Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequenciamento para resolução de pares de bases D-N-A-C-P-G, análise de metilação baseada na digestão de enzimas de restrição combinada com citosina por conversão de sulfito. Isso é feito realizando primeiro a digestão da enzima de restrição MSP de DNA de alta qualidade, seguida pelo reparo final, um rejeito e ligação de adaptadores metilados. O próximo passo é realizar por conversão de sulfito em fragmentos de tamanho selecionado após por conversão de sulfito.

Os fragmentos são amplificados usando PCR. A etapa final é realizar o controle de qualidade e sequenciamento, seguido de visualização e análise de dados. Em última análise, a representação reduzida aprimorada do sequenciamento de bissulfito detecta a resolução quantitativa do par de bases dos padrões de metilação da citidina em loci genômicos ricos em CG.

A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos de metilação de DNA, como microarrays, é que ela pode utilizar pequenas quantidades de material de entrada para gerar dados de metilação D-N-A-C-P-G de alta cobertura na resolução do par de bases e locais biologicamente relevantes. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos interessados em explorar padrões epigenéticos além das regiões cobertas pelos ensaios tradicionais. Estávamos interessados em desenvolver essa técnica para fazer a transição de microarrays para a geração de dados de metilação de DNA com resolução de pares de bases que pudessem ser integrados aos dados gerados a partir de outras técnicas de próxima geração.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética. Por exemplo, padrões epigenéticos e heterogeneidade em amostras biológicas em comparação com controles normais ou outros estados de doença. Geralmente, os indivíduos novos neste método acharão desafiador devido à duração do procedimento, aos inúmeros requisitos específicos e às características únicas de sequenciamento das bibliotecas geradas Mamie fall.

Um especialista em pesquisa em nosso laboratório estará ajudando a demonstrar o procedimento Para iniciar este protocolo. Primeiro, prepare alíquotas purificadas de amostras de DNA genômico que sofreram uma digestão de enzima de restrição MSP, uma reação de reparo de extremidade romba e uma única adição de nucleotídeo nas três extremidades principais. Neste ponto, os produtos de DNA estarão prontos para as ligaduras do adaptador para começar a transferir 10 microlitros da amostra A-A-L-D-N-A para um tubo de PCR de 0,2 mililitro e colocar o tubo no gelo.

Além disso, coloque uma alíquota das moléculas adaptadoras no gelo. Em seguida, prepare a mistura de reagentes de ligação no gelo. Adicione o reagente de ligação e as moléculas adaptadoras à amostra de DNA e pipete para cima e para baixo algumas vezes para misturar.

Coloque um tubo de PCR em um termociclador e permita que a reação de ligadura prossiga durante a noite a 16 graus Celsius no dia seguinte. Purifique os produtos de ligação usando um kit de extração de DNA em fase sólida à base de esferas magnéticas ou coluna de sílica. Na última etapa do processo de purificação.

Eluir o DNA adicionando 30 microlitros de água livre de DNAs. O produto de DNA purificado pode ser armazenado a 20 graus Celsius negativos até que seja necessário para amostras, que começaram com o DNA total de 25 nanogramas ou mais. Use um aparelho automatizado de extração de gel, como o PI e prepare-se, para selecionar produtos ligados com comprimentos entre 150 pares de bases e 400 pares de bases.

Certifique-se de excluir corantes de visualização de DNA, como brometo de Ethereum ou verde cibernético do agros, pois eles podem alterar as propriedades de migração de DNA dos fragmentos ligados ao adaptador bifurcado. Os protocolos padrão de seleção de tamanho baseados em gel agros também podem ser usados para esta etapa do protocolo para configurar a eletroforese de DNA em um aros sem corante de 2% de pippin. Crie um novo protocolo no console Pippin Prep e selecione a opção de marcador L de 2% DF como o de sua escolha.

Em seguida, ative a opção usar padrões internos e verifique se o número da pista de referência corresponde aos números da pista para isolar fragmentos de DNA que variam de 150 pares de bases e 400 pares de bases. Selecione a opção de intervalo como o modo de coleta e insira os seguintes parâmetros de limite: 135 para o início do par de bases, 410 para o final do par de bases e 240 para as patas do par de bases. Isso instrui o aparelho a alinhar o campo eletroforético à porta de saída de eluição elétrica.

Quando fragmentos de DNA dentro desse intervalo estão viajando perto das proximidades da saída. Depois de salvar o protocolo file, prepare o de gel e os poços de carregamento de amostra do instrumento seguindo os procedimentos operacionais padrão da Pippen Prep na configuração do instrumento. Prepare as amostras de DNA para eletroforese adicionando 10 microlitros do marcador de DNA a uma alíquota de 30 microlitros de uma determinada amostra pós-ligadura para carregar as misturas no de gel.

Primeiro, remova 40 microlitros do tampão de eletroforese de cada amostra. Em seguida, substitua o volume pipetando cada mistura de marcador de amostra de 40 microlitros em poços individuais. Voltando ao console, carregue o protocolo salvo e pressione start para iniciar a eletroforese.

Quando o programa atingir o par de bases 240, a etapa de pausa coleta manualmente 40 microlitros do ouit de cada porta de saída com uma pipeta. Rotule essas frações como a fração inferior da biblioteca. Depois de coletar as frações inferiores da biblioteca, lave imediatamente as portas de saída adicionando 40 microlitros de tampão de eletroforese fresco.

Pipetar o tampão para cima e para baixo pelo menos três vezes e, em seguida, aspirar o snet. Repita esta lavagem mais duas vezes para remover todos os vestígios de espécies de DNA de comprimento curto das saídas. Agora adicione 40 microlitros de tampão de eletroforese à amostra.

