Name: Simultânea de dois fótons In Vivo Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: Aprenda a realizar craniotomia para imagem crônica de neurônios no córtex retrosplenial de camundongos usando microscopia de dois fótons in vivo. Este método permite monitorar a plasticidade estrutural dependente de experiência por longos períodos.

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Os autores gostariam de agradecer a M. Steczkowski para gravações de voz, M. Borczyk para desenhos, A. Trąbczyńska para a produção de vírus, M. Ziókowska para genotipagem e A. Mirgos de assistência com as filmagens. KR reconhece o presente tipo do vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressam a proteína fluorescente mCherry sob o controlo do promotor de CaMK K. Deisseroth. Este projeto foi realizado nas instalações centrais do Laboratório de modelos animais e Laboratório de Estrutura do tecido e função, Centro de Neurobiologia, Nencki Instituto de Biologia Experimental, com a utilização da infra-estrutura da CEPT, financiado pela União Europeia - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional no âmbito do Programa Operacional &quot;Economia inovadora&quot; para o período 2007-2013. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 para KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 a RC

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética local no Instituto Nencki of Experimental Biology, da Academia Polonesa de Ciências. Nota: Algumas das cenas do vídeo associado são acelerados. fator de velocidade é indicado nestas cenas. 1. Cirurgia Preparação <ol><li> Esterilizar todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas dispensáveis. Limpar a mesa cirúrgica, o quadro estereotáxico e toda a área circundante com 70% de etanol. Usar uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento esterilizado. Corte gelfoam em pedaços pequenos e mergulhe-os em solução salina estéril. Nota: De acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, o etanol não é nem um esterilizante nem um desinfectante de alto nível. Ele só deve ser usado como um agente de limpeza / desengorduramento em superfícies previamente esterilizados. </li><li> Coloque o animal em thcâmara de indução e e definir o nível de isoflurano a 5% e fluxo de oxigênio a 2 L / min. Este procedimento deve demorar cerca de 3 min. </li><li> Levar o animal para fora da câmara de indução. Use cauda ou dedo do pé pitadas, a fim de assegurar que o animal é completamente sedado. </li><li> Usando um aparador preciso raspar o cabelo a partir da parte de trás da cabeça (entre as orelhas) até os olhos. </li><li> Colocar o animal na moldura estereotáxica e estabilizar a cabeça com barras de ouvido. </li><li> Definir níveis de anestesia para 1,5-2% isoflurano e 0,3 L / min de oxigênio. </li><li> Aplicar a pomada. </li><li> Injectar o animal com Tolfedine subcutaneamente (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) para prevenir a inflamação, dor e infecção, respectivamente. </li><li> Injectar a intramuscularmente animal com Dexametasona (0,2 mg / kg) para evitar inchaço cérebro. Nota: É possível injectar dexametasona por via subcutânea ou por via intraperitoneal, para evitar danos do músculo. </li><li> Limpe a pele com scotonetes terile com Betadine seguido por 70% de etanol. </li><li> Alterar as luvas e pulverizá-los com 70% de etanol. Nota: Enquanto estiver usando luvas descartáveis ​​não toque no campo estéril. Toque o animal apenas com as pontas dos instrumentos cirúrgicos estéreis e compressas estéreis. </li></ol> Cirurgia 2. Cranial Janela <ol><li> Levantar a pele com fórceps e tesouras utilizando micro incisar a pele horizontalmente ao longo da base da cabeça e, em seguida, obliquamente para a frente ponto entre os olhos. Remova o retalho de pele. </li><li> Aplicar lidocaína pomada com uma zaragatoa estéril no periósteo para evitar sangramento excessivo