Name: Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprenda a analisar parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas humanas e derivados neurais usando citometria de fluxo. Este método permite avaliar função mitocondrial em doenças neurodegenerativas.

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Agradecemos ao Centro de Imagem Molecular e ao Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Bergen, na Noruega. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Conselho Norueguês de Pesquisa (número de subvenção: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat e do Conselho de Bolsas de Estudo da China (número do projeto: 201906220275).

<ol><li>Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+the+potential+countermeasure%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).</li>
<li>Chen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+riboside+and+metformin+ameliorate+mitophagy+defect+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+phenotypes+in+iPSC-derived+neural+stem+cells+with+POLG+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).</li>
<li>Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics--fusion%2C+fission%2C+movement%2C+and+mitophagy--in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases.</a> Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+A+key+modulator+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases.</a> Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).</li>
<li>Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interplay+between+cristae+biogenesis%2C+mitochondrial+dynamics+and+mitochondrial+DNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).</li>
<li>Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+human+disease+using+stem+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Investigating human disease using stem cell models.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).</li>
<li>Patani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+models+of+disease+and+the+prognosis+of+academic+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine.</a> Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. , 337(2021).</li>
<li>Kikuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+dopaminergic+neurons+function+in+a+primate+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model.</a> Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).</li>
<li>Juopperi, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+generated+from+patient+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+features+of+Huntington%27s+disease+patient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells.</a> Molecular Brain. 5, 17(2012).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+derived+astrocytes+with+POLG+mutations+and+mitochondrial+dysfunction+including+abnormal+NAD%2B+metabolism+is+toxic+for+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+ESCs+and+induced+pluripotent+stem+cells%3A+induction%2C+maintenance%2C+and+differentiation+into+functional+schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).</li>
<li>Hong, Y. J., Do, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+lineage+differentiation+from+pluripotent+stem+cells+to+mimic+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).</li>
<li>Lundin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS-derived+astroglia+from+a+stable+neural+precursor+state+show+improved+functionality+compared+with+conventional+astrocytic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).</li>
<li>Liang, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine+amide+ameliorates+mitochondrial+dysfunction+and+reduces+oxidative+stress+in+hiPSC-derived+dopaminergic+neurons+with+POLG+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation.</a> Experimental Neurology. 337, 113536(2021).</li>
<li>Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+MitoTracker+Green%E2%84%A2+and+CMXrosamine+to+measure+changes+in+mitochondrial+membrane+potentials+in+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues.</a> Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).</li>
<li>Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+mitochondrial+membranes+with+10-nonyl+acridine+orange%2C+MitoFluor+Green%2C+and+MitoTracker+Green+is+affected+by+mitochondrial+membrane+potential+altering+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs.</a> Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).</li>
<li>Buckman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoTracker+labeling+in+primary+neuronal+and+astrocytic+cultures%3A+influence+of+mitochondrial+membrane+potential+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).</li>
<li>Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-density-dependent+changes+in+mitochondrial+membrane+potential+and+reactive+oxygen+species+production+in+human+skin+cells+post+sunlight+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Aqui estão os protocolos para gerar neurônios e astrócitos derivados de iPSC e avaliar múltiplos aspectos da função mitocondrial usando citometria de fluxo. Esses protocolos permitem a conversão eficiente de iPSCs humanas em neurônios e astrócitos gliais e a caracterização detalhada da função mitocondrial, principalmente em células vivas. Os protocolos também fornecem uma estratégia baseada em citometria de fluxo de cocoloração para adquirir e analisar múltiplas funções mitocondriais, incluindo volume, MMP e níveis de RO...

