Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic
21 de outubro de 2015
Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.
O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar o intercolamento e extensão de condrócitos por meio da análise de células clonais de arco de zebra. Isso é conseguido gerando uma linha SOX 10 ERT de dois arcos de zebra Cree M para obter recombinação específica do tecido na cartilagem facial craniana e embriões para análise clonal. Em seguida, os embriões são pulsados com tamoxifeno no estágio 10, então ácaro por três horas para induzir o processo de recombinação.
Em seguida, os embriões são selecionados para a expressão da atividade CRE e forte expressão fluorescente vermelha ou RFP, e os embriões são montados para imagens da cartilagem craniofacial C. Os resultados mostram análise celular multiespectral dos condrócitos craniofaciais com base em imagens confocais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como S na coloração azul ou linhas transgênicas, como so e GFP ou SOX e kde, é que o arco zebra nos permite observar e seguir especificamente as populações de células clonais envolvidas na formação de um órgão.
Para se preparar para a coleta de embriões no primeiro dia, configure vários pares masculinos e femininos de sox, 10 ERT dois Cree zebra bow M peixe-zebra transgênico em tanques de acasalamento divididos entre cinco e 6:00 do dia seguinte, após verificar em um microscópio óptico que os embriões atingiram o estágio 10 de celulite sob um microscópio fluorescente com um filtro RFP. Isole os embriões vermelhos brilhantes e transfira-os para uma nova placa de Petri com meio E três fresco para induzir a recombinação Cree. Adicione 10 soluções micromolares de hidroxi tamoxifeno à placa de Petri e incube os embriões a 28,5 graus Celsius por três horas.
Em seguida, transvase a solução de tamoxifeno em um recipiente de lixo biológico e use E três para lavar os embriões várias vezes após incubar os embriões durante a noite para o 28 a 29, então estágio de ácaro, transfira os embriões para a solução E três PTU e devolva-os à incubadora. Para visualizar as estruturas craniofaciais C totalmente desenvolvidas, selecione embriões em quatro DPF com um sinal vermelho intenso e expressão de Cree amarelo na retina. Depois de anestesiar um embrião em Trica, de acordo com o protocolo de texto, transfira-o para uma placa de Petri contendo uma gota de metilcelulose em uma lâmina confocal limpa.
Coloque uma gota de metilcelulose fresca e use uma ponta de micro carregador para montar o embrião posicionado dorsalmente, tomando cuidado para não tocá-lo diretamente com uma lamínula de 25 por 25. Cubra o embrião e use a lamínula para manipular o embrião, se necessário. Para obter imagens do embrião, use uma objetiva de lente seca de 20 x.
Para focar o assunto, pressione o botão L 100 no microscópio e selecione o botão de configuração confocal. Clique em auto e selecione o CFP para o canal um, GFP para o canal dois e RFP ou M cherry para o canal três. Em seguida, feche a janela.
Ligue os canais dois e três antes de clicar no botão remover intertravamento. Em seguida, clique em reproduzir para iniciar a digitalização. Após ajustar as configurações, capture as imagens desejadas e salve no formato de software confocal, bem como no formato TIF para processamento de imagem por canal.
Para realizar imagens CFP, desligue os canais dois e três e ligue o canal um sem alterar a área de foco. Reajuste as configurações de digitalização antes de capturar imagens, salve as imagens conforme descrito e execute o processamento da imagem conforme descrito por pan e colegas, conforme mostrado aqui. A visualização tradicional da cartilagem por toda a coloração azul do Monte Sian tem sido inestimável na observação da cartilagem mekel em desenvolvimento e comumente usada para visualizar a organização celular final para analisar melhor os condrócitos em desenvolvimento ao longo do tempo traçando a linhagem.
O uso de linhas transgênicas SOX de 10 kda tem sido usado para estudar a migração celular e a convergência e extensão em embriões vivos usando imagens ao vivo da linha transgênica zebra bow m. Para estudar mais a fundo a organização dos condrócitos na estrutura esquelética craniofacial C, revela-se o processo de intercolação e alongamento dos condrócitos que medeia a extensão e o crescimento da cartilagem de meckel. Esta figura mostra a mandíbula inferior do arco zebra UI M Sox 10 ERT dois embriões transgênicos Cree entre 3D PF e cinco dias após a fertilização.
