Name: Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprenda a técnica de sequenciamento por bisulfito de representação reduzida aprimorada para análise de metilação de DNA com resolução de pares de bases em regiões ricas em GC.

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Agradecemos a todos os autores do relatório ERRBS original. Agradecemos a Mame Fall pela assistência técnica. Agradecemos ao Weill Cornell Medical College Epigenomics Core pelos serviços técnicos e assistência. O trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudos Judah Folkman da Fundação Sass, um K08CA169055 NCI e ASH-AMFDP12005 para FGB, NIH R01HG006798 e R01NS076465, financiamento do Irma T. Hirschl e Monique Weill-Caulier Charitable Trusts e STARR Consortium (I7-A765) para CEM, e uma doação LLS SCORE (7006-13) para AMM.

Todos os procedimentos executados são aprovados pela Escola de Medicina da Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Indiana e siga Instituto Nacional de diretrizes de saúde. 1. Técnica Cirúrgica <ol><li> Manter a técnica asséptica durante esse procedimento usando luvas estéreis, instrumentos e um campo cirúrgico estéril acordo com as diretrizes do NIH 25. Esterilizar ferramentas antes de iniciar a cirurgia por autoclavagem-los (ver Tabela de Specific Reagentes / Equipamentos para a lista completa). Use um esterilizador de contas de vidro para esterilizar instrumentos durante a operação. </li></ol> 2. Anestesia e Preparação <ol><li> Anestesiar o rato em uma caixa de anestesia com uma mistura de 0,9 L / min de oxigénio e 2,5% de isoflurano utilizando um sistema de isoflurano vaporizador veterinária. Certifique-se de que o mouse não responder às mudanças na posição do corpo antes de removê-lo da caixa. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para o mouOs olhos de si para protegê-los de secar. </li><li> Desligue o fluxo de gás a partir da caixa para o cone do nariz. Posicione o mouse diretamente em seu lado esquerdo em uma almofada aquecida coberta com um bloco cirúrgico e papel absorvente banco com o seu nariz e boca dentro do cone. Monitorar continuamente o ritmo de respiração do mouse e taxa e ajustar os níveis de isoflurano, conforme necessário (entre 2,5-3% de isoflurano) para manter um nível adequado de anestesia, e usar o aperto reflexo toe para confirmar sedação total. </li></ol> 3. Abordagem Cirúrgica <ol><li> Harmonizar e concentrar o estereoscópio com o campo cirúrgico. Ajustar o cone do nariz e fita-lo para baixo de modo que ele está posicionado ao longo da borda do campo visual. </li><li> Com o rato encontra-se no seu lado esquerdo, fixe a ponta da orelha direita para o cone de nariz, expondo a área atrás da orelha, onde a incisão será feita. Certifique-se de que a veia auricular posterior viaja horizontalmente através da orelha. Note-se que o posicionamento correto de tele animal ea gravação do ouvido são cruciais, a fim de encontrar rapidamente o nervo facial. </li><li> Molhar a pele em e atrás da orelha com 70% de etanol e raspar o local da cirurgia usando uma lâmina de barbear ou bisturi. Pré-molhar a pele torna a depilação mais fácil nesta localização anatômica. </li><li> Limpar a pele com uma solução de iodo, tais como Betadine limpeza cirúrgica (7,5% de povidona-iodo), seguido de etanol a 70%. Repetir esta lavagem mais duas vezes para desinfectar completamente a área. </li><li> Para determinar onde fazer a incisão, rastrear a veia auricular posterior da orelha caudalmente para a área posterior à protuberância orelha. Com uma tesoura primavera, fazer uma incisão 4 milímetros 2 - 3 mm posterior à protuberância. </li><li> Dissecar através da gordura subcutânea e fáscia usando dissecção romba. Evitar corte directo com as tesouras pois os vasos ou o tecido muscular pode ser facilmente danificado. </li><li> Se ocorrer sangramento, faça pressão no local da cirurgia com um cotonete estérildurante pelo menos 30 seg. Se ocorrer perda de líquido significativo, injetar o mouse por via intraperitoneal com até 0,5 ml de solução salina estéril 0,9% usando uma agulha G 25 ou 27. </li><li> Use vários marcos importantes, o nervo acessório espinhal, canal auditivo, e anterior do músculo digástrico (descrito abaixo), para localizar o nervo facial. Dissecar em torno destes pontos de referência até