As mitocôndrias são organelas essenciais presentes em quase todas as células eucarióticas. As mitocôndrias são responsáveis pelo fornecimento de energia, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa e atuam como intermediários metabólicos para a biossíntese e o metabolismo. As mitocôndrias estão profundamente envolvidas em muitos outros processos celulares importantes, como a geração de EROs, a morte celular e a regulação intracelular do Ca2+. A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Alzheimer (DA), a doença de Huntington (DH), a ataxia de Friedreich (FRDA) e a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1. Acredita-se que o aumento da disfunção mitocondrial e a anormalidade do mtDNA também contribuam para o envelhecimento humano 2,3.
Vários tipos de disfunção mitocondrial ocorrem em doenças neurodegenerativas, e alterações no volume mitocondrial, despolarização da MMP, produção de ERO e alterações no número de cópias do mtDNA são comuns 4,5,6,7. Portanto, a capacidade de medir essas e outras funções mitocondriais é de grande importância ao estudar os mecanismos da doença e testar potenciais agentes terapêuticos. Além disso, diante da falta de modelos animais que repliquem fielmente as doenças neurodegenerativas humanas, o estabelecimento de sistemas de modelos in vitro adequados que recapitulem a doença humana nas células cerebrais é um passo importante para uma maior compreensão dessas doenças e o desenvolvimento de novas terapias 2,3,8,9.
As iPSCs humanas podem ser usadas para gerar várias células cerebrais, incluindo células neuronais e não neuronais (ou seja, células gliais), e danos mitocondriais associados à doença neurodegenerativa foram encontrados em ambos os tipos celulares 3,10,11,12,13. Métodos apropriados para diferenciação de iPSC em linhagens neurais e gliais estão disponíveis14,15,16. Essas células fornecem uma plataforma única para humanos / pacientes para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos. Além disso, como estes são derivados de pacientes, os neurônios derivados de iPSC e as células gliais fornecem modelos de doença que refletem o que está acontecendo em humanos com mais precisão.
Até o momento, poucos métodos convenientes e confiáveis para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais em iPSCs, particularmente neurônios vivos e células gliais, estão disponíveis. O uso da citometria de fluxo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para medir parâmetros biológicos, incluindo a função mitocondrial, em células individuais. Este protocolo fornece detalhes para a geração de diferentes tipos de células cerebrais, incluindo células-tronco neurais (NSCs), neurônios e astrócitos gliais de iPSCs, bem como novas abordagens baseadas em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo iPSCs e células neurais e gliais derivadas de iPSC. O protocolo também fornece uma estratégia de co-coloração para o uso de citometria de fluxo para medir o volume mitocondrial, MMP, nível de ROS mitocondrial, complexos MRC e TFAM. Ao incorporar medidas de volume ou massa mitocondrial, esses protocolos também permitem a medição do nível total e do nível específico por unidade mitocondrial.

