Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas
January 11th, 2018
Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.
O objetivo geral deste experimento é observar os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular de camundongos usando medidas morfométricas em radiografias e análises histológicas. Essas métricas podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre as mudanças estruturais e celulares no côndilo da mandíbula dos roedores. A principal vantagem da técnica mostrada aqui é que eles podem ser usados para analisar outros pequenos animais nascidos ou participantes.
Para este protocolo, ter mandíbulas de camundongo isoladas e dissecadas prontas para uso. Em uma placa de Petri, transfira as mandíbulas para um sistema de gabinete de raios-x. Em seguida, faça radiografias a 26 quilovolts por cinco segundos.
Agora, abra as imagens no software de análise para fazer medições morfométricas. Primeiro, use o botão da unidade para configurar a barra de escala. Em seguida, selecione seis pontos anatômicos usando o estilo de marcador 2.
Primeiro, selecione os pontos mais posteriores do côndilo mandibular como ponto um. Em seguida, selecione o processo incisivo para o ponto dois. Em seguida, selecione o ponto mais profundo no entalhe sigmóide para o ponto três.
Em seguida, selecione o ponto mais profundo da concavidade do ramo mandibular, ponto quatro e, em seguida, selecione o ponto mais anterior da superfície articular condilar, ponto cinco. Agora, selecione o ponto mais posterior da superfície articular condilar como ponto seis e prossiga com as medições de comprimento usando a ferramenta de comprimento. Em seguida, use a ferramenta de linha perpendicular dos pontos três a quatro para medir o comprimento da cabeça do côndilo, que é o comprimento da perpendicular, do ponto um até a linha entre os pontos três e quatro.
Em seguida, meça o comprimento mandibular, entre os pontos um e dois. Por fim, meça a largura da cabeça do côndilo, que está entre os pontos cinco e seis. Para salvar os dados, copie a lista de medidas no lado direito da tela.
Antes de incorporar as mandíbulas fixas, mas não descalcificadas, mergulhe-as durante a noite em sacarose a 30% em PBS. No dia seguinte, disseque qualquer excesso de tecido mole e corte cuidadosamente o côndilo mandibular. Agora, coloque as amostras em moldes de plástico, com a superfície medial do côndilo contra a base do molde e a amostra paralela ao fundo do molde.
Em seguida, mergulhe-os em resina embutida e resfrie a resina com um pedaço de gelo seco. Em seguida, complete os moldes com mais resina de incorporação. Transfira-os para dois metilbutano frios, resfriados por um freezer ou por gelo seco.
Depois de resfriados, armazene as amostras a 20 graus Celsius negativos ou a 80 graus Celsius negativos para seccionamento. Para quantificar a expressão de Col10a1 no CCM de cortes sagitais de côndilos, abra as imagens histológicas em um pacote de software de análise de imagem e selecione a área de interesse usando a ferramenta laço. Nesse caso, a região MCC é selecionada.
Anote o número de pixels na área, que é relatado na caixa de histograma. Em seguida, selecione os pixels vermelhos Col10a1 ajustando a faixa de cores. Use a ferramenta conta-gotas para selecionar um pixel vermelho da imagem e clique em OK. Em seguida, registre o número de pixels vermelhos na área, conforme relatado na caixa do histograma.
A fração de pixels vermelhos na área representa a quantidade de expressão Col10a1. Agora, usando a mesma técnica básica, quantifique a atividade do TRAP no MCC e no osso subcondral. Primeiro, selecione a cartilagem nas regiões ósseas subcondrais como as áreas a serem analisadas e anote o total de pixels.
Em seguida, selecione os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97. Anote o número de pixels positivos e calcule a fração de pixels positivos TRAP. Agora, quantifique as células positivas para EDU que são contra-coradas em azul por DEPI.
Novamente, selecione a área de interesse e quantifique os pixels azuis dentro dela. Use também esse método para determinar o número de pixels positivos EDU na mesma região. Medidas morfométricas de camundongos, submetidos à carga compressiva da ATM, mostraram que a carga aumentou significativamente o comprimento da cabeça da mandíbula e do côndilo.
No entanto, o carregamento não resultou em uma mudança significativa na largura do côndilo. A quantificação da distribuição de colágeno revelou um aumento significativo na expressão de Col10a1 e no MCC dos côndilos dos animais carregados. Por outro lado, a expressão de Col2a1 não foi muito diferente do controle.