os ramos do nervo facial são visualizados. O nervo aparece como uma estrutura sólido branco significativo quando se revela e uma camada de fáscia adere a ele as estruturas subjacentes. <ol><li> Encontre o nervo acessório espinhal, que viaja a partir da porção caudal do crânio na inervação do músculo trapézio, uma vez que a gordura subcutânea e fáscia foram dissecados. O nervo facial é profundo do nervo acessório espinhal. </li><li> Encontre o canal auditivo cartilaginoso que parece branco perolado e pode ser visto rostral ao nervo facial. </li><li> Encontre o ventre muscular do músculo digástrico anterior, que se situa no topo de e caudal ao nervo facial. </li></ol></li><li> Quando os principais ramos do nervo facial são visualizados, rastreá-las dorsal para encontrar sua origem a partir do forame estilomastóideo. Usando uma pinça de ponta fina Dumont # 5/45 para manter o local da cirurgia aberta, avançar as dicas de tesoura primavera seguinte caminho do nervo, em seguida, passar a pinça dorsal para manter a área recém-avançado aberto. </li><li> Visualize o tronco do nervo facial com o zigomático, bucal e ramos mandibulares marginais neste momento. NOTA: O ramo temporal será encontrado mais perto do forame. Os ramos do nervo mandibular marginais nas suas partes superior e inferior mais perto da maxila, assim os ramos do nervo não será visível a este nível. <ol><li> Se a execução de uma secção do nervo, estabilizar o nervo suavemente com a pinça de ponta fina e cortar o nervo com a tesoura primavera. Evite aplicar muita tração para o nervo com a pinça para evitar avulsing o nervo do tronco cerebral. Empurreos tocos de distância um do outro, ou cortar e remover uma porção do nervo distal para assegurar que não pode ocorrer a reconexão. </li><li> Se a execução de uma lesão por esmagamento, utilize Dumont # 5/45 fórceps para comprimir o nervo por 30 segundos usando constante pressão para cortar todos os axônios, em seguida, repita esta paixão com um segundo ângulo perpendicular ao primeiro local do esmagamento. Evite aplicar quantidades variáveis ​​de pressão durante a 30 seg esmagamento, caso contrário, o prejuízo será inconsistente entre animais. </li></ol></li></ol> 4. Encerramento e Recuperação <ol><li> Reposicionar a gordura e músculos sobre as estruturas subjacentes. </li><li> Harmoniza as bordas da incisão e fechar a ferida utilizando um grampo de feridas 7,5 milímetros. Suturas ou cola também são aceitáveis ​​para o fechamento da ferida. Analgésicos pós-cirúrgicas podem ser fornecidos no momento. </li><li> Remova a fita da orelha do mouse. Desligue o fluxo de isoflurano e permitir que o mouse para respirar oxigênio puro por 30 segundos a 1 minuto. Place o rato em uma gaiola vazia, sem roupa de cama para se recuperar da anestesia. </li><li> Quando o mouse é recuperado, analisar seu comportamento em busca de sinais de confirmação de paralisia facial. Os bigodes será paralisado e em ângulo de volta para o rosto, o nariz será desviado, eo olho não piscará em resposta a um sopro de ar. </li><li> Animais Casa conjuntamente após a cirurgia se eles são do sexo feminino. Evite alojar ratos machos, em conjunto, porque eles são mais agressivos e tendem a remover forçosamente clips ferida do seu cagemate, o que leva à infecção. Fornecer analgésicos pós-cirúrgicas, neste momento, se necessário. </li><li> Monitorar os ratos uma vez por dia durante vários dias após a operação para garantir que nenhuma infecção ou outra complicação ocorre no pós-operatório. Remover agrafos 7-10 dias após a cirurgia, caso não tenham caído por conta própria. </li><li> Aplicar lubrificante pomada no olho afectado diariamente para evitar complicações na córnea, ou até que o reflexo de piscar de olhos é rerecobertos ou até que a eutanásia. </li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Os dados de resolução rendimentos de pares de bases de protocolo apresentada de metilação da citosina em regiões genômicas de interesse biológico. O protocolo como escrito é optimizada para 50 ng de material de partida, no entanto, ele pode ser adaptado para tratar uma variedade de material de entrada (5 ng ou mais) 26. Isto irá necessitar de ajustes de algumas das etapas do protocolo como pode ser visto na Tabela 6. As bibliotecas são passíveis de ERRBS emparelhado