Simultânea de dois fótons In Vivo Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrospl�ico

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê de Ética Local do Instituto Nenscki de Biologia Experiemental, Academia Polonesa de Ciências. Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a imagem crônica de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons nesta linha transgênica de um G de pés. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry, AAV, no hipocampo dorsal.

Combinadas, essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da dependência experimentada, plasticidade estrutural no córtex retroesplenial. Neste artigo, propomos a implantação da janela craniana acima do córtex retroesplenial como não uma possível região de interesse para a microscopia in vivo de dois fótons. Para visualizar as mudanças morfológicas nas estruturas neuronais, usamos este um-G de camundongos B com a expressão da proteína GFP fluorescente em aproximadamente 10% dos neurônios no cérebro.

Outra inovação que propomos é a injeção de um AAV, expressão de uma proteína fluorescente mCherry sob um promotor específico de neurônio nas estruturas mais profundas do cérebro, como o hipocampo, a fim de visualizar projeções da estrutura no córtex retroesplenial. Esterilize todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Suas luvas dispensáveis.

Limpe a mesa cirúrgica, a estrutura estereotáxica e toda a área circundante com etanol 70%. Use uma almofada cirúrgica estéril para criar um espaço estéril para todo o equipamento esterilizado. Corte a espuma de gel em pedaços pequenos e mergulhe-os em solução salina estéril.

Coloque o animal na câmara de indução e ajuste o nível de isoflurano para 5% e o fluxo de oxigênio para dois litros por minuto. Este procedimento deve levar cerca de três minutos. Retire o animal da câmara de indução.

Use pinças de cauda ou dedo do pé para garantir que o animal esteja totalmente sedado. Usando aparadores precisos, raspe o cabelo da parte de trás da cabeça, entre as orelhas, até os olhos. Coloque o animal na estrutura estereotáxica e estabilize a cabeça com barras auriculares.

Defina os níveis de anestesia para 1,5 a 2% de isoflurano e zero vírgula três litros por minuto de oxigênio. Aplique a pomada para os olhos. Injete no animal por via subcutânea tolfedina, quatro miligramas por quilograma, butomidor, dois miligramas por quilograma, e Baytril, cinco miligramas por quilograma para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.

Injete o animal por via intramuscular com dexametasona, zero vírgula dois miligramas por quilograma, para evitar o inchaço do cérebro. Limpe a pele usando cotonetes estéreis com betadine seguido de etanol a 70%. Troque as luvas e borrife-as com 70% de etanol.

Levante a pele com uma pinça e, usando uma microtesoura, faça uma incisão na pele horizontalmente ao longo da base da cabeça e, em seguida, obliquamente até o ponto frontal entre os olhos. Remova a aba de pele. Aplique pomada de lidocaína com cotonete estéril no periósteo para evitar sangramento excessivo e dor.

Use cotonetes estéreis ou bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com cotonetes estéreis. Usando agulha estéril, aplique cola densa de cianoacrilato nas bordas da pele para imobilizá-las e evitar mais contato com o cimento dental.

Espere a cola secar. Coloque uma lamínula estéril de três milímetros sobre o crânio anteriormente à sutura lambdoide. Centralize a lamínula nas coordenadas retroespleniais, anterior, posterior bregma menos-dois vírgula oito, bregma medial lateral zero.

Marque as bordas da lamínula arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque a lamínula de volta no recipiente estéril com etanol a 70%. Use uma broca odontológica de alta velocidade com broca de pequeno diâmetro para delinear um círculo de três milímetros de diâmetro.

Limpe o local de perfuração do pó ósseo com cotonetes estéreis com ponta salina. Use a espuma de gel e cotonetes para parar o sangramento ocasional e limpar o osso. Entre as perfurações, verifique a espessura do osso com uma pinça fina, tocando suavemente o círculo ósseo e verificando sua mobilidade.

Tendo em mente que o osso é mais espesso na área das suturas. Pare a perfuração quando o círculo ósseo estiver móvel e apenas uma camada fina de osso for deixada na circunferência. Limpe o campo operacional de todo o pó ósseo restante com cotonetes com ponta salina.

Solte a solução salina estéril na área de perfuração, cobrindo o círculo perfurado. Levante cuidadosamente o círculo ósseo com uma pinça fina e, em seguida, remova o osso com cuidado, mas com firmeza, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não inclinar o círculo ósseo ao levantá-lo para evitar possíveis danos à dura-máter.

Aplique suavemente a espuma de gel embebida em solução salina estéril na dura-máter para ajudar a estancar o sangramento. Aguarde até que todo o sangramento esteja totalmente parado. Remova cuidadosamente a espuma de gel para não perturbar o processo de coagulação.

Observe que a área de sutura é altamente vascularizada, então o sangramento neste ponto pode ser profundo. É essencial aguardar o tempo suficiente para que o sangramento pare. Conecte a bomba de infusão à torre estereotáxica e conecte o controlador.

Insira a agulha de calibre 35 na seringa de enchimento. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizá-la e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de etanol. Remova as bolhas de ar da seringa.

