Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal
September 7th, 2017
Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.
O objetivo geral desta técnica é fornecer uma ferramenta computacional para avaliar a distribuição espacial e a intensidade do sinal das modificações do DNA, visualizadas por imunocoloração dentro dos núcleos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da epigenética, permitindo o exame da localização nuclear e dos níveis relativos de modificações do DNA em diferentes sistemas modelo. A principal vantagem dessa técnica é que as modificações do DNA são medidas pela magnitude do sinal do bot e, em seguida, pela distribuição.
Uma das implicações dessa técnica é que ela facilita nossa compreensão de possíveis fileiras funcionais de modificações de DNA em vários sistemas biológicos. Esta técnica também tem a aplicação adicional de análise computacional de outros epítopos detectáveis por imuno-histoquímica. Para começar, abra os arquivos formatados LSM da imagem de microscopia confocal.
Selecione o processamento de imagem e, em seguida, escolha a imagem desejada para análise. Observe que, ao comparar perfis de intensidade entre amostras, a potência e o ganho do laser devem ser consistentes para fazer comparações diretas. Em seguida, clique em mostrar tudo, para tornar todos os controles gráficos visíveis, selecione a guia de gráficos e escolha a ferramenta retângulo para selecionar uma região que contenha os núcleos de interesse.
Em seguida, use o comando cut region para isolar a região de interesse. Agora salve a imagem com um novo nome e um formato LSM ou CZI e reabra o arquivo no software Zen Blue. Abra a mesa ZEN em Zen Blue e use o comando enviar para ZEN em Zen Black para abrir o arquivo em Zen Blue.
Em seguida, ative a guia 2.5d para permitir a visualização da imagem em 2.5d. Clique em mostrar tudo para tornar todos os controles gráficos visíveis e alterar as configurações usando as quatro barras cinzas. As barras controlam o zoom, a rotação, a inclinação do eixo e a expansão e contração das barras de escala.
Selecione o modo de renderização para visualizar melhor os picos individuais e, em seguida, altere a grande distância alterando a porcentagem. Quanto menor a porcentagem, mais definido cada pico individual. Agora, antes de salvar a imagem 2.5d, oculte a lista de arquivos e as ferramentas gráficas clicando na seta cinza abaixo do gráfico 2.5d.
Em seguida, salve o gráfico como uma captura de tela usando a tecla de impressão da tela no teclado. Abra a opção de processamento de imagem no software e abra o arquivo de interesse. Em seguida, selecione a guia de perfil e selecione a guia mostrar tudo para acessar todas as opções de formatação.
Na guia perfil, escolha a opção de tabela e o botão de seta. Agora use o mouse para selecionar um ponto inicial e desenhar uma linha sobre um número contínuo de células, um gráfico de intensidade para as células ao longo desta linha é gerado junto com a tabela de medições de intensidade. Observe que a tabela também fornece a distância na qual a intensidade do pixel é vermelha para a fluorescência vermelha, verde e azul.
A unidade é mícrons. Para exportar esses dados, clique com o botão direito do mouse na tabela, selecione salvar tabela e salve-a como um arquivo de texto. Para salvar o perfil de intensidade, escolha a opção de exportação, na janela pop-up, alterne duas opções, arquivo de imagem marcado, formato e conteúdo da janela de imagem, painel único, dados.
Em seguida, siga as instruções para salvar o arquivo. Agora repita esse processo para cada perfil de intensidade necessário. No software, selecione o processamento de imagem e escolha o arquivo de imagem de interesse.
Em seguida, selecione a guia coloc para análise de colocalização e selecione mostrar tudo para acessar todas as opções de formatação. Nas quatro guias na metade inferior da tela, escolha colocalização e escolha as opções de tabela e imagem. Em seguida, escolha o terceiro ícone na parte superior da guia, identificado pelo texto pop-up, fechado besier.
Use esta ferramenta para circundar um único núcleo. Os valores aparecerão na tabela e um gráfico de dispersão será produzido para fluorescência vermelha versus verde. O eixo deste gráfico é móvel e controla o bloqueio da detecção.
Todas as intensidades de pixel dentro do núcleo devem ser consideradas sinais positivos. Como os níveis de modificações no DNA variam em todo o núcleo, para levar em consideração os sinais fracos, não bloqueamos os dados. Devemos enfatizar aqui que é discutível se os valores de fundo devem ser incluídos na análise.