sequenciação extremidade e uma cobertura adicional genómico também pode ser conseguida por sequenciação lê mais do que 51 ciclos. Seqüenciamento multiplexado vai oferecer um protocolo de menor custo por amostra, no entanto, isso vai resultar em uma cobertura reduzida por site CpG representado nos dados (Figura 5 e Tabela 8), e não vai render profundidade suficiente de cobertura para realizar análises que requerem alta cobertura por sítio CpG (por exemplo, como descrito por Landan et ai. 33). Finalmente, este protocolo (ou qualquer Protoco à base de bissulfitol) não pode distinguir entre metil-citosina e de citosina hidroximetil-46,47. No entanto, os dados gerados podem ser integrados com outro protocolo resulta 48,49 para delinear as diferentes modificações, e outras modificações citosina recentemente relatado 50, eles devem ser de interesse. Bibliotecas de alta qualidade irá aparecer como mostrado na Figura 3A-C, e uma vez reunidas para sequenciação origina um traço tal como mostrado na Figura 3G (traço vermelho) representando contribuições molares iguais de ambas as fracções da biblioteca. Falha preparação da biblioteca pode resultar de qualquer passo durante o processo. Se DNA degradado é processada que irá resultar em bibliotecas que não são enriquecidas em fragmentos MspI e, portanto, em baixa cobertura CpG utilizando os parâmetros de sequenciamento descritos neste protocolo. Se uma enzima é não-funcional ou excluídas inadvertidamente uma das reacções, o protocolo não irá produzir a biblioteca esperado. Se a rea ​​ligaduracção é ineficiente, adaptadores estão em uma concentração mais elevada do que o esperado, e / ou a concentração de iniciadores utilizado é um reagente limitante para as etapas finais de amplificação, pode ocorrer falha na biblioteca. Adaptadores excesso (visto como um picos em ~ 150 pb em resultados Bioanalyzer; Figura 3D-F) na biblioteca também irá interferir com a sequenciação devido à aglomeração indiscriminada tanto da biblioteca e adaptadores em excesso. Embora uma tal biblioteca pode sequenciar aparentemente normalmente, uma porção significativa da lê será meramente sequências adaptadoras. Se os adaptadores em excesso são observados em uma biblioteca, o melhor é repetir a preparação biblioteca se o material está disponível usando material de entrada ideal para o adaptador relações de quantidades. Finalmente, para assegurar a eficiência de amplificação por PCR das bibliotecas, as fracções da biblioteca mais baixas e mais altas são mantidas como amostras separadas em toda a conversão de bissulfito e passos de enriquecimento de PCR. Não fazer isso gera eficiência diferencial de amplificação durante a PCR reacção das fracções superiores e inferiores (como visto na Figura 3G azul traço) e o potencial para a representação desigual do respectivo locus genómico coberto em cada fracção da biblioteca durante a sequenciação. O utilizador pode optar por incluir um passo de PCR quantitativo imediatamente após a conversão para além de bissulfito de titulação de ciclos de PCR ideais necessárias para amplificar as bibliotecas sendo gerado. ERRBS protocolo de preparação biblioteca tem vários passos-chave em que são recomendados reagentes específicos. No passo final de reparação, o uso de uma mistura de dNTP quatro nucleótidos permite a fim de reparação de quaisquer produtos que não contenham a saliência CG, tais como os resultantes de MspI actividade enzimática estrela e fragmentos de ADN cortados presentes na amostra original do ADN. Isto resulta numa melhoria representação de CpG nos resultados. No passo de ligação é crítica a utilização de uma ligase de alta concentração (2.000.000 unidades / ml) e adaptadores metilados para assegurar que a ligadura Reactiem é eficiente e que a conversão de bissulfito não influencia as sequências essenciais para o alinhamento preciso do adaptador de dados. No passo de PCR, usando uma polimerase capazes de amplificar fragmentos de DNA rico em GC tratados com bissulfito é necessária para uma elevada especificidade. Finalmente, para garantir a eliminação dos adaptadores em excesso e os iniciadores, SPRI purificação talão (por exemplo: Agencourt AMPure XP) é recomendado em vez de ensaios baseados em colunas de ligação e os isolamentos de produtos de PCR. A fim de gerar dados de alta