e dor. </li><li> Use cotonetes estéreis ou um bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com compressas estéreis. </li><li> Usando uma agulha estéril aplicar cola de cianoacrilato densa sobre as bordas da pele para os imobilizar e para evitar o contacto com cimento dental. Aguarde até que a cola secar. </li><li> Coloque uma lamela 3 milímetros estéril sobre tele crânio anteriormente à sutura lambdoid. Centralizar a lamela na RSC coordenadas: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark as bordas lamela arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque a lamela de volta para o recipiente esterilizado com 70% de etanol. </li><li> Use uma broca dental de alta velocidade com pequenas rebarbas diâmetro para delinear um círculo 3 mm de diâmetro. Limpe o local de perfuração a partir do pó de osso com solução salina estéril cotonetes mergulhados. Use o gelfoam e cotonetes para parar o sangramento ocasional e limpar o osso. </li><li> No meio de perfuração verificar a espessura do osso com uma pinça fina, tocando suavemente o círculo óssea e verificar sua mobilidade. Tenha em atenção que o osso é mais espesso na área da sutura. Pare a perfuração quando o círculo osso é móvel e só um mesmo, fina camada de osso é deixado sobre a circunferência. Limpar o campo operacional de todos os pó de osso restante com compressas de soro fisiológico mergulhado. </li><li> Largue a solução salina estéril na área de perfuração, cobrindo o cir perfuradocle. Cuidadosamente retire o círculo osso com uma pinça fina e, em seguida, delicadamente mas com firmeza remover o osso, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não distorcer o círculo de osso ao levantar-lo para evitar possíveis danos ao dura. </li><li> Gentilmente aplicar o gelfoam embebido em soro fisiológico estéril sobre a dura para ajudar a parar o sangramento. Espere até que todos sangramento está totalmente parado. Retire cuidadosamente o gelfoam para não perturbar o processo de coagulação. Nota: A área de sutura é altamente vascularizado, de modo que o sangramento neste momento pode vir a ser profundo. É essencial para esperar o tempo suficiente para que o sangramento parar completamente. É útil para manter o Gelfoam embebido em solução salina arrefecido colocando-o sobre gelo. </li></ol> Injeção 3. Virus <ol><li> Fixe a bomba de infusão para a torre estereotáxica e ligar o controlador. </li><li> Inserir a agulha 35G para a seringa. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizar e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de eThanol. Retirar as bolhas de ar a partir da seringa. Inserir a seringa para dentro da bomba. Nota: Considere o uso de outros desinfectantes. </li><li> Descongelar uma dose única de rAAV2 / 1 Preparação mCherry (10 12 pfu é recomendado) e mantê-lo em gelo. Encher a seringa com a solução de vírus. </li><li> Centralizar a agulha na bregma e insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: AP -2, ML +/- 1.0, DV-1. Estas coordenadas será localizada perto da borda da craniotomia. Espera durante 5 min para o tecido para estabilizar. </li><li> Injectar 0,7 mL da solução rAAV2 / 1 mCherry à taxa de 50 nl / min. Esperar 10 minutos para que o vírus adsorver totalmente. Remova cuidadosamente a agulha. Seque com gelfoam se o sangramento ocorre. Repita com o site contralateral. </li></ol> 4. Cranial Janela Implantação <ol><li> Colocar a lamela esterilizada, secou-se sobre a parte superior da dura-máter no quadro do círculo perfurado. Segure a lamela com a forceps para achatar suavemente a dura e trazer lamela &#39;bordas mais perto da superfície do crânio. Nota: É possível que a lamela perturba o coágulo e os currículos sangramento. Se for esse o caso, levantar a lamela, coloque-o em álcool, seco e volte para o passo 2.9. </li><li> Usando uma agulha estéril aplicar a cola de cianoacrilato densa nas bordas lamela para anexá-los ao crânio. Aguarde