<table><tbody><tr><td>anti-Oct4</td><td>Abcam</td><td>ab19857, RRID:AB_445175</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287, RRID:AB_778073</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-Sox2</td><td>Abcam</td><td>ab97959, RRID:AB_2341193</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-Pax6</td><td>Abcam</td><td>ab5790, RRID:AB_305110</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927, RRID:AB_627994</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:50, 20 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab4674, RRID:AB_304558</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; &nbsp; use Alexa Fluor &reg; 594 IgG anti-frango caprino (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-S100&beta; &nbsp; conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab196442, RRID:AB_2722596</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:400, 2,5 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L;</td></tr><tr><td>anti-TH</td><td>Abcam</td><td>ab75875, RRID:AB_1310786</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-Tuj 1</td><td>Abcam</td><td>ab78078, RRID:AB_2256751</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 594 IgG anti-camundongo de cabra (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11005) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-Sinaptofisina</td><td>Abcam</td><td>ab32127, RRID:AB_2286949</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-PSD-95</td><td>Abcam</td><td>ab2723, RRID:AB_303248</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:100, 10 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; &nbsp; use Alexa Fluor &reg; 594 IgG anti-frango caprino (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11042) como anticorpo secundário.</td></tr><tr><td>anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab198308</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:400, 2.5 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; usar IgG2b monoclonal de camundongo; Alexa Fluor&reg; 488 como um controle de isotipo.</td></tr><tr><td>anti-TOMM20 conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-17764 RRID:AB_628381</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:400, 2.5 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; usar IgG2a monoclonal de camundongo; Alexa Fluor&reg; 488 como um controle de isotipo.</td></tr><tr><td>anti-NDUFB10</td><td>Abcam</td><td>ab196019</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.</td></tr><tr><td>anti-SDHA</td><td>Abcam</td><td>ab137040</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; &nbsp; use Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-coelho de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11008) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de coelho como controle de isotipo.</td></tr><tr><td>anti-COX IV</td><td>Abcam</td><td>ab14744, RRID:AB_301443</td><td>Anticorpo Primário; use como 1:1000, 1 &mu; L em 1000 &mu; Solução de coloração L; uso&nbsp; Alexa Fluor &reg; 488 IgG anti-rato de cabra (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catálogo # A-11001) como anticorpo secundário; usar IgG monoclonal de camundongo como controle de isotipo.</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>ABM Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Meio basal para cultura de astrócitos</td></tr><tr><td>AGM SingleQuots Supplement Pack</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td>Suplemento para cultura de astrócitos</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Ingrediente CDM</td></tr><tr><td>Avançado DMEM / F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>Meio basal para diluir</td></tr><tr><td>a albumina de soro bovino</td><td>Geltrex Europa Bioproducts</td><td>EQBAH62-1000</td><td>Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunocoloração e ingrediente CDM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td>neurônios DA ingrediente médio</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Ingrediente do meio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus Citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Concentrado lipídico quimicamente definido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905031</td><td>Ingrediente CDM</td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104019</td><td>Reagente para dissociação suave de iPSCs humanos</td></tr><tr><td>CCD Microscópio Câmera Leica DFC3000 G</td><td>Leica Microsystems, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning placas de cultura não tratadas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430589</td><td>Cultura em suspensão</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td>Usado para uma variedade de lavagem de cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565018</td><td>Diferenciação de astrócitos basal Médio</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Reagente</td><td>de 15575020</td> Científico <td>para dissociação suave de iPSCs humanas</td></tr><tr><td>Essential 8 Basal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516901</td><td>Meio basal para cultura de iPSC</td></tr><tr><td>Suplemento Essential 8 (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517101</td><td>Suplemento para cultura de iPSC</td></tr><tr><td>Proteína humana recombinante EGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0314</td><td>Suplemento para cultura NSC</td></tr><tr><td>FGF-básico (AA 10&ndash; 155) Proteína Humana Recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>Suplemento para cultura NSC</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12103C</td><td>Ingrediente médio</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td>Elimina o potencial de membrana mitocondrial e a coloração TMRE</td></tr><tr><td>Sistema de aspiração de fluidos Controle BVC</td><td>Vacuubrand, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído (PFA) 16%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Fixação celular</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Usado para fixação e manutenção de iPSCs humanas</td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Suplemento para cultura NSC</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>DA neurônios meio ingrediente</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>Usado para bloquear o tampão</td></tr><tr><td>Mistura de Nutrientes F-12 do Presunto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31765027</td><td>Meio basal para CDM</td></tr><tr><td>Heregulin beta-1 humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3055</td><td>Meio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>ingrediente Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Corar os núcleos para imagem confocal</td></tr><tr><td>Heracell 150i Incubadoras de CO2</td><td>Fisher Scientific, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21980032</td><td>Meio basal para CDM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Roche</td><td>1376497</td><td>Ingrediente CDM</td></tr><tr><td>InSolution Inibidor de AMPK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>171261</td><td>Ingrediente do meio de indução neural</td></tr><tr><td>Fator de crescimento semelhante à insulina-I humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3769</td><td>Ingrediente do meio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12 meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>Meio basal para cultura NSC</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro</td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica TCS SP8 STED</td><td>Leica Microsystems, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>CDM ingrediente</td></tr><tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Usado para indicador de volume mitocondrial</td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M36008</td><td>Usado para indicador de ROS mitocondrial</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td>Neural ingrediente médio de indução</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td>Ingrediente médio de diferenciação de astrócitos</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td>Usado para bloquear o tampão</td></tr><tr><td>Agitadores orbitais - SSM1</td><td>Stuart Equipment, solução de</td> poli-L-ornitina do Reino Unido <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro</td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7405</td><td>Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro</td></tr><tr>Tecnologias <td>STEMCELL</td> de<td>Purmorlamina</td><td>72204</td><td>Promove a diferenciação de neurônios DA</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Montagem da lamínula para imagem</td></tr> <tr><td>confocalPBS 1x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td>Usado para uma variedade de lavagem</td></tr><tr><td>Recombinante Humano / Rato FGF-8b Proteína R</td><td>& D Systems</td><td>423-F8-025/CF</td><td>Promove a diferenciação de neurônios DA</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>TB1614-GMP</td><td>Indução Neural Ingrediente</td></tr><tr><td>médio StemPro Suplemento Neural Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10508-01</td><td>Suplemento para cultura NSCs</td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td>Reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Roche</td><td>652202</td><td>ingrediente CDM</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>VWR International</td><td>9002-93-1</td><td>Usado para permeabilização de células em ensaios de imunocoloração</td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Abcam</td><td>ab113852</td><td>Usado para coloração de potencial de membrana mitocondrial Banho-maria</td></tr><tr><td>Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments</td><td>Grant Instruments, EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives

As mitocôndrias são importantes na fisiopatologia de muitas doenças neurodegenerativas. Alterações no volume mitocondrial, no potencial de membrana mitocondrial (MMP), na produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) e no número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) são frequentemente características desses processos. Este relatório detalha uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e células neurais e gliais derivadas de iPSC. Essa estratégia baseada em fluxo usa células vivas para medir o volume mitocondrial, os níveis de MMP e ROS, bem como células fixas para estimar componentes da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e proteínas associadas ao mtDNA, como o fator de transcrição mitocondrial A (TFAM). 
Ao co-coloração com repórteres fluorescentes, incluindo MitoTracker Green (MTG), éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e MitoSox Red, mudanças no volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial podem ser quantificadas e relacionadas ao conteúdo mitocondrial. A dupla coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC e translocase da membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite a avaliação da expressão da subunidade MRC. Como a quantidade de TFAM é proporcional ao número de cópias de mtDNA, a medição de TFAM por TOMM20 fornece uma medição indireta de mtDNA por volume mitocondrial. Todo o protocolo pode ser realizado dentro de 2-3 h. É importante ressaltar que esses protocolos permitem a mensuração de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo.

Uma descrição esquemática do método de diferenciação e das estratégias de citometria de fluxo é mostrada na Figura 3. As iPSCs humanas são diferenciadas em rosetas neurais e, em seguida, levantadas em cultura de suspensão para diferenciação em esferas neurais. As esferas neurais são ainda mais diferenciadas e amadurecidas em neurônios DA. As esferas neurais são dissociadas em células únicas para gerar astrócitos gliais, revestidas em monocamadas como NSCs e, em seguida, diferenciadas em astr...

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Mitochondria are important in the pathophysiology of many neurodegenerative diseases. Changes in mitochondrial volume, mitochondrial membrane potential ...