qualidade, é importante para garantir a conversão eficiente bissulfito. O controle apresentou oferece ao usuário a capacidade de determinar a eficiência da conversão antes da sequenciação. Como uma alternativa, um ADN não-humana, tais como DNA de lambda pode ser usado como um controlo interno (espeta-in). Devido às diferenças de espécies, este tipo de controlo pode ser directamente incluído na sequenciação a jusante (por exemplo, tal como utilizado por Yu, et ai. 34). No entanto, se o pico de i-ins utilizados, que não pode ser usado para determinar a eficiência de conversão antes da sequenciação, a menos biblioteca amplificada exclusivamente e sequenciado antes da sequenciação biblioteca de forma independente. As taxas de conversão são determinadas com base no estado de metilação em locais que não de CpG. Isto pode não ser adequado para utilização no contexto de alta metilação da citosina no contexto não CpG (por exemplo, células estaminais embrionárias) e amostras paralelas ou qualquer outro meio de avaliar a eficiência de conversão pode ser utilizado para este fim. Há algumas ressalvas para o endereço que são exclusivos para o seqüenciamento de bibliotecas ERRBS. As primeiras três bases das fracções da biblioteca sequenciados são quase uniformemente não aleatória devido ao local de reconhecimento do MspI corte (C ^ CGG; ver Figura 4B, C). Isso resulta na possibilidade de perda de dados significativa devido à baixa qualidade lê resultantes de uma má localização do cluster apesar de aparente alta densidade de agrupamento durante o seqüenciamento. Para superar essa barreira,incluir uma biblioteca de alta complexidade em uma pista independente (controle phix ou outro tipo de biblioteca) como uma pista de controle dedicado. Bibliotecas alta complexidade têm extremidades contendo uma representação equilibrada de A, C, T e G nas quatro primeiras bases sequenciadas. Faixas de controlo adequados incluem bibliotecas como RNA-seq, ChIP-seq, seqüenciamento do genoma inteiro, ou um controle oferecido pelo fabricante de máquinas de seqüenciamento (eg v3 Controle phix). Quando designado como uma pista de controlo para o respectivo prazo de sequenciação, que pode servir como base para a geração de matriz que é utilizado durante as primeiras quatro bases da sequenciação para detectar posições de fragmentação. A maior qualidade lê capturado elevará a cobertura média por local CpG em 5,2 (n = 4). Alternativamente, esta dificuldade técnica, também podem ser ultrapassadas pela utilização de uma abordagem de sequenciação escuro como previamente descrito 23. Outros critérios de sequenciamento seguir os procedimentos operacionais padrão por protocolos do fabricante. Finalmente, a cobertura por CpG chosen para análise de dados será guiado pelo usuário e, em parte, pelas questões biológicas de interesse. Limite de cobertura de 10x oferece uma abordagem de análise de alta cobertura, no entanto, este limite pode ser reduzido que deveria ser de interesse. Uma discussão completa de análise de dados ERRBS está além do escopo deste artigo, no entanto, diferencialmente cytosines e regiões metilados pode ser determinada utilizando ferramentas de código aberto 31,51-53. Análise considerações adicionais e abordagens têm sido bem descrita 54,55, eo leitor é encorajado a procurar a literatura para instrumentos mais adequados para a análise planejada. Comparado a outros métodos publicados, ERRBS oferece um protocolo de quatro dias, que quando realizada como rendimentos descritas altas taxas de reprodutibilidade. Ele foi validado em comparação com o padrão ouro MassARRAY EpiTYPER 26, é para dados de alta cobertura de baixo custo, e é adaptável para diversos materiais de entradaquantidades (favoráveis ​​para processamento de amostras clínicas e outros tipos de células de baixa frequência) e as abordagens de sequenciamento. Ele oferece resolução de pares de bases em loci biologicamente relevante e pode ser usado em integrativa analisa com outras técnicas de perfil fator de todo o genoma de transcrição, a remodelação da cromatina, marcas epigenéticas e outras modificações citosina de interesse. Uso de dados ERRBS em tais estudos podem contribuir para uma abordagem molecular abrangente e permitir alta analisa dimensional no estudo de modelos biológicos e doenças humanas.

