Name: Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a analisar alterações celulares e morfométricas no côndilo mandibular de camundongos usando radiografias e histologia. Este método avalia os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar.

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Os autores gostaria de agradecer Dr. David Rowe para gentilmente fornecer os ratos transgénicos e Li Chen pela assistência histológica.
A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Dental & pesquisa Craniofacial do institutos nacionais da saúde sob prêmio número K08DE025914 e pela Associação Americana de fundação ortodôntico para Sumit Yadav.

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<li>Shen, G., Darendeliler, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Adaptive+Remodeling+of+Condylar+Cartilage-+A+Transition+from+Chondrogenesis+to+Osteogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis.</a> J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).</li>
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<li>Kaul, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Altered+Loading+on+Mandibular+Condylar+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage.</a> PLoS ONE. 11 (7), 0160121(2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput%2C+Multi-Image+Cryohistology+of+Mineralized+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues.</a> J Vis Exp. , e54468(2016).</li>
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</ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Este manuscrito descreve métodos para a medição de morfometria e análise celular dos côndilos mandibulares murino e mandíbulas. As medições radiográficas morfométricas também podem ser usadas para analisar outros ossos de pequenos animais experimentais. Além disso, a análise celular (célula quantificação e mapeamento de distância de cartilagem) não estão limitada a do côndilo mandibular roedor, mas pode ser usado para quantificar a cortes histológicos de tecidos diversos.
Modelos de rato trans...

A TMJ é uma articulação de carga exclusiva localizada na região craniofacial e é formada de fibrocartilagem. O MCC da TMJ é essencial para a função da articulação, incluindo o movimento da mandíbula sem impedimentos ao falar e mastigar, mas geralmente é afetado por doenças degenerativas, incluindo osteoartrite1. A TMJ tem a capacidade de adaptação a estímulos externos e alterações de carga, levando a alterações estruturais e celulares para os componentes do MCC2,3,4,5. As propriedades de carga do MCC podem ser explicadas pelas interações entre seus componentes, incluindo a água, a rede de colágeno e densamente proteoglicanos. O MCC tem quatro zonas distintas de celulares que expressam diferentes tipos de proteínas de colágeno e não-colágeno: 1) a zona superficial ou articular; 2) a zona proliferativa, composta de células mesenquimais indiferenciadas e que responde ao carregar as demandas; 3) a zona de prehypertrophic, composto de condrócitos maduros expressando colágeno tipo 2; e 4) a hipertrófica de zona, a região onde os condrócitos hipertróficas expressando colágeno tipo 10 morrer e sofrer calcificação. A região não-mineralizado é rica em proteoglicanos que proporcionam resistência a forças compressivas6.
Há contínua mineralização na zona hipertrófica do MCC, onde ocorre a transição da condrogênese a osteogênese, garantindo a robusta estrutura mineral do osso subcondral do côndilo mandibular7. As mudanças celulares em regiões não mineralizadas e mineralizadas, finalmente, levam a alterações morfológicas e estruturais no côndilo mandibular e maxilar inferior. Manutenção da homeostase de todas as regiões celulares do MCC e a mineralização da parte subcondral são essenciais para a saúde, capacidade load-bearing e integridade da TMJ.
O modelo de rato transgénico colágeno múltipla (como descrito por Utreja et al) 8 é uma ótima ferramenta para usar para entender mudanças na expressão do colágeno, porque todos os transgenes são expressas em MCC. Para uma avaliação aprofundada e histológica, manchas histológicas são utilizadas para estudar a deposição de matriz, mineralização, proliferação celular, apoptose, e expressão de proteínas para as camadas de células diferentes do MCC.
Neste manuscrito, histológico e análises morfométricas são usadas para avaliar as alterações estruturais e celulares no MCC e subcondral osso do côndilo mandibular de ratos. Além disso, um método de quantificação de célula, para a análise de imagens histológicas fluorescentes e para mapear as corrediças do microscópio de luz, é descrito. A TMJ estática à compressão carregando o método, que provoca alterações celulares e morfológicas na MCC e subcondral osso9, também é ilustrada para validar nossos métodos.
Os métodos descritos aqui podem ser usados para determinar morfométricos e as alterações histológicas no côndilo mandibular e maxilar inferior de roedores ou para analisar outras regiões de ossificação endocondral e a morfologia dos tecidos mineralizados adicionais.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Radiografia MX20</td><td>Faxitron X-Ray LLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de imagem digimizador</td><td>Software</td><td></td><td></td>MedCalc</tr><tr><td>Resina de incorporação Shandon Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio manual Axio Imager Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>208562</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteína fluorescente amarelo&nbsp; - EYFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteína fluorescente ciano - ECFP</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>filtro de proteína fluorescente vermelho - Cy5</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>L-tartarato de sódio dibásico di-hidratado&nbsp;</td>Nitrito de <td>sódio 228729</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Substrato Sigma-Aldrich</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>ELF97</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E6600</td><td></td></tr><tr><td>ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10339;</td><td>inclui EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina)&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop&nbsp;</td><td>Adobe Systems Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tamponados com fosfato (PBS)</td><td>Research Products International</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>CNA Beta III Nickel-Free Archwire</td><td>Ortho Organizers, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prisma GraphPad&nbsp;</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método de análise celular para o côndilo mandibular murino e morfométricas