Vede as portas elucianas e pressione o botão de execução para retomar o processo eluciano Após a conclusão do programa Ellucian na configuração de 410 pares de bases, colete os 40 microlitros de Inuit de todas as portas de saída e rotule essas frações como a fração superior da biblioteca. Neste ponto, ambas as frações da biblioteca são purificadas em gel e já para conversão de bissulfito.

Usando um kit disponível comercialmente, execute o ensaio de conversão de bissulfito em ambas as frações da biblioteca. Na etapa final do processo de conversão, eluir as amostras de DNA em 40 microlitros de água livre de DNAs. Após a conversão do bissulfito, os fragmentos da biblioteca de DNA resultantes serão submetidos a uma amplificação por PCR de enriquecimento usando primers que hibridizam nas extremidades adaptadoras de cada molécula de DNA.

Para se preparar primeiro para o enriquecimento PCR, adicione 160 microlitros da mistura principal de PCR a cada alíquota de 40 microlitros de uma amostra convertida por sulfeto. Em seguida, divida a mistura resultante de 200 microlitros em quatro alíquotas de 50 microlitros. Em tubos de PCR separados.

Coloque os tubos em um termociclador e amplifique o molde de DNA convertido. Após o enriquecimento, coloque os quatro produtos pós-PCR em um único tubo de 1,5 mililitro e purifique o DNA com um kit comercial de limpeza de PCR. Se um kit de extração em fase sólida de esferas magnéticas for usado para purificar os produtos de PCR, modifique os procedimentos operacionais padrão misturando primeiro os produtos de PCR de biblioteca inferior combinados com 1,7 vezes seu volume total em grânulos.

Em seguida, misture os produtos combinados de PCR da biblioteca superior com 1,1 vezes seu volume total em grânulos. Em seguida, siga o protocolo do fabricante até as etapas de lavagem com etanol a 70%, onde cada um dos volumes de lavagem deve ser alterado para 800 microlitros na última etapa do processo de purificação. Eluir o DNA com 50 microlitros de tampão de eluição livre de DNA.

Armazene as bibliotecas purificadas a 20 graus Celsius negativos até que sejam necessárias, usando um ensaio baseado em fluorescência seletivo para DNA de fita dupla, quantifique a quantidade de conteúdo de DNA pós-enriquecimento para cada fração da biblioteca. Além disso, avalie o tamanho e a qualidade da biblioteca pós-enriquecimento com um bioanalisador. Calcule a molaridade efetiva do DNA de uma determinada fração da biblioteca usando o comprimento médio do DNA expresso em pares de bases.

Uma vez que a molaridade seja conhecida, use a água livre do DNA para diluir cada fração superior e inferior correspondente até a concentração final de dois nanomolares. Combine os pares de bibliotecas inferior e superior em um único tubo para criar uma mistura de biblioteca de dois orifícios nanomolares a 20 microlitros cada. O exemplo agrupado agora está pronto para uma execução de sequenciamento.

Em ensaios relacionados ao sequenciamento, incluindo E-R-R-B-S, a qualidade e a distribuição de tamanho das moléculas da biblioteca superior e inferior são fatores-chave na determinação da qualidade dos dados finais de sequenciamento. Quando comparado aos protocolos tradicionais de extração manual de gel, o aparelho automatizado de extração de gel usado no protocolo E-R-R-B-S produzirá uma distribuição de tamanho consistente e minimizará o potencial de contaminação entre amostras. Em seguida, ao enviar as moléculas da biblioteca convertida em sulfito BIS para sequenciamento, os dados brutos de todas as fitas de DNA mostram que, para qualquer fita, a qualidade dos dados para cada posição de nucleotídeo aumenta drasticamente logo após os três primeiros nucleotídeos.

Uma vez que a sequência de consenso para esses três nucleotídeos é definida com CGG para a grande maioria das moléculas da biblioteca, os dados sugerem que o protocolo E-R-R-B-S produziu uma coleção de biblioteca que contém um conjunto desejável de fragmentos genômicos que são predominantemente flanqueados. Com o MSP, um resumo de restrição termina do ponto de vista de um pássaro. O protocolo E-R-R-B-S pode fornecer dados de resolução de pares de bases de locais de metilação da citidina em todo o genoma.

Por exemplo, o cromossomo 12 é mostrado aqui. O protocolo cobre uma representação reduzida de CPGs em todo o genoma. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar bibliotecas E-R-R-B-S para a geração de dados de metilação D-N-A-C-P-G de resolução básica Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em quatro dias se executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de começar com DNA de alta qualidade, incluir todas as etapas descritas, validar a eficiência da conversão e sequência de bissulfato usando os parâmetros recomendados. Não se esqueça de que trabalhar com fenil e clorofórmio pode ser extremamente perigoso. Precauções comuns, como trabalhar em uma coifa química e ter o descarte adequado de resíduos, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

Seguindo este procedimento. Outros métodos, como sequenciamento spyro ou epítipo de matriz de massa, podem ser realizados para validar os achados. Além disso, o perfil de expressão gênica pode ser realizado para determinar o significado biológico dos padrões de metilação do DNA detectados.

A capacidade de gerar DNA de resolução de pares de bases, padrões de metilação a partir de quantidades limitadas de materiais de entrada permitiu o perfil de populações de células raras nunca antes possível. Também tornou viável o perfil de grandes coortes de amostras clínicas para a exploração da regulação mediada epigenética e heterogeneidade da doença.