A atividade de TRAP aumentou na região subcondral de côndilos e camundongos carregados, assim como a subproliferação. A coloração EDU denota o número de células proliferativas. A distribuição de proteoglicanos no CCM foi quantificada avaliando-se a área corada com azul de toluidina e o mapa de distância.
Houve um aumento significativo no mapeamento de distâncias no CCM dos côndilos do grupo carregado. No entanto, a área corada com proteoglicanos não foi estatisticamente diferente entre os grupos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as mudanças celulares e estruturais no côndilo mandibular de roedores.
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Visão Geral
Este manuscrito apresenta métodos para analisar mudanças morfométricas e celulares no côndilo mandibular de roedores. O estudo se concentra nos efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular de camundongos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Ortopedia
Fundamento
- Compreender as mudanças estruturais e celulares na mandíbula é crucial para vários estudos biológicos.
- A carga compressiva pode afetar a saúde e o desenvolvimento da cartilagem.
- Roedores servem como modelo para estudar essas mudanças devido às suas semelhanças anatômicas com os humanos.
- Análises radiográficas e histológicas são essenciais para avaliar essas mudanças.
Objetivo do Estudo
- Observar os efeitos da carga compressiva na cartilagem condilar mandibular.
- Utilizar medições morfométricas para avaliar mudanças estruturais.
- Fornecer um protocolo que possa ser aplicado a outros pequenos animais.
Métodos Utilizados
- Isolamento e dissecação de mandíbulas de camundongos.
- Transferência das mandíbulas para um sistema de gabinete de raios-X.
- Imagem radiográfica a 26 kilovolts por cinco segundos.
- Análise histológica para avaliar mudanças celulares.
Principais Resultados
- Identificação de mudanças morfométricas no côndilo mandibular.
- Avaliação das alterações celulares devido à carga compressiva.
- Demonstração da eficácia das técnicas de imagem utilizadas.
- Possíveis aplicações dos métodos em outros estudos com pequenos animais.
Conclusões
- O estudo fornece insights valiosos sobre os efeitos da carga mecânica na cartilagem.
- Métodos desenvolvidos podem ser adaptados para aplicações mais amplas na pesquisa biológica.
- Pesquisas adicionais são necessárias para explorar os efeitos de longo prazo da carga compressiva.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of structural and cellular adaptations in the murine mandibular condyle under compressive loading, providing a preclinical model for mechanobiology studies relevant to temporomandibular joint disorders. By linking mechanical stimuli to molecular and histological endpoints such as Col10a1 expression, TRAP activity, and proteoglycan distribution, the approach supports target validation in cartilage homeostasis pathways. The morphometric and imaging workflow offers a scalable, reproducible platform for de-risking therapeutic hypotheses in jaw development and osteoarthritic conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways in mandibular condylar cartilage through quantification of collagen expression and cellular proliferation.
- Operational Value: Provides standardized morphometric and histological readouts to validate target engagement in cartilage remodeling processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative outputs including pixel-based fluorescence intensity and distance mapping for reproducible assessment of extracellular matrix changes.
- Operational Value: Uses accessible imaging tools (Digimizer, fluorescence microscopy) to establish standardized assays for collagen and proteoglycan analysis in small bone models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of TMJ loading conditions to evaluate cartilage degradation and repair mechanisms.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of structural adaptation and cellular response in murine models, enabling preclinical continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing early-phase structural and phenotypic data that inform target selection and mechanistic de-risking in joint tissue biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanical regulation of chondrocyte differentiation and matrix production via quantifiable morphometric and molecular endpoints.
- Screening: Enables assay readiness through standardized radiographic and histological quantification of condyle dimensions and molecular markers.
- Analytics: Delivers quantitative measurements including condyle length, width, Col10a1-positive pixel fraction, TRAP activity, and EDU-positive cell counts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects mechanical loading to histological outcomes in endochondral ossification regions, supporting preclinical validity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other small animal bones and ossification sites, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cartilage response to load by correlating structural changes with molecular markers of hypertrophy and remodeling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized imaging protocols and software-based quantification across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing objective, multi-parametric data on tissue adaptation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanobiology targets based on quantitative phenotypic outcomes in validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent dissection, radiographic imaging, and histological sectioning.
- Dependent on access to X-ray imaging systems, fluorescence microscopy, and image analysis software (e.g., Digimizer).
- Necessitates standardization of sample preparation, embedding, and sectioning protocols for consistent morphometric and cellular quantification.
- Adaptation to other bone sites requires validation of anatomical landmarks and region-of-interest definitions.
- Practical limitations include tissue size constraints and the need for careful handling to avoid decalcification during preparation.