até que a cola secar. </li><li> Coloque uma barra de fixação (porca M2 ou um projeto feito sob encomenda) na parte frontal do crânio. Aplicar a cola de cianoacrilato sobre as bordas da barra. Aguarde até que a cola secar. <ol><li> Coloque a barra de fixação numa posição que permita o posicionamento horizontal da janela craniana durante a imagem sessão. Coloque-o tão distante quanto possível a partir da janela. Se for colocado muito perto da janela, o bar e o parafuso conectando-o com o porta-feito sob medida pode representar um obstáculo para o objectivo, durante o processo de imagem. </li></ol></li><lI&gt; Prepara-se o acrílico dental e aplicá-lo sobre a superfície do crânio em torno do vidro. É útil para formar uma forma semelhante a cratera em torno da janela. Ele vai criar uma cavidade para água aplicada mais tarde para a imagem latente com o objetivo de água. </li><li> Criar um tampão com o acrílico dental, cobrindo o resto da área operacional, bordas da pele, barra de fixação, o que reforça a cratera em torno da janela craniana. Aguarde até que o cimento dental para endurecer. </li><li> Remover o animal a partir do quadro estereotáxico e colocá-lo na câmara de recuperação. </li><li> Aguarde até que o animal se recuperar da cirurgia, respeitando as funções fisiológicas. </li><li> Aplicar analgesia pós-operatória (carprofeno, 10 mg / kg) e tratamento antibióticos (Baytril, 5 mg / kg) durante 48 horas. </li></ol> 5. Imagiologia <ol><li> Comece o laser de Ti: safira, poder-se o microscópio. O sistema utilizado nesta experiência é equipado com um laser de dois fotões, sistema OPO e PMT GaAsP dupla. </li><li> Coloque o animal no Induccâmara ção e induzir a anestesia. </li><li> Remover o animal a partir da câmara de indução e em lugar da máscara de anestesia de gás sob o microscópio. Diminuir o fluxo de oxigênio para 0,3 L / min ea concentração de isoflurano a 1,5-2%. </li><li> Corrigir o animal ao corpo do microscópio personalizado com um parafuso M2 (ou outro sistema personalizado). Nivelar o janela craniana. Nota: É possível usar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora a custom frame específica dá melhores resultados (maior estabilidade cabeça, posicionamento constante em várias sessões durante uma experiência crônica). </li><li> Usando as configurações de microscópio e uma ampliação widefield centro objectiva de baixa o ponto de vista de um dos lados do córtex retroesplenial e concentrá-la sobre a superfície da lamela. </li><li> Aplicar uma gotícula de água para dentro do poço acrílico tipo cratera. Mudar para uma objectiva de imersão em água de longa distância. Mova o objectivo para a janela do crânio até o menisco de água conNECTS o espécime e objetiva. </li><li> Mudar para as definições de dois fótons e começar a digitalizar o topo da amostra para baixo usando menor zoom. O cruzamento de dura-máter será visível como um brilho elevado de sinal não específico. </li><li> Ajustar as configurações de aquisição de microscópio em ambos os canais (GFP e mCherry) de acordo com a intensidade do sinal a partir de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a gama dinâmica. </li><li> Depois de encontrar um neurônio adequado (com a árvore dendrítica separada de outras células) realizar uma verificação inicial usando apenas o filterset GFP com menor zoom e z-distância de 5 microns. </li><li> Obter uma projeção máxima da pilha digitalizado e imprimi-lo para anotações (usando cores invertidas). </li><li> Ajuste de zoom para um valor que irá permitir à imagem os detalhes morfológicos desejados. Imagem toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry usando projeção máxima como guia. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li>
<li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li>
<li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li>
<li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li>
</ol>

