picos negativos são regiões hipometiladas de CLL em regiões normais ou diferencialmente metiladas (DMRs). Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs </li><li> Remova os picos de fundo da Comparação I de regiões diferencialmente metiladas (DMRs) usando BEDtools 13 . Bedtools subtrair -a &lt;CLL_enriched_regions&gt; -b &lt;Input_enriched_regions&gt; </li><li> Prever a porcentagem de elementos repetidos (SINE-Alu, LINE, etc. ) enriquecidos em DMRs. <ol><li> Use fastacmd para extrair a sequência FASTA de DMRs pelas coordenadas cromossômicas do genoma de referência HG19. Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosome -L Start, End -l 50000&gt; DMRs.fasta </li><li> Use a ferramenta de linha de comando RepeatMasker para prever a porcentagem de elementos de repetição presentes na seqüência FASTA de DMRs. RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta </li></ol></li><li> Anote os DMRs previstos usando Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; com o Ensembl disponível [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] anotação de transcrição (transcrição de codificação de proteína e não codificação). AnnotatePeaks.pl DMRs.bed &lt;GENOME&gt; -gtf &lt;Ensembl ou Gencode GTF&gt; NOTA: Isso fornece informações sobre a distribuição de picos em diferentes regiões genic ( ie, promotor, exão, intrão, 3 &#39;UTRs e 5&#39; UTRs) e regiões intergênicas. Transcritos ou genes associados a DMRs são chamados de genes metilados diferencialmente (DMGs). </li><li> Use a ferramenta de enriquecimento com o banco de dados funcional atualizado ou atual para encontrar funções enriquecidas pelos DMG CLL (somente genes codificadores de proteínas) 14 . NOTA: O agrupamento de conjuntos de genes com base na anotação funcional (GeneSCF) 14 é uma ferramenta baseada em tempo real para análise de enriquecimento funcional que usa KEGG atualizado e Ontologia de genes como banco de dados de referência. </li></ol> 9. Método de Análise de Bioinformática 2: Identificando significativamente o DCL associado a CLLRegionalmente regiões metiladas (sigDMR cll) <ol><li> Siga as etapas 8.1-8.5 a partir do método I (seção 8) e use a análise de enriquecimento diferencial baseada em leitura, utilizando as ferramentas disponíveis, conforme elaborado nas etapas 9.2 a 9.6, para adicionar mais um nível de estatísticas ao pipeline de análise. </li><li> Quantifique o número de leituras mapeadas para picos individuais ou DMRs em amostras de pacientes normais e CLL usando &quot;featureCounts&quot; no pacote &quot;Subread&quot; 15 . Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam NOTA: Um filtro de qualidade de mapeamento pode ser introduzido para evitar a quantificação de leituras de qualidade ruim ( por exemplo, -Q 30). Para esta etapa, prepare arquivos SAF para os DMRs obtidos. Para obter mais informações sobre o formato de arquivo SAF, use este link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/. </li><li> Use uma tabela de leitura de leitura RAW contendo o número de leituras para os picos individuais em Normal eD CLL grupos de amostra do paciente em edgeR como a entrada 16 . NOTA: Compare os grupos de amostras de pacientes normais versus CLL para encontrar sigDMRs. Para análises de enriquecimento diferencial, siga o guia da edgeR para instruções detalhadas passo a passo (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf). </li><li> Filtre os sigDMRs usando a taxa de descoberta falsa (FDR) e a mudança de dobra de registro prevista pelo edgeR 16 . </li><li> Anotar os sigDMRs previstos usando Homer &quot;annotatePeaks.pl&quot; com a anotação de transcrição Ensembl ou Gencode disponível (transcrição de codificação de proteína e não codificação). AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf &lt;Ensembl ou Gencode GTF&gt; -CpG NOTA: Isso fornece informações sobre a distribuição de picos em diferentes regiões genic ( ie, promotor, exão, intrão, 3 &#39;UTRs e 5&#39; UTRs) e regiões intergênicas. Transcrições ou genes associados a siOs gDMRs são chamados de sigDMGs. </li><li> Use uma ferramenta de enriquecimento com o banco de dados funcional atualizado ou atual para encontrar funções enriquecidas por sigDMG CLL (somente genes codificadores de proteínas) 14 . NOTA: GeneSCF, uma das ferramentas em tempo real para análise de enriquecimento funcional, usa KEGG e Ontologia de genes como bancos de dados de referência. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O MBD-seq é uma técnica baseada em imunoprecipitação baseada em custos, que pode ser usada para estudar padrões de metilação com cobertura completa do genoma. Ambos MeDIP seq (imunoprecipitação de DNA metilado seguido de seqüenciamento) e MBD-seq resultam no enriquecimento de DNA metilado rico em CpG. No entanto, MBD-seq mostra mais afinidade para a ligação a regiões altamente ricas em CpG quando comparadas com MeDIP seq 19 . Usando um kit de enriquecimento de ligação de metilo, pode-se fragmenta...