A metilação do DNA em citosina (5-metilcitosina) é uma marca epigenética crítico em células de mamífero para uma variedade de processos biológicos, incluindo, mas não se limitando a impressão, inactivação do cromossoma X, desenvolvimento, e da regulação da expressão do gene 1-8. O estudo dos padrões de metilação do DNA em distúrbios malignos e outros determinou padrões específicos de doenças e contribuiu para o entendimento da patogênese da doença e potenciais descobertas biomarcadores 17/09. Há muitos protocolos que interrogam o epigenoma para estado de metilação do DNA. Estes podem ser divididos em baseada em afinidade, à base de enzima de restrição e ensaios baseados em bissulfito de conversão que utilizam plataformas de microarray de sequenciação ou a jusante. Além disso, existem alguns protocolos que colmatar estas categorias gerais, incluindo, mas não limitado a, combinado análise de restrição Bisulfite 18 e Redução Representação Bisulfite Sequencing (RRBS 19). </p&gt; RRBS foi originalmente descrito por Meissner et al. 19,20. O protocolo introduzido um passo para enriquecer regiões genómicas rico em GC, seguida de sequenciação bissulfito, o que resultou em dados quantitativos de resolução de base de par que é de custo eficaz 21,22. As regiões ricas em GC são alvo da enzima de restrição MspI (C ^ CGG), e metilação da citosina é resolvido por conversão bissulfito de citosinas (desaminação de citosinas não modificados para uracilo), seguido de reacção em cadeia da polimerase (PCR). RRBS coberto a maioria dos promotores de genes e ilhas de CpG em uma fracção da sequência necessária para um genoma inteiro; no entanto RRBS tinha cobertura limitada de margens CPG e outras regiões intergênicas de relevância biológica. Vários grupos publicaram atualizado protocolos RRBS desde o relatório original que melhorar a metodologia e cobertura resultante dessas regiões genômicas 23-25. Reforçada Representação Redução Bisulfite sequmentavam (ERRBS) inclui modificações de preparação da biblioteca e um alinhamento de dados alternativo de aproximação 26 quando comparado com RRBS. ERRBS resultou em um maior número de CpGs representadas nos dados gerados e aumento da cobertura de todas as regiões genômicas interrogados 26. Este método tem sido utilizado para resolver padrões de metilação de ADN em paciente humanos e outros espécimes animais 26-30. O protocolo descrito ERRBS ofertas detalhes sobre todos os passos necessários para a realização e os dados foram gerados utilizando ADN humano representativo (amostras foram obtidas a partir previamente relatados, identificada de 31 amostras de pacientes, e uma amostra de medula óssea CD34 + de um dador humano normal). O protocolo inclui um processo automatizado de selecção do tamanho, o que reduz o tempo de processamento por amostra e permite uma maior precisão na selecção do tamanho da biblioteca. O protocolo combina uma série de técnicas de biologia molecular estabelecidas. ADN de elevado peso molecular é digerido wom uma enzima de restrição metilação-insensitive (MspI), seguido pelo final do reparo, A-tailing, e ligadura de adaptadores metilados. Selecção do tamanho dos fragmentos rico em GC é seguido por conversão bissulfito e a amplificação por PCR antes da sequenciação. Conversão Bisulfite tem sido descrito anteriormente 32 e revisão detalhada de análise e aplicações de dados está além do escopo deste artigo, no entanto recomendações e referências são incluídos para uso dos leitores. O protocolo pode ser realizada ao longo de quatro dias, e é passível de pequena entrada (50 ng ou menos) quantidades de material. O protocolo como descrito produz dados com elevada cobertura por sítio CpG suficiente não só para a região do sítio de metilação e determinações diferenciais, mas também para a detecção de polimorfismo epigenética como descrito por Landan, et ai. 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Tampão de reação para enzima MspI; passo do protocolo 1.2</td></tr><tr><td>Solução de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibrado com 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; consulte as instruções de segurança e manuseio em http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Consulte as instruções de segurança e manuseio em http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 provas, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Tampão EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>preparar uma solução 1 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tris- Ácido etilenodiaminotetracético (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Diluir para 1x solução tampão de acordo com as recomendações</td></tr> <tr><td>do fabricanteTampão de Reação de DNA Ligase T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>concentração de 10x</td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP) Solução Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada nucleotídeo</td></tr><tr><td>T4 DNA Polimerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>DNA Polimerase I, Fragmento Grande (Klenow) New</td><td>England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de Purificação</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Usado para purificação de produtos de DNA na etapa de protocolo 2.3</td></tr><tr><td>2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Kit de Purificação de PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Usado