Os autores (KL, MR, KR) têm direitos de patente pendentes (PL410001) para o chassis de suporte usado neste artigo.

No presente trabalho apresentamos um protocolo para a utilização simultânea de dois fótons de imagem in vivo das entradas sinápticas e metas pós-sinápticos em RSC através de uma janela craniana. O procedimento de implantação consistem em vários passos-chave. Em primeiro lugar, o animal é anestesiado profundamente e fixada na moldura estereotáxica, em seguida, o crânio sobre RSC é diluído com uma broca ao longo das linhas circulares marcados e o osso circular é removido. Após a hemorragia é parada, o rAAV2 / 1 <...

microscopia de dois fótons revolucionou a observação de atividade cerebral em viver e se comportar animais. Desde a sua introdução, em 1990, rapidamente ganhou popularidade e agora é implementado como uma das abordagens mais interessantes e inovadores no sentido de exame dos vários aspectos da atividade do cérebro in vivo 1,2. Estas aplicações incluem medições de fluxo de sangue, ativação neuronal (por exemplo, usando indicadores de nível de cálcio ou genes precoces imediatos de expressão) e a morfologia das células neuronais. Um número crescente de laboratórios usam microscópios de dois fótons, implementando a técnica em todo o mundo científico como um novo padrão para in vivo de imagens do cérebro. A abordagem padrão envolve o implante da janela cranial (um buraco redondo no crânio coberto com uma tampa de vidro) sobre o tambor ou córtex visual do cérebro do rato 3. Em seguida, dependendo do protocolo experimental, o mouse sofre uma série de visualização e sessões de treinamento comportamental, permitindo monitorar as mudanças na atividade cerebral e morfologia neuronal ao longo do tempo 4,5. Em ambos os casos, a craniotomia só afecta o osso parietal, sem atravessar as suturas. Acredita-se largamente que a principal desvantagem da técnica é a sua aplicação limitada a córtices facilmente acessíveis, tais como o barril ou córtex visual. Implantação da janela craniana sobre outras regiões levanta uma série de dificuldades, devido a hemorragia excessiva e / ou impedimento espacial. Neste trabalho, propomos a implantação da janela do crânio acima do córtex retrosplï¿½ico (RSC) como outra possível região de interesse para dois fótons em microscopia vivo 6. RSC é um elemento importante do circuito do cérebro responsável pela formação da memória espacial. Anatomicamente, CER é uma parte de uma rede neuronal cortical de ligação, do hipocampo, do tálamo e as regiões 7. Isto éfortemente envolvido em uma série de comportamentos, tais como a aprendizagem e extinção espacial, bem como navegação espacial 6. Para visualizar as alterações morfológicas dos neurônios usamos uma linha de rato transgénico expressando a proteína fluorescente verde (GFP) sob o promotor Thy1. Nestes ratos, GFP é expressa em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro que permitem a visualização clara dos axônios e dendritos corticais por meio de microscopia de dois fótons 8. Uma outra inovação que propomos consiste na injecção de um adeno-associado recombinante de vírus de serotipo 2/1 (rAAV2 / 1) que codifica uma proteína fluorescente vermelha (mCherry) sob um promotor específico de neurónios CaMKII 9 nas estruturas mais profundas do cérebro que se projectam para RSC , tal como o hipocampo. A expressão de rAAV2 / 1 mCherry no hipocampo de rato Thy1-GFP permite a visualização simultânea de elementos pré- e pós-sinápticos do Hippocampo-Cortical sinapses 10. A expressão de rAAV-driven de mCherry requer duas a três semanas para a proteína para alcançar um nível suficiente nos terminais axonais. Este período é consistente com o tempo habitual necessário para a recuperação de craniotomia.

<table><tbody><tr><td><forte>Medicamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pré-operatório</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1,5-2% durante a cirurgia</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0,2mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2,50%</td><td>5 mg/kg por via subcutânea</td></tr><tr><td>Tolfedina</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg por via subcutânea</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg por via subcutânea</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg por via subcutânea</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>por via tópica</td></tr><tr><td>Lidocaína</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>por via tópica</td></tr><tr><td>Cirurgia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topicamente</td></tr><tr><td>CA cola</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Acrílico dental</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Moldura estereotáxica</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Aparelho</td><td>HSE-64-0720</td><td>Broca</td></tr><tr><td>odontológica</td> de 3 mm de diâmetro <td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Barra de fixação Porcas</td><td>de</td> parafuso <td>N/A</td><td>M2 ou M3 personalizadas podem ser usadas</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Feito sob medida</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dois fotões</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Unidade do laser: Camaleão coerente 690-1040nm com oscilador paramétrico ótico 1050-1300nm. Objetivos: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0,1 e LD Plan-APOCHROMAT 20x/1,0. Detecção: Filtros passa-banda Zeiss BP 500-550 (GFP) e BP 570-610 (mCherry) separados por divisor de feixe a 560nm e acoplados a dois fotodetectores GaAsP.&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vírus</td><td>presente de K. Deisseroth</td><td></td><td>Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) expressando a proteína fluorescente mCherry sob o controle do promotor CaMK</td></tr></tbody></table>

simultânea de dois fótons<em&gt; in vivo</em&gt; imagem de synaptic entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a aquisição de imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos (RSC) usando microscopia de dois fótons in vivo na linha de camundongos transgênicos Thy1-GFP. Essa abordagem cria a possibilidade de investigar a correlação de manipulações comportamentais com mudanças na morfologia neuronal in vivo.
O procedimento de implantação da janela craniana foi considerado limitado apenas às regiões do córtex de fácil acesso, como o campo do barril. Nossa abordagem permite a visualização de neurônios no RSC altamente vascularizado. A RSC é um elemento importante do circuito cerebral responsável pela memória espacial, anteriormente considerado problemático para imagens in vivo de dois fótons.
A implantação da janela craniana sobre o RSC é combinada com uma injeção de vírus adeno-associado recombinante que expressa mCherry (rAAVmCherry) no hipocampo dorsal. O mCherry expresso se espalha para projeções axonais do hipocampo para o RSC, permitindo a visualização de mudanças nos botões axonais pré-sinápticos e nas espinhas dendríticas pós-sinápticas no córtex. 
Esta técnica permite o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência no RSC.

