Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

O objetivo geral deste protocolo é descrever os procedimentos necessários para a geração bem-sucedida de camundongos geneticamente modificados por microinjeção de oócitos. Este protocolo pode ajudar pesquisadores e equipe técnica envolvidos no campo da gênese de camundongos, mas também no direcionamento de genes. A principal vantagem desta técnica, é que ela conta com a injeção direta de oócitos de camundongos, tanto para integração aleatória, mas também para direcionamento de genes, permitindo a geração de camundongos geneticamente modificados em apenas seis semanas.

Para preparar um único RNA guia, depois de selecionar as duas sequências alvo desejadas e fazer primers de acordo com o protocolo de texto, sintetize um molde de DNA linear diluindo o plasmídeo PX330 a 10 nanogramas por microlitro em água livre de nuclease. Prepare uma mistura master, adicionando a polimerase no final, e mantenha no gelo. Em seguida, misture e divida a solução em oito tubos de PCR.

Adicione um microlitro de PXR330 por tubo e execute o programa a seguir. Em seguida, use um kit de purificação de PCR, um coletor e uma fonte de vácuo para purificar o produto de PCR. Adicione cinco volumes de tampão de ligação a um volume da amostra de PCR e misture.

Coloque a coluna giratória da membrana de silício no coletor. Para ligar o DNA, aplique todas as oito amostras na coluna, no vácuo. Para lavar a amostra, adicione 0,75 mililitros de tampão de lavagem à coluna e aspire.

Em seguida, centrifugar a coluna a 12 000 vezes G durante 60 segundos para eliminar o etanol residual. Coloque a coluna em um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro e, em seguida, para eluir o DNA, adicione 30 microlitros de água livre de nuclease ao centro da membrana. Deixe a coluna repousar durante um minuto e centrifugue-a, 12 000 vezes G durante 60 segundos.

Em seguida, use um espectrofotômetro para medir a concentração de DNA. Para realizar a transcrição in vitro usando um kit de síntese de RNA t7, prepare o master mix e incube a reação em um termociclador a 37 graus Celsius por três horas. Adicione 28 microlitros de água livre de nuclease e dois microlitros de DNAse um e incube a reação por mais 15 minutos.

Para purificar o RNA, dissolva o pó contido na coluna de centrifugação fornecida e 650 microlitros de tampão de microinjeção livre de nuclease. Removendo cuidadosamente todas as bolhas de ar, tampe o tubo e hidrate a solução em temperatura ambiente por cinco a 15 minutos. Remova a tampa azul na parte inferior e coloque a coluna em um tubo de dois mililitros.

Em seguida, centrifugue o tubo a 750 vezes G à temperatura ambiente durante dois minutos. Em seguida, coloque a coluna em um tubo novo de 1,5 mililitro e aplique 50 microlitros da solução de RNA gota a gota no centro, sem tocar na parede da coluna. Em seguida, gire a coluna a 750 vezes G por dois minutos.

Meça a concentração de RNA e avalie a qualidade do RNA de acordo com o protocolo de texto. Usando tampão de microinjeção livre de nuclease, dilua o caso nove mRNA a 50 nanogramas por microlitro e os sgRNAs a 12,5 nanogramas por microlitro para experimentos de nocaute de genes. Adicione o modelo do doador a uma concentração de 200 nanogramas por microlitro, para edição do genoma com base no reparo direto por homologia e mantenha-o no gelo.

Use o bocal do aspirador para lavar os oócitos com quatro gotas frescas de aminoácidos caseína. E transfira-os para uma gota final de meio casome oito, coberto com óleo mineral. Para realizar a injeção pró-nuclear para integração aleatória, sob o microscópio estereoscópico, use o bocal do aspirador para transformar aproximadamente 50 ovos em uma gota de meio m2, revestida com óleo mineral que será usado como câmara de injeção.

Transfira a câmara de injeção para um microscópio invertido e injete os oócitos fertilizados com alguns picolitros da mistura de injeção. O pronúcleo inchará se a injeção for bem-sucedida. Realize a injeção citoplasmática para direcionamento de genes, use um bocal para transferir aproximadamente 50 ovos para uma gota de casoma A, contendo cinco microgramas por mililitro de citocalasina B e incube os ovos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos.

Transfira os ovos para a câmara de injeção e, em seguida, a uma pressão muito baixa, injete alguns picolitros da mistura de injeção no citoplasma. Usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado sempre que possível. Após a injeção, use o bocal para transferir os oócitos de volta para uma gota de casomeaminoácidos.

Mantenha-os a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que sejam carregados para reimplantação no oviduto das fêmeas pseudo-grávidas. Após anestesiar um camundongo fêmea plugado de acordo com o protocolo de texto, para realizar o reimplante em condições estéreis, expor o trato reprodutivo usando um bisturi a uma incisão de um centímetro de comprimento paralela à linha média dorsal. Em seguida, com uma tesoura, corte o músculo e use uma pinça para agarrar a almofada de gordura.

Puxe suavemente o ovário para fora, até que o oviduto e o útero estejam claramente visíveis. Em seguida, use uma braçadeira de vaso para fixar a almofada de gordura. Sob o microscópio estereoscópico, use uma microtesoura para fazer uma incisão na parede do oviduto, alguns milímetros a montante da ampola.

Além disso, sob o microscópio estéreo, coloque 25 ovos micro injetados no capilar de vidro conectado ao bocal. Em seguida, insira o capilar de vidro no oviduto e expulse os ovos até que uma bolha de ar seja visível dentro da ampola. Para garantir que o reimplante foi bem-sucedido, você deve verificar a presença da bolha de ar na ampola, o que garante que todos os óvulos foram expelidos no local certo e nenhum permanece no capilar de vidro.

Remova suavemente o capilar de vidro e coloque o trato reprodutivo de volta no abdômen. Em seguida, use três suturas cirúrgicas zero e não absorvíveis para suturar a incisão e, em seguida, use clipes de ferida para fechar a pele. Coloque o mouse em um tapete quente para evitar hipotermia e injete analgésico por via subcutânea.

Monitore o mouse até uma recuperação completa. Por fim, realize a tipagem e sequenciamento do genoma de acordo com o protocolo de texto. Esta figura mostra géis analíticos demonstrando a qualidade da purificação do transgene e a síntese de sgRNA, que são essenciais para gerar com sucesso camundongos geneticamente modificados.

Aqui é mostrada uma leitura típica de uma sessão de microinjeção para integração aleatória. O primer de genotipagem deve ficar no transgene e deve ser projetado para gerar um fragmento de 200 a 800 pares de bases. Nesta leitura para direcionamento de genes, os primers para selecionados para hibridizar com o DNA genômico fora da região acabaram sendo extirpados pelos dois caras.

Essa estratégia permite a identificação direta de fundadores heterozigotos e homozigotos. Conforme ilustrado aqui, quando cada etapa do protocolo é otimizada, a porcentagem de filhotes transgênicos deve chegar a 10% a 25% para integração aleatória, o que é um pouco baixo em comparação com a capacidade dos componentes CRISPR de editar o genoma do camundongo. Usando CRISPR para direcionamento de genes, o número de fundadores é geralmente maior, variando de 25% a 100% não é incomum obter uma progênie inteira que é homozigótica com sucesso quando editada usando CRISPR.

Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que pesquisadores em áreas como neurociência ou câncer, por exemplo, usem novos modelos de máscara para descobrir mecanismos patológicos e, eventualmente, traduzir isso em estratégias terapêuticas.