Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

Este protocolo descreve as etapas para a clonagem de vários RNAs de guia único em um vetor de guia de RNA concatemer, que é de uso particular na criação de knockouts multi-genes usando a tecnologia CRISPR / Cas9. A geração de knockouts duplos em organoides intestinais é mostrada como uma possível aplicação deste método.

O objetivo geral deste protocolo é clonar vários RNAs guia em um vetor concatemer CRISPR e obter eletroporação altamente eficiente em organoides intestinais de camundongos, a fim de obter nocaute simultâneo de vários genes. Este método pode melhorar muito a eficiência dos estudos de perda de função, tornando possível superar o efeito potencial da compensação paralela. A principal vantagem de nossa estratégia de concatemer CRISPR é a conveniência de uma única etapa de clonagem e a possibilidade de realizar nocaute simultâneo de até quatro genes diferentes.

A demonstração do procedimento será feita por Alessandra Merenda, uma estudante de doutorado do meu laboratório. A clonagem de RNAs guia ou gRNAs no vetor concatemer CRISPR começa com uma única reação para recozer as fitas superior e inferior para cada oligonucleotídeo gRNA e fosforilar suas extremidades. Prepare a mistura de reação no gelo, para três concatemers, use três microlitros de gRNAs de fita superior, três microlitros de gRNAs de fita inferior, dois microlitros de tampão T4 DNA ligase, um microlitro de polinucleotídeo quinase T4 e água até um volume total de 20 microlitros.

Misture bem pipetando e operando o termociclador usando as seguintes configurações, 37 graus Celsius por 30 minutos, 95 graus Celsius por cinco minutos, diminua para 25 graus Celsius a 0.3 graus Celsius por minuto e mantenha a quatro graus Celsius. O próximo passo é a reação de embaralhamento Bbs1, na qual os oligonucleotídeos de gRNA pré-recozidos são incorporados na posição apropriada do vetor concatemer. Dilua a mistura de reação de um a 100 em DNA, água livre de RNA para gerar três e quatro vetores concatemeros de gRNA.

Monte as reações de embaralhamento Bbs1 no gelo. Use 100 nanogramas de vetor concatemer CRISPR, 10 microlitros de mistura de oligo, um microlitro de tampão de enzima de restrição, um microlitro de TDT, um microlitro de ATP, um microlitro de enzima Bbs1, um microlitro de ligase T7 e água até um volume total de 20 microlitros. Misture bem pipetando, inclua um controle negativo que contenha o vetor.

Execute as reações em um termociclador, usando as seguintes configurações, para clonar três e quatro concatemeros de gRNA, execute 50 ciclos a 37 graus Celsius por cinco minutos e 21 graus Celsius por cinco minutos, mantenha a 37 graus Celsius por 15 minutos e depois mantenha a quatro graus Celsius indefinidamente. Para dois concatemeros de gRNA, execute as mesmas configurações com 25 ciclos da etapa um. Quando a reação de embaralhamento Bbs1 estiver completa, pegue 11 microlitros de cada mistura de ligadura e adicione 1,5 microlitros de tampão exonuclease, 1,5 microlitros de ATP, um microlitro de exonuclease de DNA e água até um volume total de 15 microlitros.

Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos, seguido de 70 graus Celsius por 30 minutos. Posteriormente, a mistura de reação é usada para transformar bactérias E.Coli quimicamente competentes, seguindo um protocolo padrão. Para confirmar a presença de inserções de gRNA no vetor concatemer CRISPR, escolha colônias de bactérias com uma alça inoculante e inocule cada uma em quatro mililitros de meio LB.

Cultive os clones durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador orbital. No dia seguinte, o DNA é extraído usando um kit miniprep de plasmídeo, de acordo com as instruções do fabricante. Misture aproximadamente 200 nanogramas de cada amostra de DNA com 10 unidades de EcoR1 e cinco unidades de BglII em uma reação de 10 microlitros.

Incluir uma mistura de reacção separada com o vector original correspondente como controlo positivo para a comparação do tamanho. Incube as reações a 37 graus Celsius por três horas. Execute as reações de digestão em um gel de agarose a 1% a 90 volts por aproximadamente 20 minutos.

Visualize o gel usando um transiluminador UV para identificar os clones com o tamanho correto da inserção. Para confirmar que os gRNAs foram clonados na posição correta e, consequentemente, todos os locais de reconhecimento de Bbs1 foram perdidos, digerir os clones selecionados com cinco unidades de Bbs1. Inclua uma mistura de reação separada, com o vetor original correspondente como controle.

Incube a 37 graus Celsius por três horas, execute as reações de digestão em um gel de agarose a 1% a 90 volts por aproximadamente 20 minutos. Visualize o gel usando um transiluminador UV para identificar os vetores que não são cortados por Bbs1. Ao dividir organoides para eletroporação, semeie um mínimo de seis poços de uma placa de 48 poços por transvecção.