O uso de técnicas de sequenciação da próxima geração para analisar os perfis globais de metilação do DNA tem sido cada vez mais popular nos últimos anos. Os ensaios de metilação em todo o genoma, incluindo métodos baseados em microarray e não microarray, foram desenvolvidos com base no seguinte: conversão de bisulfito de DNA genômico, digestão de enzimas de restrição sensíveis à metilação e imunoprecipitação de DNA metilado usando anticorpos específicos de CpG de metilo . A metilação aberrante do DNA é uma das características da leucemia e linfomas, incluindo a leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, vários grupos, incluindo o nosso, caracterizaram os perfis de metilação do DNA de diferentes subgrupos prognósticos de CLL e controles de células B normais e saudáveis ​​usando a conversão de bisulfito de DNA genômico, seguidos de métodos baseados em micro-matriz ou seqüenciamento de todo o genoma 1 , 2 , 3 &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4. A conversão de bisulfito de DNA genômico leva à desaminação de citosinas não modificadas para uracilo, deixando as citosinas metiladas modificadas no genoma. Uma vez convertido, o estado de metilação do DNA pode ser determinado por amplificação e sequenciação de PCR usando diferentes métodos quantitativos ou qualitativos, como a seqüenciamento de bisulfito de microorganismos ou todo o genoma (WGBS). Embora os métodos baseados em conversão de bisulfito tenham muitas vantagens e sejam amplamente utilizados em diferentes tipos de câncer para analisar os níveis de metilação do DNA, existem algumas desvantagens associadas a esta técnica. O seqüenciamento do WGBS permite a resolução de pares de bases únicas com menores quantidades de DNA e é a melhor opção para analisar um grande número de amostras. No entanto, este método não diferencia as modificações entre os níveis de 5 mC e 5 hmC no genoma 5 , 6 . Além disso, os métodos baseados em microarray não oferecem completo cSuperação do genoma. Em um estudo recente de nosso laboratório 7 , os métodos baseados em imunoprecipitação, em vez de conversão de bisulfito, foram utilizados para identificar regiões altamente diferenciadas e diferenciadas de CpG em escala global em pacientes com CLL e controles saudáveis ​​normais. Secerto de próxima geração de domínio de ligação de inmetil-CpG (MBD) (MBD-seq), o enriquecimento de DNA fragmentado de cadeia dupla depende do grau de metilação de CpG. Este método pode superar as desvantagens do método de conversão de bisulfito e também pode proporcionar cobertura genômica de metilação de CpG de maneira independente e independente de PCR. Além disso, ao contrário dos métodos de microarray baseados em conversão de bisulfito, MBD-seq pode ser usado para analisar o estado de metilação de elementos repetitivos, como longos elementos nucleares intercalados (LINEs), elementos nucleares intercalados curtos (SINEs), repetições terminais longas (LTRS) Etc. No entanto, em comparação com os métodos de conversão de bisulfito,Um protocolo MBD-seq requer uma quantidade relativamente grande de DNA de entrada. Além disso, a qualidade das leituras de seqüências e os dados dependem da especificidade, afinidade e qualidade dos anticorpos utilizados. O presente estudo explica um protocolo MBD-seq detalhado para enriquecer DNA metilado para sequenciação da próxima geração. Ele usa um kit comercial de enriquecimento de ligação de DNA metilado (listado na Tabela de Materiais ), bem como uma tubulação computacional para visualizar e interpretar dados de seqüenciamento de metilação para identificar regiões hiper e hipometiladas específicas de CLL em comparação com controles saudáveis ​​normais. Basicamente, este método faz uso da capacidade do MBD da interação da proteína MBD2 humana com CpGs metilados para extrair DNA enriquecido com CpGs metilados, e isso é seguido pelo seqüenciamento de alto rendimento do DNA metilado.

