Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

O objetivo geral deste experimento é observar os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular de camundongos, utilizando medições morfométricas em radiografias e análise histológica. Essas métricas podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as alterações estruturais e celulares dentro do côndilo da mandíbula de roedores. A principal vantagem da técnica aqui apresentada é que ela pode ser utilizada para analisar outros animais pequenos recém-nascidos ou participantes.

Para este protocolo, tenha mandíbulas de camundongo isoladas e dissecadas prontas para uso. Em uma placa de Petri, transfira as mandíbulas para um sistema de gabinete de raios X. Em seguida, obtenha radiografias a 26 quilovolts durante cinco segundos.

Agora, abra as imagens no software de análise para realizar medições morfométricas. Primeiro, use o botão de unidade para configurar a barra de escala. Em seguida, selecione seis pontos anatômicos utilizando o marcador do estilo 2.

Primeiro, selecione os pontos mais posteriores do côndilo mandibular como ponto um. Em seguida, selecione o processo incisivo como ponto dois. Depois, selecione o ponto mais profundo da incisura sigmoide como ponto três.

Em seguida, selecione o ponto mais profundo na concavidade do ramo da mandíbula, ponto quatro, e depois selecione o ponto mais anterior da superfície articular do côndilo, ponto cinco. Agora, selecione o ponto mais posterior da superfície articular do côndilo como ponto seis e prossiga com a realização de medições de comprimento utilizando a ferramenta de comprimento. Em seguida, utilize a ferramenta de linha perpendicular dos pontos três a quatro para medir o comprimento da cabeça do côndilo, que é o comprimento da perpendicular, do ponto um até a linha entre os pontos três e quatro.

Em seguida, meça o comprimento mandibular, entre os pontos um e dois. Por fim, meça a largura da cabeça do côndilo, que está entre os pontos cinco e seis. Para salvar os dados, copie a lista de medidas no lado direito da tela.

Antes de embutir as mandíbulas fixadas, mas não descalcificadas, mergulhe-as durante a noite em sacarose a 30 por cento em PBS. No dia seguinte, dissecar qualquer tecido mole em excesso e cortar cuidadosamente o côndilo mandibular. Em seguida, coloque as amostras em moldes plásticos, com a superfície medial do côndilo contra a base do molde e a amostra paralela ao fundo do molde.

Em seguida, mergulhe-os na resina de inclusão e resfrie a resina com um pedaço de gelo seco. Depois, complete as fôrmas com mais resina de inclusão. Transfira-as para butano dimetílico frio, resfriado por freezer ou por gelo seco.

Uma vez resfriados, armazene os espécimes a menos 20 graus Celsius ou a menos 80 graus Celsius para corte. Para quantificar a expressão de Col10a1 na MCC de cortes sagitais dos cônquilos, abra as imagens histológicas em um software de análise de imagem e selecione a área de interesse usando a ferramenta laço. Neste caso, a região da MCC é selecionada.

Observe o número de pixels na área, que é informado na caixa de histograma. Em seguida, selecione os pixels vermelhos de Col10a1 ajustando a faixa de cores. Use a ferramenta conta-gotas para selecionar um pixel vermelho da imagem e clique em OK. Depois, registre o número de pixels vermelhos na área, conforme informado na caixa de histograma.

A fração de pixels vermelhos na área representa a quantidade de expressão de Col10a1. Agora, utilizando a mesma técnica básica, quantifique a atividade de TRAP na MCC e no osso subcondral. Primeiro, selecione a cartilagem nas regiões do osso subcondral como as áreas a serem analisadas e anote o número total de pixels.

Em seguida, selecione os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97. Anote o número de pixels positivos e calcule a fração de pixels positivos para TRAP. Agora, quantifique as células positivas para EDU que são contra-coloridas em azul pelo DEPI.

Novamente, selecione a área de interesse e, em seguida, quantifique os pixels azuis dentro dela. Utilize também este método para determinar o número de pixels positivos para EDU na mesma região. Medidas morfométricas de camundongos submetidos à carga compressiva na ATM mostraram que a carga aumentou significativamente o comprimento da mandíbula e da cabeça do côndilo.

No entanto, a carga não resultou em uma alteração significativa na largura do côndilo. A quantificação da distribuição de colágeno revelou um aumento significativo na expressão de Col10a1 e na MCC dos côndilos dos animais submetidos à carga. Por outro lado, a expressão de Col2a1 não diferiu muito do controle.

A atividade de TRAP aumentou na região subcondral dos côndilos e nos camundongos submetidos a carga, assim como a proliferação sub. A coloração por EDU indica o número de células proliferativas. A distribuição de proteoglicanos na CCM foi quantificada mediante a avaliação da área corada com azul de toluidina e do mapa de distância.

Houve um aumento significativo na distância de mapeamento no MCC dos côndilos do grupo carregado. No entanto, a área corada para proteoglicanos não apresentou diferença estatística entre os grupos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar as alterações celulares e estruturais no côndilo mandibular de roedores.