Semeie os organoides em gotas de matriz de embasamento de 20 microlitros e cultive-os em 250 microlitros de WENR mais meio de nicotinamida por poço a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. No segundo dia, substitua o meio WENR mais nicotinamida por 250 microlitros de EGF mais noggin, inibidor de GSK3 e meio inibidor de rocha sem antibióticos. No terceiro dia, troque o meio organoide para EGF mais noggin, inibidor de GSK3, inibidor de rocha e 1,25% de dimetilsulfóxido sem antibióticos.

No quarto dia, interrompa as cúpulas da matriz do embasamento, usando uma ponta de pipeta de um mililitro e transfira organoides para um tubo de 1,5 mililitro. Puxe o conteúdo de quatro poços de uma placa de 48 poços em um tubo. Quebre mecanicamente os organoides em pequenos fragmentos pipetando para cima e para baixo com a pipeta P200 aproximadamente 200 vezes.

Centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Após centrifugação, remova o meio de todos os tubos e ressuspenda as paletas em um mililitro de uma protease recombinante de grau de cultura de células. Incube a 37 graus Celsius por no máximo cinco minutos.

É importante monitorar cuidadosamente o tratamento com protease, pois o sucesso da eletroporação depende da obtenção de uma suspensão celular que contenha aglomerados de células em vez de células únicas. Verifique uma gota de 50 microlitros de amostra sob um microscópio de luz invertida com uma objetiva de quatro vezes. Aglomerados de 10 a 15 células são desejáveis, pois isso aumenta a sobrevivência celular após a eletroporação.

Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros de baixa ligação e monopolize a dissociação adicionando nove mililitros de meio basal sem antibióticos. Centrifugue a 600 vezes G por cinco minutos em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e voltar a suspender a paleta em um mililitro de soro reduzido.

Conte o número de células com uma câmara de Burkes, é necessário um mínimo de uma vez 10 elevado à quinta célula por reação de eletroporação. Comece este procedimento adicionando nove mililitros de meio sérico reduzido ao tubo de 15 mililitros contendo a suspensão celular e centrifugue a 400 vezes G por três minutos à temperatura ambiente. Remova todo o sobrenadante e ressuspenda a paleta em uma solução de eletroporação.

Adicione uma quantidade total de 10 microgramas de DNA a dois novos tubos. Em seguida, adicione a solução de eletroporação a um volume final de 100 microlitros e mantenha a mistura de DNA celular no gelo. Transfira a mistura de DNA celular para a cubeta de eletroporação, coloque a cubeta na câmara do eletroporador.

Meça a impedância pressionando o botão apropriado no eletroporador e certifique-se de que seja de 0.030 a 0.055 ohm. Realize a eletroporação de acordo com as configurações indicadas no protocolo de texto. Adicione 400 microlitros de tampão de eletroporação mais inibidor de rocha à cubeta e, em seguida, transfira todo o seu conteúdo para um tubo de 1,5 mililitro.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir que as células se recuperem. Após 30 minutos, gire a 400 vezes G por três minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e ressuspenda a paleta em 20 microlitros por poço de matriz de embasamento.

Semeie aproximadamente uma vez 10 elevado à quarta a uma vezes 10 elevado à quinta células por poço em uma placa de 48 poços e adicione EGF mais noggin, inibidor de GSK3, inibidor de rocha e meio de 1,25% de dimetilsulfóxido. Incubar a 37 graus Celsius. No dia seguinte, troque o meio para EGF mais noggin, inibidor de GSK3 e inibidor de rocha e verifique a eficiência da transvecção observando a expressão de GFP.

Mantenha os organoides a 37 graus Celsius. Dois dias depois, substitua o meio por meio fresco. Quatro dias após a eletroporação, troque o meio para WENR mais nicotinamida e meio inibidor de rocha e continue a incubar as células a 37 graus Celsius.

A presença do número correto de inserções de gRNA no vetor concatemer é confirmada pela digestão de dupla restrição com EcoR1 e BglII. O tamanho esperado da banda inferior é de aproximadamente 1,6 quilobase para um vetor concatemer de quatro gRNA e 1,2 kilobase para um vetor concatemer de três gRNA. Além disso, a digestão com Bbs1 confirma que os gRNAs foram clonados na posição correta e, consequentemente, todos os locais de reconhecimento de Bbs1 são perdidos.

As construções confirmadas são entregues aos organoides intestinais de camundongos por eletroporação para atingir a eficiência de transvecção de até 70%, conforme mostrado pela expressão de GFP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar vetores concatemeros de gRNA e como entregá-los com eficiência a culturas organoides 3D usando eletroporação, a fim de obter o nocaute de vários genes ao mesmo tempo.