Quantificar a freqüência de Tumor-propagação células usando Transplante de Células Limitando diluição em singênicos Zebrafish

O ensaio de transplante de células de diluição limitante é o padrão-ouro para avaliar o potencial de auto-renovação em modelos animais experimentais. Nesta demonstração, embriões de peixe-zebra singênicos de estágio celular são injetados com rag dois MIC e RAG dois GFP para criar peixes-zebra transgênicos que desenvolverão leucemia linfoblástica aguda de células T marcada com fluorescência. Aos 60 dias de vida, as células primárias de leucemia são isoladas do peixe-zebra e depois purificadas usando classificação de células ativadas por fluorescência.

Em seguida, as células são transplantadas na diluição limitante na cavidade peritoneal do peixe-zebra adulto, e os peixes são monitorados quanto ao crescimento do tumor por até 90 dias. Finalmente, o programa de software estatístico de análise de diluição limitante extrema é usado para quantificar a frequência de células de propagação de leucemia dentro do tumor original. A análise de transplante de células de diluição limitante permite que os investigadores avaliem com precisão o número de células auto-renovadoras contidas na maior parte da massa tumoral.

São essas células auto-renovadoras que impulsionam a formação do câncer e são responsáveis pela recaída. A principal vantagem de fazer ensaios de transplante de diluição limitante no modelo de peixe-zebra é que muitos peixes podem ser transplantados para cada experimento, resultando em melhor precisão ao determinar a frequência de células de propagação tumoral auto-renovadoras. Este método fornece informações sobre as células que se propagam tumorais nas células T, uma leucemia linfoblástica aguda.

Também pode ser aplicado para entender outros modelos de câncer de peixe-zebra. Jessica Blackburn, uma colega do laboratório e Sally Liu, uma técnica talentosa, demonstrarão o procedimento para você hoje Para linearizar Rag dois CM e RAG dois G-F-P-D-N-A Constructos digerem 10 microgramas de cada plasmídeo com enzima de restrição, não um a 37 graus Celsius durante a noite. Após a extração do clorofórmio fenil e a precipitação do etanol, suspendemos cada plasmídeo em 20 microlitros de água.

Determine as concentrações de DNA em um gel de 1% de agro executando uma diluição de um para um, um para cinco e um para 10 de cada plasmídeo digerido com 20 microlitros, 10 microlitros e cinco microlitros de uma escada de DNA de alta faixa. Agora dilua o DNA até uma concentração final de 60 nanogramas por microlitro para injeção em CG uma cepa syngen. Um embrião de peixe-zebra injeta 250 nanolitros de 30 nanogramas por microlitro, dois CM e 30 nanogramas por microlitro.

Coloque dois GFP em embriões de peixe-zebra em um estágio celular, visando cuidadosamente o DNA diretamente na célula e não na gema. Armazene os embriões injetados a 28,5 graus Celsius e remova os embriões mortos após 24 horas aos cinco dias de vida, transfira os animais para grandes tanques aproximadamente 28 dias após a injeção. Peixe-zebra larval anestesiado adicionando 200 microlitros de quatro nanogramas por mililitro trica S a 25 mililitros de água do sistema de peixes em uma placa de Petri.

Examine as larvas quanto ao desenvolvimento de TALL marcado com fluorescência usando um microscópio de epifluorescência para detectar fluorescência GFP. Separe as larvas positivas para tumor daquelas negativas para garantir que nenhum peixe leucêmico seja perdido na análise. As larvas negativas podem ser examinadas posteriormente, uma vez que os tumores podem ter crescido Monitore peixes leucêmicos marcados com fluorescência pelo menos uma vez por semana usando o microscópio de fluorescência epi para rastrear o crescimento do tumor.

Quando as células de leucemia GFP positivas ultrapassarem mais de 50% do animal, adicione um mililitro de quatro nanogramas por mililitro. Trica S em uma placa de Petri contendo nove mililitros de água do sistema de peixes para sacrificar os peixes, coloque os peixes em uma nova placa de Petri contendo um mililitro de soro bovino fetal a 5% em 0,9 XPBS macere o peixe com uma lâmina de barbear, pipete a mistura para dissociar grandes aglomerados de células. Em seguida, passe as células por um filtro de malha de 40 micrômetros para um tubo de 50 mililitros.