Insira a seringa na bomba. Encha uma dose única de preparação AV e mantenha-a no gelo. Encha a seringa com solução de vírus.

Centralize a agulha no bregma e, em seguida, insira-a suavemente no hipocampo usando as seguintes coordenadas: anterior, posterior menos dois, medial lateral mais menos um, dorsal ventral menos um. Essas coordenadas estarão localizadas perto da borda do domínio craniano. Aguarde cinco minutos para que o tecido se estabilize.

Injete sete microlitros de solução AV a uma taxa de 50 nanolitros por minuto. Aguarde 10 minutos para que o vírus seja totalmente absorvido. Remova suavemente a agulha.

Seque com espuma de gel se ocorrer sangramento. Repita com o lado contralateral. Coloque a lamínula seca estéril na parte superior da dura-máter na moldura circular perfurada.

Segure a lamínula com o foreceps para achatar suavemente a dura-máter e aproximar as bordas da lamínula da superfície do crânio. Usando uma agulha estéril, aplique a cola densa de cianoacrilato nas bordas da lamínula para prendê-las ao crânio. Espere a cola secar.

Coloque uma barra de fixação, uma porca anton ou um desenho feito sob medida na parte frontal do crânio. Observe que a barra de fixação deve ser colocada em uma posição que permita o posicionamento horizontal da janela craniana durante a sessão de imagem. Aplique a cola sobre as bordas da barra.

Espere a cola secar. Observe que a barra de fixação deve ser colocada o mais longe possível da janela. Se for colocado muito perto da janela, a barra e o parafuso que o conecta ao suporte feito sob medida podem representar um obstáculo para a objetiva durante o processo de imagem.

Prepare o acrílico dental e aplique-o na superfície do crânio ao redor do vidro. É útil formar uma forma semelhante a uma cratera ao redor da janela. Ele criará uma cavidade para a água aplicada posteriormente para imagens com a objetiva de água.

Crie uma tampa com o acrílico dentário, cobrindo o resto da área operacional, barra de fixação das bordas da pele, reforçando a cratera ao redor da janela craniana. Aguarde o cimento dentário endurecer. Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o na câmara de recuperação.

Aguarde que o animal se recupere da cirurgia enquanto observa as funções fisiológicas. Aplicar anestesia pós-operatória com crioproferrina, 10 miligramas por quilograma, e tratamento com antibióticos baytril, cinco miligramas por quilograma, por 48 horas. Inicie o laser de safira ti, ligue o microscópio.

O sistema usado neste experimento é equipado com um laser de dois fótons, sistema OPO e PMT falsificado com arseneto de gálio duplo. Coloque o animal na câmara de indução e induza a anestesia. Retire o animal da câmara de indução e coloque a máscara de anestesia gasosa sob o microscópio.

Diminua o fluxo de oxigênio para zero vírgula três litros por minuto e a concentração de isoflurano para 1,52%Fixe o animal na estrutura do microscópio personalizado com um parafuso MT ou outro sistema personalizado. Nivele a janela craniana. Observe que é possível usar o sistema de fixação da cabeça do fabricante do microscópio, embora a estrutura personalizada específica dê melhores resultados, melhor estabilidade da cabeça, posicionamento constante em várias sessões durante um experimento crônico.

Usando as configurações do microscópio de campo amplo, uma objetiva de baixa ampliação, centralize a visão em um dos lados do córtex retroesplenial e concentre-a na superfície da lamínula. Aplique uma gota de água no poço de acrílico semelhante a uma cratera. Mude para uma objetiva de imersão em água de longa distância.

Mova a objetiva em direção à janela craniana até que o menisco aquático conecte a amostra e a objetiva. Mude para as configurações de dois fótons e comece a escanear a amostra de cima para baixo usando o zoom mais baixo. O cruzamento da dura-máter será visível como brilho de alto sinal não específico.

Ajuste as configurações de aquisição do microscópio em ambos os canais, GFP e mCherry de acordo com a intensidade do sinal das células fluorescentes, a fim de cobrir toda a faixa dinâmica. Depois de encontrar um neurônio adequado com a árvore dendrítica separada de outras células, execute uma varredura inicial usando apenas filtros GFP definidos com zoom mais baixo e distância Z de cinco mícrons. Obtenha uma projeção máxima da pilha de digitalização e imprima-a para anotações usando cores invertidas.

Defina o zoom para um valor que permita criar imagens dos detalhes morfológicos desejados. Visualize toda a árvore dendrítica no canal GFP e mCherry usando a projeção máxima como guia. Usando este protocolo, será possível monitorar repetidamente as estruturas pré e pós-sinápticas no córtex retroesplenial.

Essa abordagem pode ser utilizada com um experimento crônico em que se espera que as manipulações comportamentais se correlacionem quando mudanças na morfologia de dendritos, espinhas sinápticas ou nêutrons pré-sinápticos. As sessões de imagem podem ser realizadas em qualquer frequência, mas o intervalo de tempo de 24 horas é preferido para permitir a recuperação adequada do animal e minimizar o efeito da anestesia. Se aplicada corretamente, essa técnica permite a realização de várias sessões de imagem ao longo de vários meses.