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

Articulação temporomandibular (ATM) tem a capacidade de adaptação a estímulos externos, e carregar as alterações pode afetar a posição dos côndilos, bem como os componentes estruturais e celulares da cartilagem condilar mandibular (MCC). Este manuscrito descreve métodos para analisar estas mudanças e um método para alterar o carregamento da TMJ em camundongos (i.e., à compressão estática TMJ carregando). A avaliação estrutural ilustrada aqui é uma abordagem simples morfométricos que usa o software Digimizer e é executada em radiografias de ossos pequenos. Além disso, a análise de celulares muda levando a alterações na expressão do colágeno, a remodelação óssea, a divisão celular, e proteoglycan distribuição no MCC é descrita. A quantificação dessas mudanças em cortes histológicos - contando os pixels fluorescentes positivos usando imagem de software e o mapeamento de distância de medição e manchado área com Digimizer - também é demonstrado. Os métodos mostrados aqui não são limitados a TMJ murino, mas podem ser usados em ossos adicionais de pequenos animais experimentais e em outras regiões de ossificação endocondral.

Estatísticas descritivas foram realizadas para examinar a distribuição de medidas morfométricas (comprimento mandibular, condilar comprimento, largura condilar) e análise histológica. Os resultados foram comparados entre o grupo carregado (ou seja, ratos submetidos a carga compressiva com a mola de titânio beta) e grupo controle (ou seja, ratos de controle que não recebeu qualquer procedimento de correspondência). Diferenças estatisticamente significativas entre médias f...

Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.

Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

O objetivo geral deste experimento é observar os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular de camundongos, utilizando medições morfométricas em radiografias e análise histológica. Essas métricas podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as alterações estruturais e celulares dentro do côndilo da mandíbula de roedores. A principal vantagem da técnica aqui apresentada é que ela pode ser utilizada para analisar outros animais pequenos recém-nascidos ou participantes.Para este protocolo, tenha mandíbulas de camundongo isoladas e dissecadas prontas para uso. Em uma placa de Petri, transfira as mandíbulas para um sistema de gabinete de raios X. Em seguida, obtenha radiografias a 26 quilovolts durante cinco segundos.Agora, abra as imagens no software de análise para realizar medições morfométricas. Primeiro, use o botão de unidade para configurar a barra de escala. Em seguida, selecione seis pontos anatômicos utilizando o marcador do estilo 2.Primeiro, selecione os pontos mais posteriores do côndilo mandibular como ponto um. Em seguida, selecione o processo incisivo como ponto dois. Depois, selecione o ponto mais profundo da incisura sigmoide como ponto três.Em seguida, selecione o ponto mais profundo na concavidade do ramo da mandíbula, ponto quatro, e depois selecione o ponto mais anterior da superfície articular do côndilo, ponto cinco. Agora, selecione o ponto mais posterior da superfície articular do côndilo como ponto seis e prossiga com a realização de medições de comprimento utilizando a ferramenta de comprimento. Em seguida, utilize a ferramenta de linha perpendicular dos pontos três a quatro para medir o comprimento da cabeça do côndilo, que é o comprimento da perpendicular, do ponto um até a linha entre os pontos três e quatro.Em seguida, meça o comprimento mandibular, entre os pontos um e dois. Por fim, meça a largura da cabeça do côndilo, que está entre os pontos cinco e seis. Para salvar os dados, copie a lista de medidas no lado direito da tela.Antes de embutir as mandíbulas fixadas, mas não descalcificadas, mergulhe-as durante a noite em sacarose a 30 por cento em PBS. No dia seguinte, dissecar qualquer tecido mole em excesso e cortar cuidadosamente o côndilo mandibular. Em seguida, coloque as amostras em moldes plásticos, com a superfície medial do côndilo contra a base do molde e a amostra paralela ao fundo do molde.Em seguida, mergulhe-os na resina de inclusão e resfrie a resina com um pedaço de gelo seco. Depois, complete as fôrmas com mais resina de inclusão. Transfira-as para butano dimetílico frio, resfriado por freezer ou por gelo seco.Uma vez resfriados, armazene os espécimes a menos 20 graus Celsius ou a menos 80 graus Celsius para corte. Para quantificar a expressão de Col10a1 na MCC de cortes sagitais dos cônquilos, abra as imagens histológicas em um software de análise de imagem e selecione a área de interesse usando a ferramenta laço. Neste caso, a região da MCC é selecionada.Observe o número de pixels na área, que é informado na caixa de histograma. Em seguida, selecione os pixels vermelhos de Col10a1 ajustando a faixa de cores. Use a ferramenta conta-gotas para selecionar um pixel vermelho da imagem e clique em OK. Depois, registre o número de pixels vermelhos na área, conforme informado na caixa de histograma.A fração de pixels vermelhos na área representa a quantidade de expressão de Col10a1. Agora, utilizando a mesma técnica básica, quantifique a atividade de TRAP na MCC e no osso subcondral. Primeiro, selecione a cartilagem nas regiões do osso subcondral como as áreas a serem analisadas e anote o número total de pixels.Em seguida, selecione os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97. Anote o número de pixels positivos e calcule a fração de pixels positivos para TRAP. Agora, quantifique as células positivas para EDU que são contra-coloridas em azul pelo DEPI.Novamente, selecione a área de interesse e, em seguida, quantifique os pixels azuis dentro dela. Utilize também este método para determinar o número de pixels positivos para EDU na mesma região. Medidas morfométricas de camundongos submetidos à carga compressiva na ATM mostraram que a carga aumentou significativamente o comprimento da mandíbula e da cabeça do côndilo.No entanto, a carga não resultou em uma alteração significativa na largura do côndilo. A quantificação da distribuição de colágeno revelou um aumento significativo na expressão de Col10a1 e na MCC dos côndilos dos animais submetidos à carga. Por outro lado, a expressão de Col2a1 não diferiu muito do controle.A atividade de TRAP aumentou na região subcondral dos c&ocirc;ndilos e nos camundongos submetidos a carga, assim como a prolifera&ccedil;&atilde;o sub. A colora&ccedil;&atilde;o por EDU indica o n&uacute;mero de c&eacute;lulas proliferativas. A distribui&ccedil;&atilde;o de proteoglicanos na CCM foi quantificada mediante a avalia&ccedil;&atilde;o da &aacute;rea corada com azul de toluidina e do mapa de dist&acirc;ncia.Houve um aumento significativo na distância de mapeamento no MCC dos c&ocirc;ndilos do grupo carregado. No entanto, a &aacute;rea corada para proteoglicanos n&atilde;o apresentou diferen&ccedil;a estat&iacute;stica entre os grupos. Ap&oacute;s assistir a este v&iacute;deo, voc&ecirc; dever&aacute; ter uma boa compreens&atilde;o de como analisar as altera&ccedil;&otilde;es celulares e estruturais no c&ocirc;ndilo mandibular de roedores.

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