Nosso protocolo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para casar vários microparâmetros em nível de célula única do IPS humano e seus derivados neuro e claros. Esses protocolos permitem a fusão de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo. Esta técnica pode ser aplicada a vários tipos de células, incluindo as de outras doenças neurodegenerativas.Assim, pode ajudar a fornecer informações sobre os mecanismos por trás desses tipos de doenças e também potencialmente ajudar na triagem terapêutica. Para começar, semeie as células separadamente em quatro poços em uma placa de seis poços e incube as células até que 50 a 60% de confluência seja alcançada. No final do período de cultura, preparar cinco soluções de coloração individuais contendo diferentes combinações de meio de cultura, FCCP, TMRE, MTG e mito sock spread.Adicione-os aos respectivos poços e incube as células conforme descrito no manuscrito. Em seguida, aspirar o meio de todos os poços e lavar com PBS. Para o descolamento celular, incubar as células com um mililitro de reagente de dissociação celular a 37 graus Celsius por cinco minutos.Neutralizar o reagente de dissociação celular com um mililitro de DMEM, suplementado com 10% FBS. Em seguida, colete o conteúdo do poço em um tubo de crônica de 15 mililitros. Pellet para baixo as células por centrificação e lavar o pellet celular com PBS uma ou duas vezes.Aspirar todo o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 microlitros no tubo. Ressuspeite os pellets de células em 300 microlitros de PBS. Depois de transferir a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantenha o tubo no escuro à temperatura ambiente.Analise as células usando o citômetro de fluxo com as configurações de filtro passa-banda descritas no manuscrito do texto. Desprenda aproximadamente 1 milhão de células usando o reagente de dissociação celular e elimine as células, como demonstrado anteriormente. Neutralize a suspensão celular com DMEM mais 10% FBS e recolha a suspensão num tubo de 15 mililitros.Fixe as células com um mililitro de paraformaldeído a 1,6% à temperatura ambiente durante 10 minutos. Permeabolir as células com um mililitro de metanol gelado a 90% de metanol a menos 20 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, bloqueie as amostras em um mililitro de tampão de bloqueio e lave as células por centrifugação com PBS, conforme demonstrado.Para detectar diferentes complexos e subunidades mitocondriais, incubar as células por 30 minutos com os respectivos anticorpos primários descritos no manuscrito do texto. Depois de lavar as células uma vez com PBS, incube as células com anticorpos secundários por 30 minutos. No final da incubação, lave e ressuscite as células e o PBS, conforme demonstrado.Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, mantido no escuro no gelo. Em seguida, analise as células no citômetro de fluxo e detecte sinais e filtre um usando um filtro de passagem de banda 5 30/30. Para cada subpopulação celular, selecione um gráfico de histograma e analise a intensidade de fluorescência mediana ou MFI dos diferentes canais filtrantes.Calcular os níveis de TMRE, valores específicos para a subunidade complexa MMP ROS e TFAM, conforme descrito no manuscrito do texto. A citometria de fluxo e células vivas foi utilizada para investigar o volume mitocondrial de MMP e os níveis de EROs. Nos neurônios POLG DA, observou-se menor MMP específica e ROS específicas mais altas, enquanto não houve alterações no volume mitocondrial, MMP total e ROS.Os astrócitos POLG apresentaram diminuição da MMP, mas nenhuma alteração no volume mitocondrial e nas EROs. A citometria de fluxo e as células fixas foram utilizadas para investigar o nível de subunidade complexa MRC e TFAM. Os neurônios DA mostraram aumento do complexo um e TFAM versus controle, mas nenhuma alteração no nível do complexo dois.Os astrócitos POLG mostraram uma redução do complexo um quatro e TFAM específico. Como a densidade celular também pode influenciar a MMP e a relação entre a fluorescência MTG e MMP, isso é específico da célula. Adaptar este protocolo a outros tipos de células provavelmente exigirá otimização Após este procedimento, a asis baseada em microscopia, por exemplo, microcópia confocal pode ser realizada, fornecendo detalhes adicionais das estruturas mitocondriais.Assim, enquanto esta estratégia detecta disfunção mitocondrial em neurônios DA e astrócitos de uma doença mitocondrial conhecida, essas técnicas também podem ser aplicadas para explorar a função mitocondrial em qualquer tipo de célula e doença.

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Este vídeo demonstra a marcação de células neuronais com anticorpos para complexos da cadeia respiratória mitocondrial, proteína associada ao DNA mitocondrial e proteína da membrana externa mitocondrial, seguida de citometria de fluxo para quantificar seus níveis.

Medição de Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Neurônios usando Citometria de Fluxo

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) são consideradas uma ferramenta poderosa para a triagem de drogas e substâncias químicas e para o desenvolvimento de novos modelos in vitro para testes de toxicidade, incluindo neurotoxicidade. Aqui, um protocolo detalhado para a diferenciação de hiPSCs em neurônios e glia é descrito.

Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.

Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Aqui descrevemos um método confiável para medir a massa mitocondrial e o potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas cultivadas ex vivo e células T.

Medição da massa mitocondrial e potencial de membrana em células-tronco hematopoiéticas e células T por citometria flow

Transporte mitocondrial prejudicado e morfologia estão envolvidos em várias doenças neurodegenerativas. O protocolo apresentado usa neurônios cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas para avaliar o transporte mitocondrial e a morfologia em paraplegia espástica hereditária. Este protocolo permite a caracterização do tráfico mitocondrial ao longo de axônios e análise de sua morfologia, o que facilitará o estudo de doenças neurodegenerativas.

Analisando o Transporte Mitocondrial e a Morfologia em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos em Paraplegia Espástica Hereditária

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Descrevemos um protocolo detalhado para a geração de organoides cerebrais pluripotentes induzidos por células-tronco induzidos pelo homem e seu uso na modelagem de doenças mitocondriais.

Geração de Organoides cerebrais humanos para modelagem de doenças mitocondriais

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Aprenda a analisar parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas humanas e derivados neurais usando citometria de fluxo. Este método permite avaliar função mitocondrial em doenças neurodegenerativas.

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais (Vídeo) | JoVE Journal

Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

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