A mandíbula inferior é melhor retratada ventralmente para permitir uma visão clara da organização celular na cartilagem meles, como mostrado aqui. As cores mantidas de forma estável e herdadas permitem fácil rastreamento de linhagem e mapeamento do destino da célula da crista neural craniana. A única célula azul parece migrar e interpolar com suas células vizinhas, depois se alonga ao longo do eixo anterior posterior para formar um local de condra, mantendo assim a forma global da cartilagem meles à medida que se estende anteriormente.
Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento de gatos examinarem o condro na formação do esqueleto do peixe-zebra.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para visualização da intercalação e extensão de condrócitos na cartilagem craniofacial de peixe-zebra usando peixes transgênicos Zebrabow. A técnica permite a observação direta do comportamento dinâmico das células durante a formação de órgãos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Biologia Celular
Fundamentos
- A organização óssea craniofacial tem sido hipotetizada, mas não diretamente visualizada.
- Os condrócitos desempenham um papel crucial no desenvolvimento da cartilagem.
- Métodos existentes para estudar o comportamento celular têm limitações.
- A tecnologia Zebrabow permite a análise clonal de populações celulares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a intercalação de condrócitos e mudanças morfológicas.
- Demonstrar as vantagens do Zebrabow em relação aos métodos tradicionais.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores no campo.
Métodos Utilizados
- Geração da linha SOX 10 ERT2 Cre Zebrabow M para recombinação específica de tecido.
- Pulsação de embriões com tamoxifeno para induzir recombinação.
- Seleção de embriões com base na atividade CRE e expressão de RFP.
- Imageamento confocal para análise multiespectral de condrócitos craniofaciais.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da intercalação e extensão de condrócitos.
- Demonstração de populações celulares clonais envolvidas na formação de órgãos.
- Comparação da técnica Zebrabow com métodos existentes.
- Insights sobre o comportamento dinâmico das células na cartilagem craniofacial.
Conclusões
- A tecnologia Zebrabow fornece uma ferramenta poderosa para estudar o desenvolvimento craniofacial.
- O método melhora a compreensão da dinâmica dos condrócitos.
- Aplicações futuras podem se estender a outras áreas da biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding chondrocyte organization in craniofacial cartilage provides mechanistic insights into mandible morphogenesis, informing target validation for craniofacial disorders. The Zebrabow clonal analysis approach enables direct visualization of cellular behaviors driving tissue extension, supporting predictive confidence in preclinical models of mandibular development. This mechanistic de-risking value aids in prioritizing therapeutic hypotheses related to skeletal patterning and growth.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chondrocyte intercalation mechanisms that drive Meckel’s cartilage extension.
- Scientific Value: Supports functional validation of clonal contributions to craniofacial skeletal patterning.
- Scientific Value: Provides direct observation of cellular behaviors underlying hypoplastic mandible phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates multispectral clonal readouts for quantitative assessment of chondrocyte dynamics.
- Operational Value: Establishes a reproducible lineage-tracing platform for live imaging of cartilage morphogenesis.
- Operational Value: Enables standardized clonal analysis across developmental timepoints for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links clonal chondrocyte behavior to mandibular outgrowth, informing disease-relevant system relevance.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying cellular basis of mandibular hypoplasia.
- Translational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation of craniofacial growth pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The Zebrabow clonal analysis method integrates into early discovery workflows by providing direct readouts of chondrocyte intercalation and elongation, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of chondrocyte-driven tissue extension mechanisms in craniofacial development.
- Screening: Delivers quantitative, multispectral clonal outputs enabling reproducible assessment of chondrocyte organization.
- Analytics: Provides clonal lineage tracing and morphological metrics that allow comparison of cellular behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects clonal chondrocyte dynamics to mandibular morphogenesis, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clonal imaging platform applicable to multiple organogenesis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of chondrocyte intercalation.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via inherited fluorescent clonal labeling.
- Strategic Value: Reduced biological risk in craniofacial therapeutic development via mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets affecting mandibular growth and patterning.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic zebrafish handling and clonal lineage tracing.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure for multispectral imaging.
- Necessitates standardized tamoxifen induction protocols for consistent recombination.
- Involves adaptation considerations for applying clonal analysis to other skeletal or tissue systems.
- Limited by the need for precise embryonic staging and fluorescent selection for clonal induction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:21
Embryo Collection, Tamoxifen Treatment, and Embryo Selection
2:46
Mounting Embryos in Methylcellulose and Fluorescence Microscopy
4:33
Results: Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation in ubi:Zebrabow-M;sox10:ERT2-Cre Transgenic Zebrafish
6:15
Conclusion
