Determinação da Frequência Inibitória Óptima para Células Cânceras Utilizando Campos de Tratamento Tumoral (TTFields)

O objetivo geral do sistema de aplicação in vitro TTFields é investigar seu efeito em células cancerígenas de diferentes tipos de tumores, orientar a administração clínica de TTFields e otimizar o resultado do tratamento. Este método pode ajudar a definir o efeito de diferentes parâmetros do TTField nas células cancerígenas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a identificação pré-clínica da frequência TTField mais eficaz que inibe o crescimento de uma linhagem celular cancerígena específica, que pode ser aplicada em humanos.

Por meio de uma ligeira modificação dessa técnica, é possível testar a eficácia do tratamento combinado do TTField e de outras modalidades de tratamento, como quimioterápicos e radioterapia. Demonstrando o procedimento estará Yaara Porat, pesquisadora de nossa equipe. Para começar, instale pratos TTFields com tampas em uma placa de base e prepare oito pratos adicionais que serão usados para o crescimento de células de controle.

Coloque uma lamínula estéril de dois milímetros no fundo de cada prato. Em seguida, suspenda cinco vezes 10 elevado à quarta célula U-87 MG em um mililitro de meio DMEM. O número apropriado de células plaqueadas em cada placa depende das propriedades da linhagem celular em uso.

É crucial calibrá-lo antes do experimento para evitar o crescimento excessivo das células. Pipetar 200 microlitros da suspensão celular em cada lamínula de modo que uma gota seja formada em sua superfície e cubra a louça com suas tampas. Incube todos os pratos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono durante a noite para permitir que as células adiram.

Uma vez que as células estejam presas, aspire o meio das lamínulas usando uma pipeta de 200 microlitros e, em seguida, pipete cuidadosamente dois mililitros de meio de crescimento completo em cada prato. Bata suavemente com uma ponta de pipeta estéril nas bordas da lamínula para liberar quaisquer bolhas de ar presas sob a lâmina. Depois, incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono até o início do tratamento com TTFields.

Para iniciar o tratamento TTFields, remova a placa de base da incubadora de 37 graus Celsius e coloque-a em uma incubadora refrigerada de dióxido de carbono. A temperatura da incubadora refrigerada determinará a intensidade do campo elétrico. É importante usar a intensidade apropriada, que depende da sensibilidade celular aos TTFields.

Em seguida, conecte um conector fêmea de cabo plano na placa de base e ligue o gerador TTFields. Abra o software dedicado ao sistema de aplicação in vitro TTFields. Depois de definir um novo estudo inserindo os nomes do experimento e do experimentador, ajuste a frequência e a temperatura alvo para cada prato.

Clique no botão Iniciar para iniciar o tratamento TTFields no software e verifique se todas as antenas aparecem em azul claro no monitor, o que confirma sua conexão adequada. Para restabelecer a conexão, pressione suavemente o prato para baixo e gire-o lentamente para frente e para trás até que o prato apareça em azul claro na tela. Após 24 horas do tratamento, interrompa o experimento no software clicando em pausar.

Desconecte o conector do cabo plano da placa de base e, em seguida, coloque a placa de base no gabinete de fluxo laminar e, em seguida, remova a placa de base com as placas e as células de controle cultivadas em condições padrão de suas incubadoras. Substitua o meio em todos os pratos por meio de crescimento completo fresco, em seguida, coloque as células de controle em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5% e devolva a placa de base à incubadora refrigerada. Reconecte a placa de base ao gerador.

Continue o tratamento clicando no botão continuar. Quando o tratamento estiver concluído, termine o experimento clicando no botão finalizar experimento no software e salve os dados carregados do sistema. Depois de desligar o gerador TTFields, desconecte o cabo plano da placa de base e remova o sistema da incubadora.

Pressione e gire o prato de cerâmica no sentido anti-horário para soltá-lo da placa de base. Em seguida, transfira assepticamente as lamínulas tratadas e de controle TTFields para placas de Petri estéreis contendo meio fresco para avaliação posterior. Para avaliar o efeito do tratamento com TTFields, remova o meio de cada lamínula contendo prato, adicione 0,5 mililitros de 0,25% de tripsina / EDTA e incube os pratos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono até que as células se desprendam da superfície da lamínula.

Neutralize a tripsina com 0,5 mililitros de meio de crescimento completo e ressuspenda as células pipetando suavemente a suspensão para cima e para baixo. Finalmente, conte as células por citometria de fluxo. Apresentam-se aqui os resultados da varredura de frequência realizada em células A2780, revelando a influência dependente da frequência dos TTFields no crescimento e capacidade clonogênica das células estudadas.

A eficácia do tratamento mais proeminente foi observada quando a frequência de 200 kilohertz foi aplicada. A eficácia do tratamento com TTFields realizado em duas intensidades diferentes foi investigada em células OVCAR-3. O estudo mostra uma relação clara entre a intensidade aplicada e o resultado do tratamento, com a maior atividade inibitória do crescimento da maior intensidade de campo.

Independentemente da intensidade de campo aplicada, o efeito mais forte do tratamento TTFields foi observado na frequência de 200 kilohertz. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 30 minutos por dia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de evitar derramamento de mídia e manter os pratos equilibrados ao transferi-los da incubadora para o exaustor e vice-versa.

Após a aplicação do TTField, outros métodos, como citometria de fluxo, análise de proteína de alanina ou microscopia imunofluorescente, podem ser realizados para investigar melhor o resultado do tratamento e o mecanismo subjacente à atividade observada. Esta técnica é usada para determinar as frequências ideais de TTFields a serem aplicadas nos ambientes clínicos para diferentes tipos de câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como planejar e executar experimentos TTFields in vitro.

Não se esqueça de que trabalhar com linhagens de células humanas pode ser perigoso, e precauções como luvas e roupas de proteção devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.