A expressão de GFP em um subconjunto de neurónios no ratinho repórter Thy1-GFP permite a imagem in vivo dos dendritos corticais e projecções axonais locais no RSC. A Figura 1A mostra a projecção máxima de uma pilha de imagens múltiplas com dendrites GFP positivas visíveis. O corpo da célula é obscurecida por uma artéria. A Figura 1B mostra uma imagem ampliada único plano (zoom digital de 3x) do ramo dendríticas indicado no 1A. Detalhes da morfol...

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Ético Local do Instituto Nencki de Biologia Experimental, Academia Polonesa de Ciências. Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a imagem crônica de neurônios no córtex retrosplenial de camundongos utilizando microscopia de dois fótons in vivo na linhagem transgênica thi one-G de feet. Essa abordagem é combinada com a injeção do vírus adeno-associado, AAV, que expressa mCherry, no hipocampo dorsal.Combinadas, essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da dependência experiente e da plasticidade estrutural no córtex retrosplenial. Neste artigo, propomos a implantação de uma janela craniana acima do córtex retrosplenial como uma região de interesse viável para a microscopia in vivo de dois fótons. Para visualizar as alterações morfológicas nas estruturas neuronais, utilizamos camundongos da linhagem thi one-G de B com expressão da proteína fluorescente GFP em aproximadamente 10 por cento dos neurônios no cérebro.Outra inovação que propomos é a injeção de um AAV, expressando uma proteína fluorescente mCherry sob um promotor específico de neurônios, em estruturas mais profundas do cérebro, como o hipocampo, com o objetivo de visualizar as projeções dessa estrutura para o córtex retrosplenial. Esterilize todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas descartáveis.Limpe a mesa cirúrgica, o estereotáxico e toda a área ao redor com etanol 70%. Use um campo cirúrgico estéril para criar um espaço estéril para todos os equipamentos esterilizados. Corte a espuma de gel em pequenos pedaços e mergulhe-os em solução salina estéril.Coloque o animal na câmara de indução e ajuste o nível de isoflurano para 5% e o fluxo de oxigênio para dois litros por minuto. Este procedimento deve levar cerca de três minutos. Retire o animal da câmara de indução.Utilize pinças na cauda ou nos dedos dos pés para garantir que o animal esteja completamente sedado. Com tesouras precisas, retire os pelos da parte de trás da cabeça, entre as orelhas, até os olhos. Coloque o animal na estrutura estereotáxica e estabilize a cabeça com barras auriculares.Regule os níveis de anestesia para 1,5 a 2% de isoflurano e 0,3 litro por minuto de oxigênio. Aplique pomada ocular. Injete o animal por via subcutânea com tolfedina, 4 miligramas por quilograma, butomidor, 2 miligramas por quilograma, e Baytril, 5 miligramas por quilograma, para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.Administre o animal por via intramuscular com dexametasona, zero vírgula dois miligramas por quilograma, para prevenir inchaço cerebral. Limpe a pele usando cotonetes estéreis com betadine seguidos por etanol 70%. Troque as luvas e pulverize-as com etanol 70%.Levante a pele com pinça e, usando tesoura microcirúrgica, faça um corte horizontal ao longo da base da cabeça e depois obliquamente até o ponto frontal entre os olhos. Remova o retalho de pele. Aplique pomada de lidocaína com cotonete estéril sobre o periósteo para prevenir sangramento excessivo e dor.Use cotonetes estéreis ou bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com cotonetes estéreis. Usando uma agulha estéril, aplique cola de cianoacrilato densa nas bordas da pele para imobilizá-las e impedir o contato adicional com o cimento dental.Aguarde a cola secar. Coloque um cubre-objeto estéril de três milímetros sobre o crânio anteriormente à sutura lambdoide. Centralize o cubre-objeto nas coordenadas retrosplênica, anterior, bregma posterior menos dois vírgula oito, medial lateral bregma zero.Marque as bordas do lamínula arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque o lamínula de volta no recipiente estéril com etanol 70%. Utilize uma broca odontológica de alta velocidade com ponta de pequeno diâmetro para traçar um círculo de três milímetros de diâmetro.Limpe o local da perfuração do pó ósseo com cotonetes estéreis umedecidos com soro fisiológico. Use a