É importante ressaltar que o coeficiente de sobreposição é independente das diferenças nas intensidades de sinal entre os dois canais. Enquanto o coeficiente de correlação de pessoa assume uma relação linear entre os sinais. Agora repita esse processo de circundar núcleos para completar o conjunto de dados.
Em seguida, para exportar os dados, clique com o botão direito do mouse na tabela e siga as opções para salvar os dados. Para salvar uma imagem de co-localização, use o comando de exportação com as duas opções, arquivo de imagem marcado, formato e conteúdo do painel único da janela de imagem, dados e siga as opções para salvar o arquivo. A distribuição espacial de dois derirativos oxidados de cinco metilcitosina foi examinada na diferenciação de progenitores hapádicos, usando o protocolo descrito.
Os sinais vermelho e verde representam as duas modificações distintas do DNA. Os sinais são bem definidos com sobreposição limitada. Consistente com as expectativas, os perfis das duas intensidades de sinal e da célula correspondente não coincidem fortemente entre si.
O padrão distinto sugere que a oxidação dependente de tap de cinco metilcitosina pode gerar diferentes derivados oxidados em regiões específicas da cromatina. Uma comparação semelhante das duas modificações de DNA foi feita em células de meduloblastoma Daoy e em células de ependimoma BXD. Ambas as linhagens celulares são de tumores cerebrais pediátricos.
A quantificação revela que as células BXD exibem níveis significativamente mais baixos de ambos os sinais em comparação com as células Daoy. Em seguida, a co-localização dos derivados oxidados de 5MC foi examinada em hiPSCs indiferenciados. Em 24 horas após a indução da diferenciação do endoderma hepático e hiPSCs.
Nesta análise, a co-localização do sinal mudou significativamente com a indução da diferenciação, o que pode ser atribuído a uma magnitude reduzida de cinco CAC nas células indiferenciadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar gráficos e perfis de intensidade 2,5d e como produzir dados de colocalização. As ferramentas de análise e visualização de imagens descritas aqui contribuem para a pesquisa epigenética, fornecendo uma maneira relativamente rápida de comparar sinais das diferentes modificações de DNA em diferentes grupos experimentais.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma hora se for executada corretamente. É importante evitar a superexposição e usar as mesmas configurações para diferentes grupos experimentais durante a microscopia. Bolhas de ar na montagem e imersão insuficiente podem causar perda local de fluorescência, portanto, uma inspeção visual da área de varredura é crítica.
O procedimento pode ser ainda mais automatizado segmentando os núcleos e criando regiões de interesse usando o Zen Blue. Essas regiões podem ser importadas para o Zen Black, para realizar análises de co-localização em vários núcleos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um fluxo de trabalho semi-quantitativo para visualizar formas oxidadas recém-descobertas de 5-metilcitosina (oxi-mCs) e sua distribuição espacial dentro dos núcleos. O método permite a avaliação da intensidade do sinal e colocalização das modificações do DNA, contribuindo para a compreensão de seus papéis funcionais na epigenética.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Epigenética
- Modificações do DNA
- Técnicas de imunocoloração
Fundamentos
- A 5-metilcitosina e seus derivados oxidados desempenham papéis cruciais na regulação gênica.
- Entender sua distribuição espacial pode fornecer insights sobre suas implicações funcionais.
- Métodos existentes podem não visualizar adequadamente essas modificações.
- Este estudo introduz uma ferramenta computacional para melhorar a visualização e análise.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método para avaliar a distribuição espacial das modificações do DNA.
- Analisar a intensidade do sinal e a colocalização de diferentes derivados oxidados.
- Facilitar a compreensão dos papéis funcionais dessas modificações em sistemas biológicos.
Métodos Utilizados
- Imunotinção das modificações do DNA em núcleos.
- Microscopia confocal para aquisição de imagens.
- Processamento de imagens usando o software Zen Blue para visualização.
- Análise de colocalização das intensidades de sinal.
Principais Resultados
- Padrões espaciais distintos de derivados oxidados foram observados em vários tipos celulares.
- A análise de colocalização revelou mudanças significativas durante a diferenciação.
- A quantificação mostrou diferenças nos níveis de sinal entre linhagens celulares.
- O método demonstrou potencial para aplicações mais amplas na pesquisa epigenética.
Conclusões
- O fluxo de trabalho desenvolvido melhora a visualização das modificações do DNA.
- Os resultados sugerem papéis funcionais distintos para diferentes derivados oxidados.
- Esta técnica pode ser aplicada a vários contextos biológicos para insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
