Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais
November 8th, 2021
Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.
Nosso protocolo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para casar vários microparâmetros em nível de célula única do IPS humano e seus derivados neuro e claros. Esses protocolos permitem a fusão de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo. Esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo as de outras doenças neurodegenerativas.
Assim, pode ajudar a fornecer informações sobre os mecanismos por trás desses tipos de doenças e também potencialmente ajudar na triagem terapêutica. Para começar, semeie as células separadamente em quatro poços em uma placa de seis poços e incube as células até que 50 a 60% de confluência seja alcançada. No final do período de cultura, preparar cinco soluções de coloração individuais contendo diferentes combinações de meio de cultura, FCCP, TMRE, MTG e mito sock spread.
Adicione-os aos respectivos poços e incube as células conforme descrito no manuscrito. Em seguida, aspirar o meio de todos os poços e lavar com PBS. Para o descolamento celular, incubar as células com um mililitro de reagente de dissociação celular a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Neutralizar o reagente de dissociação celular com um mililitro de DMEM, suplementado com 10% FBS. Em seguida, colete o conteúdo do poço em um tubo de crônica de 15 mililitros. Pellet para baixo as células por centrificação e lavar o pellet celular com PBS uma ou duas vezes.
Aspirar todo o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 microlitros no tubo. Ressuspeite os pellets de células em 300 microlitros de PBS. Depois de transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantenha o tubo no escuro à temperatura ambiente.
Analise as células usando o citômetro de fluxo com as configurações de filtro passa-banda descritas no manuscrito do texto. Desprenda aproximadamente 1 milhão de células usando o reagente de dissociação celular e elimine as células, como demonstrado anteriormente. Neutralize a suspensão celular com DMEM mais 10% FBS e recolha a suspensão num tubo de 15 mililitros.
Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a 1,6% à temperatura ambiente durante 10 minutos. Permeabolir as células com um mililitro de metanol gelado a 90% de metanol a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, bloqueie as amostras em um mililitro de tampão de bloqueio e lave as células por centrifugação com PBS, conforme demonstrado.
Para detectar diferentes complexos e subunidades mitocondriais, incubar as células por 30 minutos com os respectivos anticorpos primários descritos no manuscrito do texto. Depois de lavar as células uma vez com PBS, incube as células com anticorpos secundários por 30 minutos. No final da incubação, lave e ressuscite as células e o PBS, conforme demonstrado.
Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantido no escuro no gelo. Em seguida, analise as células no citômetro de fluxo e detecte sinais e filtre um usando um filtro de passagem de banda 5 30/30. Para cada subpopulação celular, selecione um gráfico de histograma e analise a intensidade de fluorescência mediana ou MFI dos diferentes canais filtrantes.
Calcular os níveis de TMRE, valores específicos para a subunidade complexa MMP ROS e TFAM, conforme descrito no manuscrito do texto. A citometria de fluxo e células vivas foi utilizada para investigar o volume mitocondrial de MMP e os níveis de EROs. Nos neurônios POLG DA, observou-se menor MMP específica e ROS específicas mais altas, enquanto não houve alterações no volume mitocondrial, MMP total e ROS.
Os astrócitos POLG apresentaram diminuição da MMP, mas nenhuma alteração no volume mitocondrial e nas EROs. A citometria de fluxo e as células fixas foram utilizadas para investigar o nível de subunidade complexa MRC e TFAM. Os neurônios DA mostraram aumento do complexo um e TFAM versus controle, mas nenhuma alteração no nível do complexo dois.
Os astrócitos POLG mostraram uma redução do complexo um quatro e TFAM específico. Como a densidade celular também pode influenciar a MMP e a relação entre a fluorescência MTG e MMP, isso é específico da célula. Adaptar este protocolo a outros tipos de células provavelmente exigirá otimização Após este procedimento, a asis baseada em microscopia, por exemplo, microcópia confocal pode ser realizada, fornecendo detalhes adicionais das estruturas mitocondriais.
Assim, enquanto esta estratégia detecta disfunção mitocondrial em neurônios DA e astrócitos de uma doença mitocondrial conhecida, essas técnicas também podem ser aplicadas para explorar a função mitocondrial em qualquer tipo de célula e doença.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo método baseado em citometria de fluxo para avaliar parâmetros funcionais mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPS) e seus derivados neuronais. Permite a detecção de alterações no potencial de membrana mitocondrial, níveis de espécies reativas de oxigênio e composição da cadeia respiratória mitocondrial, contribuindo para a compreensão da disfunção mitocondrial em doenças neurodegenerativas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Função Mitocondrial
Contexto
- A disfunção mitocondrial está ligada a doenças neurodegenerativas.