para purificação de produtos de DNA na etapa de protocolo 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Adaptador de Metilação Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Usado em seções de protocolo que implementam etapas de purificação de esferas magnéticas (etapas 4.3 e 8.2). Equilibre à temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>de Gel Pippin Prep, 2% Agarose, sem corantes</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>com padrões internos</td></tr><tr><td>Certificado Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borato-EDTA (TBE) tampão</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Solução de brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Corante de Carregamento de Gel, Laranja (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi&nbsp; Lâmina&nbsp; Não.&nbsp; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Extração de Gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Usado na etapa 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternativa para a etapa 6.2</td></tr><tr><td>Padrão Universal de DNA Humano Metilado</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Usado como controle de conversão de bissulfito</td></tr><tr><td>Sistema de PCR de Alta Fidelidade FastStart</td><td>Kit</td><td>de Ensaio de</td> Alta Sensibilidade Roche 03553426001 <td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA</td> Life <td>Technologies</td><td>Q32854</td><td>Um ensaio de quantificação de DNA baseado em fluorescência; usado nas etapas de protocolo 1.1, 9.1 e 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNA de Alta Sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Fluorômetro Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Kit de Cluster TruSeq SR da Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Sample prep</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Adaptadores com código de barras usados para multiplexação de bibliotecas; Consulte Arquivo suplementar para protocolo de multiplexação.</td></tr><tr>Misturador <td></td><td></td><td></td>de<td>vórtice</td></tr> <tr><td>de microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco seco Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banho</td><td></td><td></td><td></td>de água</tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td><td></td>de eletroforese em gel</tr><tr><td>Fonte de alimentação de</td><td></td><td></td><td></td>eletroforese</tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Transiluminador <td></td><td></td><td></td><td>de luz UV ou azul</td></tr></tbody></table>

aprimorada redução representação bisulfite sequencing para a avaliação de metilação de dna na resolução de pares de bases

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Padrão de metilação do ADN de mapeamento é fortemente estudada em tecidos normais e doentes. Uma variedade de métodos tem sido estabelecido para interrogar os padrões de metilação da citosina em células. Representação reduzida do genoma bissulfito sequenciamento completo foi desenvolvido para detectar padrões de pares de bases resolução metilação da citosina quantitativos em loci genômico rico em GC. Isto é conseguido através da combinação da utilização de uma enzima de restrição seguida por conversão de bissulfito. Reforçada reduzida Representação Bissulfito Sequencing (ERRBS) aumenta os loci genómico biologicamente relevante coberto e foi usado ao perfil metilação da citosina no ADN de humano, rato e outros organismos. ERRBS inicia com enzimas de restrição para gerar fragmentos de ADN de baixo peso molecular para utilização na preparação da biblioteca. Estes fragmentos são submetidos a construção da biblioteca de padrão para a próxima geração de sequenciação. Conversão Bisulfite de citosinas não metiladas anteriores da amplificati definitivana etapa permite a resolução de base quantitativa dos níveis de metilação de citosina em loci genômica coberto. O protocolo pode ser concluído no prazo de quatro dias. Apesar de baixa complexidade nas três primeiras bases sequenciadas, bibliotecas ERRBS produzir dados de alta qualidade ao usar uma pista controle seqüencial designado. Mapeamento e análise bioinformática é então realizada e produz dados que podem ser facilmente integrado com uma variedade de plataformas de todo o genoma. ERRBS podem utilizar pequenas quantidades de material de entrada tornando viável para processar amostras clínicas humanas e aplicável em uma variedade de aplicações de pesquisa. O vídeo produzido demonstra etapas críticas do protocolo ERRBS.

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequenciamento para resolução de pares de bases D-N-A-C-P-G, análise de metilação baseada na digestão de enzimas de restrição combinada com citosina por conversão de sulfito. Isso é feito realizando primeiro a digestão da enzima de restrição MSP de DNA de alta qualidade, seguida pelo reparo final, um rejeito e ligação de adaptadores metilados. O próximo passo é realizar por conversão de sulfito em fragmentos de tamanho selecionado após por conversão de sulfito.Os fragmentos são amplificados usando PCR. A etapa final é realizar o controle de qualidade e sequenciamento, seguido de visualização e análise de dados. Em última análise, a representação reduzida aprimorada do sequenciamento de bissulfito detecta a resolução quantitativa do par de bases dos padrões de metilação da citidina em loci genômicos ricos em CG.A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos de metilação de DNA, como microarrays, é que ela pode utilizar pequenas quantidades de material de entrada para gerar dados de metilação D-N-A-C-P-G de alta cobertura na resolução do par de bases e locais biologicamente relevantes. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos interessados em explorar padrões epigenéticos além das regiões cobertas pelos ensaios tradicionais. Estávamos interessados em desenvolver essa técnica para fazer a transição de microarrays para a geração de dados de metilação de DNA com resolução de pares de bases que pudessem ser integrados aos dados gerados a partir de outras técnicas de próxima geração.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética. Por exemplo, padrões epigenéticos e heterogeneidade em amostras biológicas em comparação com controles normais ou outros estados de doença. Geralmente, os indivíduos novos neste método acharão desafiador devido à duração do procedimento, aos inúmeros requisitos específicos e às características únicas de sequenciamento das bibliotecas geradas Mamie fall.Um especialista em pesquisa em nosso laboratório estará ajudando a demonstrar o procedimento Para iniciar este protocolo. Primeiro, prepare alíquotas purificadas de amostras de DNA genômico que sofreram uma digestão de enzima de restrição MSP, uma reação de reparo de extremidade romba e uma única adição de nucleotídeo nas três extremidades principais. Neste ponto, os produtos de DNA estarão prontos para as ligaduras do adaptador para começar a transferir 10 microlitros da amostra A-A-L-D-N-A para um tubo de PCR de 0,2 mililitro e colocar o tubo no gelo.Além disso, coloque uma alíquota das moléculas adaptadoras no gelo. Em seguida, prepare a mistura de reagentes de ligação no gelo. Adicione o reagente de ligação e as moléculas adaptadoras à amostra de DNA e pipete para cima e para baixo algumas vezes para misturar.Coloque um tubo de PCR em um termociclador e permita que a reação de ligadura prossiga durante a noite a 16 graus Celsius no dia seguinte. Purifique os produtos de ligação usando um kit de extração de DNA em fase sólida à base de esferas magnéticas ou coluna de sílica. Na última etapa do processo de purificação.Eluir o DNA adicionando 30 microlitros de água livre de DNAs. O produto de DNA purificado pode ser armazenado a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário para amostras, que começaram com o DNA total de 25 nanogramas ou mais. Use um aparelho automatizado de extração de gel, como o PI e prepare-se, para selecionar produtos ligados com comprimentos entre 150 pares de bases e 400 pares de bases.Certifique-se de excluir corantes de visualização de DNA, como brometo de Ethereum ou verde cibernético do agros, pois eles podem alterar as propriedades de migração de DNA dos fragmentos ligados ao adaptador bifurcado. Os protocolos padrão de seleção de tamanho baseados em gel agros também podem ser usados para esta etapa do protocolo para configurar a eletroforese de DNA em um aros sem corante de 2% de pippin. Crie um novo protocolo no console Pippin Prep e selecione a opção de marcador L de 2% DF como o de sua escolha.Em seguida, ative a opção usar padrões internos e verifique se o número da pista de referência corresponde aos números da pista para isolar fragmentos de DNA que variam de 150 pares de bases e 400 pares de bases. Selecione a opção de intervalo como o modo de coleta e insira os seguintes parâmetros de limite: 135 para o início do par de bases, 410 para o final do par de bases e 240 para as patas do par de bases. Isso instrui o aparelho a alinhar o campo eletroforético à porta de saída de eluição elétrica.Quando fragmentos de DNA dentro desse intervalo estão viajando perto das proximidades da saída. Depois de salvar o protocolo file, prepare o de gel e os poços de carregamento de amostra do instrumento seguindo os procedimentos operacionais padrão da Pippen Prep na configuração do instrumento. Prepare as amostras de DNA para eletroforese adicionando 10 microlitros do marcador de DNA a uma alíquota de 30 microlitros de uma determinada amostra pós-ligadura para carregar as misturas no de gel.Primeiro, remova 40 microlitros do tampão de eletroforese de cada amostra. Em seguida, substitua o volume pipetando cada mistura de marcador de amostra de 40 microlitros em poços individuais. Voltando ao console, carregue o protocolo salvo e pressione start para iniciar a eletroforese.Quando o programa atingir o par de bases 240, a etapa de pausa coleta manualmente 40 microlitros do ouit de cada porta de saída com uma pipeta. Rotule essas frações como a fração inferior da biblioteca. Depois de coletar as frações inferiores da biblioteca, lave imediatamente as portas de saída adicionando 40 microlitros de tampão de eletroforese fresco.Pipetar o tampão para cima e para baixo pelo menos três vezes e, em seguida, aspirar o snet. Repita esta lavagem mais duas vezes para remover todos os vestígios de espécies de DNA de comprimento curto das saídas. Agora adicione 40 microlitros de tampão de eletroforese à amostra.Vede as portas elucianas e pressione o botão de execução para retomar o processo eluciano Após a conclusão do programa Ellucian na configuração de 410 pares de bases, colete os 40 microlitros de Inuit de todas as portas de saída e rotule essas frações como a fração superior da biblioteca. Neste ponto, ambas