<table><tbody><tr><td>Dneasy Kit de sangue e tecido</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Solução de linfoprep</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>Nano drop 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE buffer pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de sonicação padrão Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>TPX bioruptor tubes 1.5 mL</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sódio</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase kit de combinação de imagem segura</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% Géis de agarose</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Kit de enriquecimento de DNA metilado</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Agitador/rotadores de tubos Labquake</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Etanool</td><td>Qualquer empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de DNAse</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precipitante de DNA (acetato de sódio 3M)</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Vedação segura Tubos eppendorf de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0,5 mL tubos</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma Illumina Hiseq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&nbsp; Banho</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>conceder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo rotador</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise abrangente de metilação de dna usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-cpg em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

O papel de ARNs não codificados longos (lncRNAs) em câncer está chegando à vanguarda devido ao crescente interesse em entender suas funções mecanicistas durante o desenvolvimento e progressão do câncer. Apesar disso, a regulação epigenética global dos ARNnc e as seqüências repetitivas no câncer não foi bem investigada, particularmente na leucemia linfocítica crônica (CLL). Este estudo centra-se em uma abordagem única: a captação baseada em imunoprecipitação de fragmentos de DNA metilados de cadeia dupla usando proteínas de domínio de ligação a metilo (MBD), seguido de sequenciação de próxima geração (MBD-seq). As amostras de pacientes CLL pertencentes a dois subgrupos prognósticos (5 amostras mutadas de IGVH + 5 amostras não mutadas IGVH) foram utilizadas neste estudo. A análise revelou 5.800 hipermetilados e 12.570 genes metilados diferencialmente específicos de CLL específicos de CLL (cllDMGs) em comparação com controles saudáveis ​​normais. Importante, esses resultados identificaram vários ARNnc específicos de CLL, diferencialmente metilados, reElementos petitivos e genes codificadores de proteínas com potencial valor prognóstico. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para um pipeline MBD-seq e bioinformática desenvolvido para a análise abrangente de perfis globais de metilação em regiões altamente ricas em CpG usando amostras de pacientes CLL. Finalmente, um gene codificador de proteína e um ARNnc foram validados usando pirosequenciamento, que é um método altamente quantitativo para analisar os níveis de metilação CpG para corroborar ainda mais os achados do protocolo MBD-seq.

O MBD-seq foi recentemente realizado em pacientes com CLL e controles compatíveis, normais e saudáveis ​​para identificar genes especificamente hiper e hipometilados CLL específicos 7 . O pipeline experimental e bioinformático utilizado para analisar os dados gerados a partir de CLL e amostras saudáveis ​​normais são mostrados na Figura 1A e 1B . Essas análises identificaram várias regiões diferencialmente metiladas e...