- Este estudo investiga parâmetros mitocondriais a nível de célula única.
- A metodologia visa fornecer insights sobre os mecanismos da doença.
- A avaliação da saúde mitocondrial pode auxiliar na triagem terapêutica.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para medir parâmetros mitocondriais em células únicas.
- Compreender os papéis mitocondriais na neurodegeneração e possíveis terapias.
- Melhorar a detecção da disfunção mitocondrial em diversos tipos celulares.
Métodos Utilizados
- A plataforma utilizada é a citometria de fluxo.
- Foram analisadas células iPS humanas e seus derivados neuronais.
- Os principais procedimentos envolveram cultura celular, dupla coloração com repórteres fluorescentes específicos e marcação de anticorpos para análise mitocondrial.
- Os tratamentos celulares incluíram dissociação, fixação e permeabilização, seguidos de medição de fluorescência.
- Foram mencionadas adaptações do protocolo específicas para o tipo de célula.
Principais Resultados
- Foram observadas diferenças significativas no potencial de membrana mitocondrial (PMM) e nos níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) em neurônios POLG e astrócitos.
- Foram notados níveis aumentados de complexo mitocondrial e TFAM em neurônios DA, destacando adaptações mitocondriais únicas.
- Os resultados indicam que características celulares específicas influenciam as medições da função mitocondrial.
- Potencial para aplicações mais amplas em vários tipos celulares na exploração de funções mitocondriais e doenças relacionadas.
Conclusões
- Este estudo demonstra uma abordagem robusta para avaliar a função mitocondrial em modelos de doenças neurodegenerativas.
- Os resultados permitem uma exploração adicional dos papéis mitocondriais na saúde e doença celular.
- Esta metodologia pode levar a uma melhor compreensão e estratégias terapêuticas para patologias relacionadas à disfunção mitocondrial.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This flow cytometry method enables multiparametric mitochondrial profiling in human iPSC-derived neural and glial cells, supporting target validation in neurodegenerative disease models. By quantifying mitochondrial volume, membrane potential, ROS, and respiratory chain components at single-cell resolution, it provides mechanistic de-risking for therapeutic screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking mitochondrial phenotypes to disease-relevant cellular states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring mitochondrial dysfunction in iPSC-derived neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables functional target validation through multiparametric readouts of mitochondrial health.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that normalize mitochondrial parameters in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated iPSC-derived neural and glial systems for compound screening with mitochondrial endpoints.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs for mitochondrial volume, MMP, and ROS.
- Scalability: Supports high-content flow cytometry screening across multiple cell lines and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial defects in POLG-associated neurons and astrocytes.
- Operational Value: Enables translational biomarker assessment via TFAM/TOMM20 ratios reflecting mtDNA copy number per mitochondrial volume.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by detecting mitochondrial complex subunit alterations linked to pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neurodegenerative indications involving mitochondrial dysfunction.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking mitochondrial volume, MMP, and ROS to specific cellular phenotypes in iPSC derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized staining protocols and flow cytometric readouts of mitochondrial function.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mitochondrial respiratory chain subunits and TFAM for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via disease-relevant iPSC models and mitochondrial biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable multiparametric mitochondrial profiling platform applicable across neurodegenerative disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in mitochondrial contributions to neurodegeneration.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined staining panels and flow cytometric gating strategies.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of mitochondrial liabilities in compound libraries.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that rescue mitochondrial complex deficits or ROS elevation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, mitochondrial biology, and iPSC differentiation protocols.
- Dependent on access to flow cytometers with appropriate fluorescence detection channels and compensation controls.
- Necessitates standardization of staining concentrations, incubation times, and gating strategies across laboratories.
- Requires optimization when adapting to non-neural cell types or different mitochondrial disease models.
- Limited by the need for live-cell handling for MMP/ROS measurements and fixed-cell protocols for protein detection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Flow Cytometry Measurement of Mitochondrial Volume, MMP, and Mitochondrial ROS in Live Cells
2:26
Flow Cytometry Measurement of MRC Complex Subunits and TFAM in Fixed Cells
3:49
Flow Cytometry Analysis
4:14
Results: Flow Cytometry Investigation of iPSC-Derived Neural Cells
5:07
Conclusion