as frações da biblioteca são purificadas em gel e já para conversão de bissulfito.Usando um kit disponível comercialmente, execute o ensaio de conversão de bissulfito em ambas as frações da biblioteca. Na etapa final do processo de conversão, eluir as amostras de DNA em 40 microlitros de água livre de DNAs. Após a conversão do bissulfito, os fragmentos da biblioteca de DNA resultantes serão submetidos a uma amplificação por PCR de enriquecimento usando primers que hibridizam nas extremidades adaptadoras de cada molécula de DNA.Para se preparar primeiro para o enriquecimento PCR, adicione 160 microlitros da mistura principal de PCR a cada alíquota de 40 microlitros de uma amostra convertida por sulfeto. Em seguida, divida a mistura resultante de 200 microlitros em quatro alíquotas de 50 microlitros. Em tubos de PCR separados.Coloque os tubos em um termociclador e amplifique o molde de DNA convertido. Após o enriquecimento, coloque os quatro produtos pós-PCR em um único tubo de 1,5 mililitro e purifique o DNA com um kit comercial de limpeza de PCR. Se um kit de extração em fase sólida de esferas magnéticas for usado para purificar os produtos de PCR, modifique os procedimentos operacionais padrão misturando primeiro os produtos de PCR de biblioteca inferior combinados com 1,7 vezes seu volume total em grânulos.Em seguida, misture os produtos combinados de PCR da biblioteca superior com 1,1 vezes seu volume total em grânulos. Em seguida, siga o protocolo do fabricante até as etapas de lavagem com etanol a 70%, onde cada um dos volumes de lavagem deve ser alterado para 800 microlitros na última etapa do processo de purificação. Eluir o DNA com 50 microlitros de tampão de eluição livre de DNA.Armazene as bibliotecas purificadas a 20 graus Celsius negativos até que sejam necessárias, usando um ensaio baseado em fluorescência seletivo para DNA de fita dupla, quantifique a quantidade de conteúdo de DNA pós-enriquecimento para cada fração da biblioteca. Além disso, avalie o tamanho e a qualidade da biblioteca pós-enriquecimento com um bioanalisador. Calcule a molaridade efetiva do DNA de uma determinada fração da biblioteca usando o comprimento médio do DNA expresso em pares de bases.Uma vez que a molaridade seja conhecida, use a água livre do DNA para diluir cada fração superior e inferior correspondente até a concentração final de dois nanomolares. Combine os pares de bibliotecas inferior e superior em um único tubo para criar uma mistura de biblioteca de dois orifícios nanomolares a 20 microlitros cada. O exemplo agrupado agora está pronto para uma execução de sequenciamento.Em ensaios relacionados ao sequenciamento, incluindo E-R-R-B-S, a qualidade e a distribuição de tamanho das moléculas da biblioteca superior e inferior são fatores-chave na determinação da qualidade dos dados finais de sequenciamento. Quando comparado aos protocolos tradicionais de extração manual de gel, o aparelho automatizado de extração de gel usado no protocolo E-R-R-B-S produzirá uma distribuição de tamanho consistente e minimizará o potencial de contaminação entre amostras. Em seguida, ao enviar as moléculas da biblioteca convertida em sulfito BIS para sequenciamento, os dados brutos de todas as fitas de DNA mostram que, para qualquer fita, a qualidade dos dados para cada posição de nucleotídeo aumenta drasticamente logo após os três primeiros nucleotídeos.Uma vez que a sequência de consenso para esses três nucleotídeos é definida com CGG para a grande maioria das moléculas da biblioteca, os dados sugerem que o protocolo E-R-R-B-S produziu uma coleção de biblioteca que contém um conjunto desejável de fragmentos genômicos que são predominantemente flanqueados. Com o MSP, um resumo de restrição termina do ponto de vista de um pássaro. O protocolo E-R-R-B-S pode fornecer dados de resolução de pares de bases de locais de metilação da citidina em todo o genoma.Por exemplo, o cromossomo 12 é mostrado aqui. O protocolo cobre uma representação reduzida de CPGs em todo o genoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas E-R-R-B-S para a geração de dados de metilação D-N-A-C-P-G de resolução básica Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em quatro dias se executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de começar com DNA de alta qualidade, incluir todas as etapas descritas, validar a eficiência da conversão e sequência de bissulfato usando os parâmetros recomendados. Não se esqueça de que trabalhar com fenil e clorofórmio pode ser extremamente perigoso. Precauções comuns, como trabalhar em uma coifa química e ter o descarte adequado de resíduos, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.Seguindo este procedimento. Outros métodos, como sequenciamento spyro ou epítipo de matriz de massa, podem ser realizados para validar os achados. Além disso, o perfil de expressão gênica pode ser realizado para determinar o significado biológico dos padrões de metilação do DNA detectados.A capacidade de gerar DNA de resolução de pares de bases, padrões de metilação a partir de quantidades limitadas de materiais de entrada permitiu o perfil de populações de células raras nunca antes possível. Também tornou viável o perfil de grandes coortes de amostras clínicas para a exploração da regulação mediada epigenética e heterogeneidade da doença.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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