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar o perfil global de metilação e identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica utilizando sequenciamento de nova geração. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de epigenética, como a identificação de genes marcadores potencialmente específicos da LLC, bem como sua patogênese e prognóstico. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece cobertura completa e abrangente de todo o genoma para a metilação de CpG, de forma imparcial e independente de PCR.Para começar, utilize um kit comercialmente disponível de extração de DNA para isolar o DNA genômico das amostras de pacientes e de células mononucleares do sangue periférico normais, conforme o protocolo do fabricante. Após quantificar o DNA genômico conforme descrito no protocolo textual, dilua 5 microgramas de DNA genômico de cada amostra até um volume total de 200 microlitros usando tampão TE, obtendo uma concentração final de 25 nanogramas por microlitro. Em seguida, realize a sonicação em tubos especialmente projetados, utilizando um sonicador, por um total de 30 ciclos de 30 segundos ligado e 30 segundos desligado.Após cada cinco ciclos, centrifugue brevemente os tubos para recolher as amostras ao fundo. Verifique a extensão da sonicação de todas as amostras utilizando eletroforese de DNA conforme descrito no protocolo textual. Para preparar as microesferas magnéticas de estreptavidina, primeiro re-suspenda-as a partir do tubo estoque fornecido pelo kit.Pipete suavemente as microesferas para cima e para baixo para obter uma suspensão homogênea. Para cada cinco microgramas da amostra de DNA fragmentado, coloque 50 microlitros das microesferas em tubos de 1,5 mililitro separados, limpos e identificados. Adicione 50 microlitros de tampão de lavagem de microesferas 1X para atingir um volume final de 100 microlitros.Coloque os tubos em um suporte magnético por um minuto para permitir que todas as microesferas magnéticas se concentrem na parede interna do tubo voltada para o ímã. Remova o líquido sem tocar nas microesferas, utilizando uma pipeta de 200 microlitros. Em seguida, retire os tubos do suporte magnético, adicione 250 microlitros de tampão de lavagem de microesferas 1X e misture suavemente as microesferas com uma pipeta.Após repetir essas etapas pelo menos quatro vezes para todas as amostras, ressuspenda finalmente as amostras em 250 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X. Mantenha as amostras em gelo. Para ligar a proteína MBD-biotina às esferas lavadas, adicione primeiro 35 microlitros da proteína a tubos separados e complete o volume até 250 microlitros utilizando tampão de lavagem de esferas 1X.Adicione 250 microlitros da proteína MBD diluída aos 250 microlitros de microesferas lavadas e deixe em rotação contínua sob agitação lenta à temperatura ambiente. Após misturar as microesferas na proteína por uma hora, lave as microesferas magnéticas de estreptavidina ligadas à proteína colocando os tubos no suporte magnético por um minuto. Remova o líquido sem tocar nas microesferas usando uma pipeta.Em seguida, adicione 250 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X e coloque os tubos em um agitador rotativo durante cinco minutos à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem mais duas vezes antes de re-suspender as esferas de MBD-biotina lavadas em 200 microlitros de tampão de lavagem de esferas 1X, deixando-as prontas para a captura de DNA metilado. Em um tubo novo de 1,5 mililitro livre de DNase, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem de esferas por mililitro e 180 microlitros do DNA genômico fragmentado.Complete o volume final até 500 microlitros usando água livre de DNase. Adicione 380 microlitros de água livre de DNase aos 20 litros restantes do DNA genômico fragmentado. Congele as amostras para posterior processamento e use-as como controles de DNA de entrada.Coloque os tubos contendo as microesferas de MBD-biotina lavadas em um suporte magnético por um minuto e remova o líquido sem perturbar as microesferas. Em seguida, adicione 500 microlitros de DNA genômico fragmentado diluído em tampão de lavagem de microesferas. Feche bem todos os tubos com filme de parafina e deixe-os durante a noite a 4 graus Celsius em um agitador rotativo de ponta a ponta a 8 a 10 rotações por minuto.Após a reação de ligação do DNA aos grânulos de MBD, coloque os tubos no suporte magnético por um minuto para concentrar todos os grânulos na parede interna do tubo. Remova o sobrenadante com uma pipeta sem tocar os grânulos e conserve esta fração da amostra de DNA não ligado em gelo. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de lavagem de grânulos 1X aos grânulos e coloque os tubos no agitador rotativo por três minutos à temperatura ambiente.Após remover o líquido utilizando o suporte magnético, repita a lavagem mais duas vezes para remover o DNA não ligado residual. Após a lavagem final, adicione 200 microlitros do tampão de eluição de alta salinidade fornecido no kit para eluir o DNA. Em seguida, coloque os tubos no suporte rotativo por 15 minutos à temperatura ambiente.Após a incubação, coloque-os no suporte magnético por um minuto e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo limpo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão de eluição com alta concentração de sal às esferas e repita a eluição girando os tubos à temperatura ambiente por mais 15 minutos. Adicione o segundo eluato ao mesmo tubo contendo os 200 microlitros do primeiro eluato.Para precipitar o DNA, adicione um microlitro de glicogênio, 40 microlitros de acetato de sódio três molar, pH 5,2, e 800 microlitros de etanol absoluto gelado a 400 microlitros de DNA eluído. Adicione também os reagentes às amostras controle de DNA de entrada previamente congeladas, de 400 microlitros. Misture bem os tubos por vortex antes de incubá-los a menos 80 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, centrifugue os tubos a 12.000 × g e 4 graus Celsius por 30 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione 500 microlitros de etanol a 70% e vortexe os tubos.Após centrifugar novamente os tubos nas mesmas condições, mas por 15 minutos, remova o sobrenadante cuidadosamente utilizando uma pipeta. Em seguida, centrifugue os tubos em velocidade máxima por um minuto à temperatura ambiente e remova completamente o etanol residual utilizando a ponteira de pipeta. Seque o pellet ao ar por cinco minutos à temperatura ambiente.Finalmente, adicione 10 microlitros de água livre de DNase ao pellet de DNA antes de prosseguir para a quantificação do DNA metilado, sequenciamento MBD e análise conforme descrito no protocolo textual. A análise identificou várias regiões hiper e hipometiladas diferencialmente enriquecidas em amostras de LLC em comparação com controles normais. Essas regiões metiladas diferencialmente foram mapeadas para diferentes classes de genes codificadores de proteínas e não codificadores.Por fim, a análise dos dados mostrou uma sobreposição significativa entre as regiões diferencialmente metiladas associadas à LLC obtidas a partir de duas comparações diferentes com controles normais. Aqui, todos os sítios CpG localizados nas regiões-alvo de dois genes diferencialmente metilados foram validados em um grande número de amostras de LLC utilizando pirosequenciamento. A faixa ideal de sonicação necessária para este método é ilustrada aqui.Essa faixa de DNA fragmentado é ideal e mais adequada para fins de sequenciamento de nova geração. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em dois dias, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, os fatores cruciais que afetam a recuperação final do DNA são a qualidade e a quantidade do DNA de entrada utilizado e a faixa do DNA fragmentado após a sonicação.Decidimos utilizar este método porque é o primeiro estudo global de metilação em LLC baseado na imunoprecipitação para enriquecer o DNA metilado, cobrindo todas as regiões metiladas ao longo do genoma. As implicações dessa técnica estendem-se ao prognóstico ou à terapia, pois os genes com assinaturas de metilação diferencial identificados podem servir como biomarcadores normais globais e como alvos epigenéticos para tratamento. Após este procedimento, o DNA metilado enriquecido pode ser utilizado em outras aplicações posteriores, como hibridização ou realização de microarranjos, para comparar facilmente os metailomas entre duas amostras ou entidades patológicas utilizando um conjunto fixo de sítios CpG presentes nos arranjos.Por fim, esta é uma técnica economicamente viável para analisar um grande número de amostras de pacientes em busca de sequências metiladas ao longo do genoma, incluindo sequências anotadas que abrangem genes codificadores de proteínas, bem como sequências não anotadas que abrangem elementos repetitivos e RNAs longos não codificantes.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