Pipete 500 microlitros das células em um tubo de poliestireno de quatro mililitros. Adicione um microlitro de um miligrama por mililitro, iodeto de perídio para rotular o vórtice de células mortas e, em seguida, mantenha as células no gelo. Prepare também um peixe CG tipo selvagem um para coletar células sanguíneas normais, que servem como portadoras para as células tumorais durante o transplante a quatro mililitros de 5%FPS em 0,9 X PB S para o tubo de 50 mililitros para um volume total de cinco mililitros.

Conte as células sanguíneas normais diluídas em três vezes 10 elevado ao quinto por mililitro em 5% FBS em 0,9 x pbs e, em seguida, pipete 100 microlitros por poço de uma placa de 96 poços usando um classificador de células ativadas por fluorescência do tipo GFP positivo PI células tumorais negativas na placa de 96 poços contendo células sanguíneas nas doses indicadas. Além disso, classifique 10.000 células em um poço sem células sanguíneas normais e reanalise usando fatos para avaliar a pureza e a viabilidade da centrífuga de células classificadas. A placa de 96 poços a 2000 GS por 10 minutos para peletizar as células.

Remova 95 microlitros do snat e ressuspenda as células nos cinco microlitros restantes. Injete a suspensão celular na cavidade peritoneal de um peixe-zebra adulto com mais de 60 dias de idade usando uma microseringa de calibre 26 e meio. O peixe-zebra não precisa ser anestesiado antes do transplante.

Transplante 45 peixes com 10 células leucêmicas, 20 peixes com 100 células, sete peixes com 1000 células e cinco peixes com 10.000 células TALL aproximadamente 28 dias após o transplante. Examinou o peixe-zebra receptor com um microscópio de epifluorescência usando um comprimento de onda de excitação 4 85 20 e filtro de emissão 5 30 25. Para detectar fluorescência GFP.

Registar o número de peixes positivos por número total de peixes injectados. Reexamine os peixes a cada 14 dias por até 90 e registre o número de peixes positivos. Quando um peixe positivo para tumor se torna mais abundante.

Sacrifique o animal por overdose trica de US trica, insira os resultados em uma tabela e carregue os dados no software de análise de diluição limite extrema baseado na web para determinar a frequência de células de leucemia auto-renovadoras dentro do TALL primário CG uma cepa embriões foram injetados com RAG dois cmic e RAG duas larvas GFP foram rastreadas para TALL primário Após 28 dias consistente com o trabalho anterior, aproximadamente 5% dos peixes injetados têm células T positivas para GFP no timo, e 100% desses peixes desenvolverão leucemia. Aqui, células TALL marcadas com fluorescência foram selecionadas de animais doentes com 65 dias de idade e usadas no ensaio de transplante de células de diluição limitante. Primeiro, uma marcha foi desenhada para selecionar células individuais.

Em seguida, foram selecionadas células negativas para iodeto de propídio. E, finalmente, uma marcha foi desenhada para selecionar apenas as células de leucemia GFP positivas para classificação. Neste exemplo de peixes transplantados TALL no dia 28, os tumores em estágio inicial foram vistos como uma área de células positivas para GFP perto do local da injeção.

Enquanto alguns TLS foram mais avançados, tendo se expandido para preencher a cavidade peritoneal para esses experimentos, mais de 220 animais foram transplantados, o que pode ser facilmente realizado por uma pessoa em várias horas. A análise de dados usando o software elda mostrou que, em média, uma em cada 135 T todas as células eram células de propagação de leucemia auto-renovadoras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transplantar células tumorais limitando a diluição na cavidade peritoneal do peixe-zebra singenético e como usar os dados resultantes para determinar a frequência de células de propagação tumoral dentro de um determinado tumor.

Novos estudos utilizando animais geneticamente modificados podem ajudar a identificar os mecanismos que regem a auto-renovação dessas células de propagação tumoral.