espuma de gel e os cotonetes para estancar sangramentos ocasionais e limpar o osso. Entre as perfurações, verifique a espessura do osso com pinça fina, tocando suavemente o círculo ósseo e avaliando sua mobilidade.Levando em consideração que o osso é mais espesso na região das suturas. Interrompa a perfuração quando o círculo ósseo estiver móvel e apenas uma camada fina e uniforme de osso permanecer na periferia. Limpe o campo operatório de toda a poeira óssea remanescente com cotonetes umedecidos em solução salina.Deixe cair o soro fisiológico estéril sobre a área de perfuração, cobrindo o círculo perfurado. Levante cuidadosamente o círculo ósseo com uma pinça fina e, em seguida, remova-o suave mas firmemente, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não torcer o círculo ósseo ao levantá-lo, a fim de evitar possíveis danos à dura-máter.Aplicar suavemente a espuma de gel embebida em solução salina estéril sobre a dura-máter para auxiliar na cessação do sangramento. Aguardar até que todo o sangramento seja completamente interrompido. Remover cuidadosamente a espuma de gel para não perturbar o processo de coagulação.Observe que a área de sutura é altamente vascularizada, de modo que o sangramento nesse ponto pode ser acentuado. É essencial aguardar tempo suficiente para que o sangramento cesse. Conecte a bomba de infusão à torre estereotáxica e ligue o controlador.Insira a agulha de calibre 35 na seringa de preenchimento. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizá-la e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de etanol. Remova as bolhas de ar da seringa.Insira a seringa na bomba. Prepare uma dose única da solução de AV e mantenha-a em gelo. Encha a seringa com a solução viral.Centralize a agulha no bregma e, em seguida, insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: anterior, posterior menos dois, medial lateral mais ou menos um, dorsal ventral menos um. Essas coordenadas estarão localizadas próximo à borda do domínio craniano. Aguarde cinco minutos para que o tecido se estabilize.Injete zero vírgula sete microlitros de solução AV à taxa de 50 nanolitros por minuto. Aguarde 10 minutos para que o vírus seja completamente absorvido. Remova cuidadosamente a agulha.Pressione com espuma de gel se houver sangramento. Repita o procedimento no lado contralateral. Coloque a lâmina de vidro estéril e seca sobre a dura-máter dentro da moldura circular perfurada.Segure o vidro de cobertura com a pinça para suavemente aplainar a dura-máter e aproximar as bordas do vidro de cobertura da superfície do crânio. Usando uma agulha estéril, aplique a cola de cianoacrilato densa nas bordas do vidro de cobertura para fixá-las ao crânio. Aguarde a cola secar.Coloque uma barra de fixação, porca Anton ou um design personalizado na parte frontal do crânio. Observe que a barra de fixação deve ser posicionada de forma a permitir o alinhamento horizontal da janela craniana durante a sessão de imagem. Aplique a cola sobre as bordas da barra.Aguarde a secagem da cola. Observe que a barra de fixação deve ser colocada o mais distante possível da janela. Se for colocada muito próxima à janela, a barra e o parafuso que a conecta ao suporte personalizado podem se tornar um obstáculo para a objetiva durante o processo de imageamento.Prepare o acrílico dental e aplique-o sobre a superfície do crânio ao redor do vidro. É útil formar uma forma semelhante a uma cratera ao redor da janela. Isso criará uma cavidade para a água, que será aplicada posteriormente durante a imagem com a objetiva de imersão em água.Crie uma capa com a resina acrílica dental, cobrindo as bordas da área operacional e a barra de fixação da pele, reforçando a cratera ao redor da janela craniana. Aguarde a cura do cimento dental. Remova o animal do estereotáxico e coloque-o na câmara de recuperação.Aguarde a recuperação do animal da cirurgia enquanto observa as funções fisiológicas. Aplique anestesia pós-operatória com citoproferrina, 10 miligramas por quilograma, e tratamento com antibiótico baytril, cinco miligramas por quilograma, durante 48 horas. Ligue o laser de safira de titânio, ligue o microscópio.O sistema utilizado neste experimento é equipado com um laser de dois fótons, sistema OPO e PMT duplo de arsenieto de gálio falsificado. Coloque o animal na câmara de indução e induza a anestesia. Remova o animal da câmara de