O sequenciamento de amplicon de bissulfito (BSAS) é um método para quantificar a metilação da citosina em regiões genômicas alvo de interesse. Este método usa conversão de bissulfito emparelhada com amplificação de PCR de regiões-alvo antes do sequenciamento de próxima geração para produzir quantificação absoluta da metilação do DNA em um nível específico de base.

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Descrito aqui está o uso de um método específico de amplificação de sondas para analisar os níveis de metilação de elementos LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de osteossarcoma. A ultracentrífugação, procedimento popular para separar vesículas extracelulares do soro bovino fetal, também é demonstrado.

Análise de metilação LINE-1 em células-tronco mesenquimicas tratadas com vesículas extracelulares derivadas de Osteosarcoma

Aqui, descrevemos um procedimento para análise genoma de metilação de DNA em cânceres gastrointestinais. O procedimento é de relevância para estudos que investigam relações entre padrões de metilação de genes e fatores que contribuem para a carcinogênese em cânceres gastrointestinais.

Análise genoma-em todo o DNA da metilação de DNA no câncer gastrointestinal

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

O presente estudo descreve o fluxo de trabalho para gerenciar dados de metilação de DNA obtidos por tecnologias de microarray. O protocolo demonstra passos desde a preparação da amostra até a análise de dados. Todos os procedimentos são descritos em detalhes, e o vídeo mostra os passos significativos.

Preparação amostral para análise bioinformática da metilação de DNA: Estratégia de Associação para Obesidade e Estudos de Traços Relacionados

Aprenda a identificar regiões CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica usando sequenciamento baseado em domínio de ligação a metil-CpG. Este método oferece cobertura genômica completa sem viés e independente de PCR.

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica (Vídeo) | JoVE Journal

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

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