Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

O objetivo geral deste protocolo para os corpos embrióides livres de soro iPSC humano 3D é fornecer um sistema in vitro que se aproxime do desenvolvimento cortical inicial humano, que pode ser usado para a descoberta de medicamentos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das células-tronco, como como os neurônios derivam de iPSCs, formam redes funcionais em tecidos 3D. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite modelar aspectos do desenvolvimento cortical em uma placa, a partir de tecido humano contendo a genética de indivíduos doentes, portanto, o sistema serve como uma plataforma baseada em células para triagem de drogas que é escalável e pode ser usada para estudar muitos distúrbios neurobiológicos diferentes.

Embora esse método possa fornecer informações sobre distúrbios neurobiológicos ou do desenvolvimento neurológico, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como aqueles que se concentram em modelos de função neuroimune ou informações neurais. Para este protocolo, comece com o estabelecimento de células fetais. Para estabelecer essa cultura, coloque 600.000 células fetais em cada poço de uma placa de seis poços, com 300 mililitros de meio por poço.

Após a cultura das células fetais por 48 horas, substitua o meio. Incube as placas por uma hora, enquanto prepara as células-tronco. Descongele as células-tronco em banho-maria a 37 graus Celsius.

Depois de descongelado, transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros e encha o tubo até cinco mililitros com meio de cultura, adicionado gota a gota. Em seguida, centrifugue suavemente as células por quatro minutos, aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de meio de células-tronco com inibidor de ROCK. Depois de quantificar a densidade celular, coloque 300.000 células-tronco nas células alimentadoras.

Em seguida, cresça e expanda as culturas, selecionando periodicamente as células saudáveis, após a expansão e congelando as células para backup. Cultive as colônias de células-tronco em placas padrão até que atinjam 50% a 70% de confluência. Em seguida, use um tratamento enzimático suave e uma trituração suave com a ponta da pipeta de um mililitro para colher os hiPSCs para diferenciação de células neuroprecursoras.

Centrifugue suavemente a suspensão, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio iPSC humano de cinco mililitros. Em seguida, transfira a suspensão celular para uma placa de cultura de células de cinco centímetros revestida com gelatina a 0,1% e incube a placa por uma hora. Após uma hora, transfira as células não aderentes para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Em seguida, enxágue suavemente a placa com três mililitros de meio e transfira-a para o mesmo tubo. Em seguida, repita a etapa de ressuspensão com centrifugação suave e, em seguida, determine a densidade celular e coloque as células em uma placa inferior em V de 96 poços e baixa adesão a 9.000 células por poço. Agora, gire a placa por três minutos e comece a cultivar as células.

Nos próximos 14 dias, a cada dois dias, substitua meio meio por um meio de diferenciação fresco. Após duas semanas de cultura das células, prepare seis placas de poço com inserções de cultura de células de 40 mícrons e um mililitro de meio DM1. Incube essas placas por pelo menos quatro horas antes de adicionar as células cultivadas.

Em seguida, usando uma ponta de pipeta de boca larga de 200 microlitros, colete agregados de células de duas semanas no valor de cerca de 20 microlitros de meio. Transfira de quatro a seis agregados para cada inserto com o mínimo de solução, remova o excesso. Durante esta etapa, é importante trabalhar rapidamente e com a mão firme, enquanto remove o meio ao redor dos SFEBs, você pode ver os SFEBs se moverem pela solução devido à tensão superficial.

Não há problema em reposicioná-los após a remoção do meio. Depois que todos os agregados estiverem carregados nas inserções, mude o meio para um mililitro de DM2 e continue cultivando as células a cada dois dias. Substitua três quartos do meio por meio fresco.

Após 14 dias de cultivo, comece a adicionar o meio DM3 às culturas. Continue a cultura por mais 16 dias para aumentar os SFEBs. Agora retire suavemente os SFEBs do inserto, usando uma ponta de pipeta de boca larga de 200 microlitros.

Transfira os SFEBs para placas de 12 poços, carregando de quatro a oito por poço. Em seguida, core-os como contorno no protocolo de texto. Para preparar bem os 12 e os oito pratos, lave-os primeiro três vezes com água estéril.

Em seguida, lave-os uma vez com etanol a 75% e novamente com etanol a 100%. Em seguida, asse os pratos a 50 graus Celsius por quatro a cinco horas de cabeça para baixo, para concluir o processo de esterilização. Após o cozimento, adicione 500 microlitros de solução de 0,2% PEI a cada poço e deixe o prato descansar em temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, aspire o PEI e lave os poços quatro vezes com a água destilada estéril e seque-os ao ar durante a noite. No dia seguinte, prepare laminante fresco em meio L15 e adicione 10 microlitros ao centro de cada poço. Em seguida, adicione água destilada aos reservatórios circundantes para evitar a evaporação e incube a placa por uma hora a 37 graus Celsius.

Certifique-se de irradiar o laminante no centro dos eletrodos, tomando cuidado para não exceder o espaço dos eletrodos de aterramento, se esse espaço for excedido, os neurônios crescerão sobre os eletrodos de aterramento, causando artefatos de ruído e afetando a fidelidade da gravação. Agora, adicione um SFEB preparado em cada poço, usando sucção suave com uma pipeta de diâmetro largo. Em seguida, adicione 200 microlitros de DM2 a cada poço e cultive a placa durante a noite.

Mais tarde, para registrar a atividade neural, coloque uma placa no leitor de placas. Pré-aqueça a 37 graus Celsius. Em seguida, use o software para registrar 10 minutos de atividade de cada poço.

O SFEB é cultivado usando o método descrito, produzindo tecido com características morfológicas que se assemelham a uma zona subventricular cortical de desenvolvimento precoce, repleta de extensos neurônios Tuj1 positivos, bem como neuroprogenitores. Numerosas rosetas corticais em desenvolvimento foram observadas nas camadas externas e nas camadas internas dos corpos. A borda externa dos corpos se assemelha a uma placa cortical em desenvolvimento contendo neurônios pós-mitóticos, isso é apoiado pela expressão de Brn2, um marcador para neuroprogenitores e as camadas corticais externas mais ventralizadas.

As camadas externas também contêm células positivas de Reelina que podem ser células de gratzel casuais ou seus progenitores. Os corpos também expressaram marcadores consistentes com a origem mista dos immenantes codais e ganglionares mediais. Com base na expressão dos marcadores TF2 e Nkx2.1 cozidos.

Os SFEBs cultivados produzem neurônios inter CalR e CalB positivos. Bem como, neurônios excitatórios positivos para VGLUT e progenitores neurais glutamatérgicos positivos para Tbr1. Consistente com outros relatos, 61% das células dos corpos eram positivas para VGLUT e 43% eram positivas para Tbr1.

As gravações de MEM feitas a partir dos corpos podem ser feitas por longos períodos de tempo e as gravações mostraram o desenvolvimento de ruptura no nível da rede cortical. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar SFEBs a partir de iPSCs humanos, caracterizar o conteúdo de neurulas de rosetas corticais em desenvolvimento punitivo com NSFEBs. e realizar ensaios neurofisiológicos em SFEBs em maturação.

Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque leva tempo e prática para desenvolver o campo científico necessário para que o comportamento das iPSCs e das iPSCs chegue aos neurônios em cultura. As células cultivadas devem ser monitoradas diariamente. Após esse procedimento, outros métodos, como imagens de cálcio, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o que os tratamentos medicamentosos podem fazer com as oscilações da rede cortical.