indução e posicione-o sob a máscara de anestesia a gás embaixo do microscópio.Reduza o fluxo de oxigênio para zero vírgula três litros por minuto e a concentração de isoflurano para 1,52%. Fixe o animal ao suporte personalizado do microscópio com um parafuso MT ou outro sistema personalizado. Nivele a janela craniana. Observe que é possível utilizar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora o suporte personalizado específico ofereça melhores resultados, maior estabilidade da cabeça e posicionamento constante em múltiplas sessões durante um experimento crônico.Usando as configurações do microscópio de campo amplo e uma objetiva de baixa ampliação, centralize a visão em um dos lados do córtex retrosplenial e foque na superfície do lamínula. Aplique uma gota de água no poço acrílico com formato de cratera. Alterne para uma objetiva de imersão em água de longa distância.Mova a objetiva em direção à janela craniana até que o menisco de água conecte o espécime e a objetiva. Alterne para as configurações de dois fótons e comece a escanear o espécime de cima para baixo usando o menor zoom. A travessia da dura-máter será visível como um brilho de sinal não específico alto.Ajuste as configurações de aquisição do microscópio em ambos os canais, GFP e mCherry, de acordo com a intensidade do sinal de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a faixa dinâmica. Após encontrar um neurônio adequado com a árvore dendrítica separada de outras células, realize uma varredura inicial usando apenas filtros GFP com o menor aumento e distância Z de cinco micrômetros. Obtenha uma projeção máxima da pilha de varredura e imprima-a para anotações usando cores invertidas.Defina o zoom para um valor que permita imagens dos detalhes morfológicos desejados. Imagem de toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry utilizando projeção máxima como guia. Com este protocolo, será possível monitorar repetidamente tanto as estruturas pré como pós-sinápticas no córtex retrosplenial.Essa abordagem pode ser utilizada em um experimento crônico no qual manipulações comportamentais são esperadas para correlacionar alterações na morfologia de dendritos, espinhos sinápticos ou neurônios pré-sinápticos. As sessões de imagem podem ser realizadas com qualquer frequência, mas um intervalo de 24 horas é preferido para permitir a recuperação adequada do animal e minimizar o efeito da anestesia. Se aplicada corretamente, essa técnica permite realizar múltiplas sessões de imagem ao longo de vários meses.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Fonte: Wang, Z., et al. Imagem in vivo de dois fótons transpupilares da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra uma técnica para imagens de retina in vivo usando microscopia de dois fótons. Os camundongos anestesiados são preparados para a imagem prendendo suas cabeças, aplicando lubrificante ocular e colocando uma lamínula sobre o olho. As células ganglionares da retina (RGCs) que expressam proteínas fluorescentes são visualizadas pela primeira vez usando...

Imagem in vivo de dois fótons da retina de camundongos

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados. J. Vis. Exp.Exp..  (2022) Este vídeo mostra um procedimento de microscopia de dois fótons para imagem da atividade neuronal e da dinâmica microglial em um camundongo acordado durante a estimulação visual, destacando transientes de cálcio e interações celulares.

Imagem simultânea da dinâmica microglial e atividade neuronal em um camundongo acordado

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Descrevemos um procedimento experimental para medir a atividade neuronal através de janelas ópticas duas acima bilateral corticies somatossensorial primária (S1) em Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos usando 2-fóton (2P) microscopia na vivo.

Imagem de atividade Neural no córtex somatossensorial primário usando Thy1-GCaMP6s de ratos transgênicos

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A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Aprenda a realizar craniotomia para imagem crônica de neurônios no córtex retrosplenial de camundongos usando microscopia de dois fótons in vivo. Este método permite monitorar a plasticidade estrutural dependente de experiência por longos períodos.

Simultânea de dois fótons

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