Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

O objetivo geral do experimento a seguir é visualizar o intercolamento e extensão de condrócitos por meio da análise de células clonais de arco de zebra. Isso é conseguido gerando uma linha SOX 10 ERT de dois arcos de zebra Cree M para obter recombinação específica do tecido na cartilagem facial craniana e embriões para análise clonal. Em seguida, os embriões são pulsados com tamoxifeno no estágio 10, então ácaro por três horas para induzir o processo de recombinação.

Em seguida, os embriões são selecionados para a expressão da atividade CRE e forte expressão fluorescente vermelha ou RFP, e os embriões são montados para imagens da cartilagem craniofacial C. Os resultados mostram análise celular multiespectral dos condrócitos craniofaciais com base em imagens confocais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como S na coloração azul ou linhas transgênicas, como so e GFP ou SOX e kde, é que o arco zebra nos permite observar e seguir especificamente as populações de células clonais envolvidas na formação de um órgão.

Para se preparar para a coleta de embriões no primeiro dia, configure vários pares masculinos e femininos de sox, 10 ERT dois Cree zebra bow M peixe-zebra transgênico em tanques de acasalamento divididos entre cinco e 6:00 do dia seguinte, após verificar em um microscópio óptico que os embriões atingiram o estágio 10 de celulite sob um microscópio fluorescente com um filtro RFP. Isole os embriões vermelhos brilhantes e transfira-os para uma nova placa de Petri com meio E três fresco para induzir a recombinação Cree. Adicione 10 soluções micromolares de hidroxi tamoxifeno à placa de Petri e incube os embriões a 28,5 graus Celsius por três horas.

Em seguida, transvase a solução de tamoxifeno em um recipiente de lixo biológico e use E três para lavar os embriões várias vezes após incubar os embriões durante a noite para o 28 a 29, então estágio de ácaro, transfira os embriões para a solução E três PTU e devolva-os à incubadora. Para visualizar as estruturas craniofaciais C totalmente desenvolvidas, selecione embriões em quatro DPF com um sinal vermelho intenso e expressão de Cree amarelo na retina. Depois de anestesiar um embrião em Trica, de acordo com o protocolo de texto, transfira-o para uma placa de Petri contendo uma gota de metilcelulose em uma lâmina confocal limpa.

Coloque uma gota de metilcelulose fresca e use uma ponta de micro carregador para montar o embrião posicionado dorsalmente, tomando cuidado para não tocá-lo diretamente com uma lamínula de 25 por 25. Cubra o embrião e use a lamínula para manipular o embrião, se necessário. Para obter imagens do embrião, use uma objetiva de lente seca de 20 x.

Para focar o assunto, pressione o botão L 100 no microscópio e selecione o botão de configuração confocal. Clique em auto e selecione o CFP para o canal um, GFP para o canal dois e RFP ou M cherry para o canal três. Em seguida, feche a janela.

Ligue os canais dois e três antes de clicar no botão remover intertravamento. Em seguida, clique em reproduzir para iniciar a digitalização. Após ajustar as configurações, capture as imagens desejadas e salve no formato de software confocal, bem como no formato TIF para processamento de imagem por canal.

Para realizar imagens CFP, desligue os canais dois e três e ligue o canal um sem alterar a área de foco. Reajuste as configurações de digitalização antes de capturar imagens, salve as imagens conforme descrito e execute o processamento da imagem conforme descrito por pan e colegas, conforme mostrado aqui. A visualização tradicional da cartilagem por toda a coloração azul do Monte Sian tem sido inestimável na observação da cartilagem mekel em desenvolvimento e comumente usada para visualizar a organização celular final para analisar melhor os condrócitos em desenvolvimento ao longo do tempo traçando a linhagem.

O uso de linhas transgênicas SOX de 10 kda tem sido usado para estudar a migração celular e a convergência e extensão em embriões vivos usando imagens ao vivo da linha transgênica zebra bow m. Para estudar mais a fundo a organização dos condrócitos na estrutura esquelética craniofacial C, revela-se o processo de intercolação e alongamento dos condrócitos que medeia a extensão e o crescimento da cartilagem de meckel. Esta figura mostra a mandíbula inferior do arco zebra UI M Sox 10 ERT dois embriões transgênicos Cree entre 3D PF e cinco dias após a fertilização.

A mandíbula inferior é melhor retratada ventralmente para permitir uma visão clara da organização celular na cartilagem meles, como mostrado aqui. As cores mantidas de forma estável e herdadas permitem fácil rastreamento de linhagem e mapeamento do destino da célula da crista neural craniana. A única célula azul parece migrar e interpolar com suas células vizinhas, depois se alonga ao longo do eixo anterior posterior para formar um local de condra, mantendo assim a forma global da cartilagem meles à medida que se estende anteriormente.

Esta técnica abre caminho para pesquisadores no campo do desenvolvimento de gatos examinarem o condro na formação do esqueleto do peixe-zebra.