Simultânea de dois fótons

Todos os procedimentos experimentais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Ético Local do Instituto Nencki de Biologia Experimental, Academia Polonesa de Ciências. Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite a imagem crônica de neurônios no córtex retrosplenial de camundongos utilizando microscopia de dois fótons in vivo na linhagem transgênica thi one-G de feet. Essa abordagem é combinada com a injeção do vírus adeno-associado, AAV, que expressa mCherry, no hipocampo dorsal.

Combinadas, essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da dependência experiente e da plasticidade estrutural no córtex retrosplenial. Neste artigo, propomos a implantação de uma janela craniana acima do córtex retrosplenial como uma região de interesse viável para a microscopia in vivo de dois fótons. Para visualizar as alterações morfológicas nas estruturas neuronais, utilizamos camundongos da linhagem thi one-G de B com expressão da proteína fluorescente GFP em aproximadamente 10 por cento dos neurônios no cérebro.

Outra inovação que propomos é a injeção de um AAV, expressando uma proteína fluorescente mCherry sob um promotor específico de neurônios, em estruturas mais profundas do cérebro, como o hipocampo, com o objetivo de visualizar as projeções dessa estrutura para o córtex retrosplenial. Esterilize todas as ferramentas, recipientes de vidro para líquidos e cotonetes na autoclave. Use luvas descartáveis.

Limpe a mesa cirúrgica, o estereotáxico e toda a área ao redor com etanol 70%. Use um campo cirúrgico estéril para criar um espaço estéril para todos os equipamentos esterilizados. Corte a espuma de gel em pequenos pedaços e mergulhe-os em solução salina estéril.

Coloque o animal na câmara de indução e ajuste o nível de isoflurano para 5% e o fluxo de oxigênio para dois litros por minuto. Este procedimento deve levar cerca de três minutos. Retire o animal da câmara de indução.

Utilize pinças na cauda ou nos dedos dos pés para garantir que o animal esteja completamente sedado. Com tesouras precisas, retire os pelos da parte de trás da cabeça, entre as orelhas, até os olhos. Coloque o animal na estrutura estereotáxica e estabilize a cabeça com barras auriculares.

Regule os níveis de anestesia para 1,5 a 2% de isoflurano e 0,3 litro por minuto de oxigênio. Aplique pomada ocular. Injete o animal por via subcutânea com tolfedina, 4 miligramas por quilograma, butomidor, 2 miligramas por quilograma, e Baytril, 5 miligramas por quilograma, para prevenir inflamação, dor e infecção, respectivamente.

Administre o animal por via intramuscular com dexametasona, zero vírgula dois miligramas por quilograma, para prevenir inchaço cerebral. Limpe a pele usando cotonetes estéreis com betadine seguidos por etanol 70%. Troque as luvas e pulverize-as com etanol 70%.

Levante a pele com pinça e, usando tesoura microcirúrgica, faça um corte horizontal ao longo da base da cabeça e depois obliquamente até o ponto frontal entre os olhos. Remova o retalho de pele. Aplique pomada de lidocaína com cotonete estéril sobre o periósteo para prevenir sangramento excessivo e dor.

Use cotonetes estéreis ou bisturi para remover o periósteo. Seque o crânio com cotonetes estéreis. Usando uma agulha estéril, aplique cola de cianoacrilato densa nas bordas da pele para imobilizá-las e impedir o contato adicional com o cimento dental.

Aguarde a cola secar. Coloque um cubre-objeto estéril de três milímetros sobre o crânio anteriormente à sutura lambdoide. Centralize o cubre-objeto nas coordenadas retrosplênica, anterior, bregma posterior menos dois vírgula oito, medial lateral bregma zero.

Marque as bordas do lamínula arranhando a superfície do crânio com uma agulha estéril. Coloque o lamínula de volta no recipiente estéril com etanol 70%. Utilize uma broca odontológica de alta velocidade com ponta de pequeno diâmetro para traçar um círculo de três milímetros de diâmetro.

Limpe o local da perfuração do pó ósseo com cotonetes estéreis umedecidos com soro fisiológico. Use a espuma de gel e os cotonetes para estancar sangramentos ocasionais e limpar o osso. Entre as perfurações, verifique a espessura do osso com pinça fina, tocando suavemente o círculo ósseo e avaliando sua mobilidade.

Levando em consideração que o osso é mais espesso na região das suturas. Interrompa a perfuração quando o círculo ósseo estiver móvel e apenas uma camada fina e uniforme de osso permanecer na periferia. Limpe o campo operatório de toda a poeira óssea remanescente com cotonetes umedecidos em solução salina.

Deixe cair o soro fisiológico estéril sobre a área de perfuração, cobrindo o círculo perfurado. Levante cuidadosamente o círculo ósseo com uma pinça fina e, em seguida, remova-o suave mas firmemente, levantando-o para cima. Tenha cuidado para não torcer o círculo ósseo ao levantá-lo, a fim de evitar possíveis danos à dura-máter.

Aplicar suavemente a espuma de gel embebida em solução salina estéril sobre a dura-máter para auxiliar na cessação do sangramento. Aguardar até que todo o sangramento seja completamente interrompido. Remover cuidadosamente a espuma de gel para não perturbar o processo de coagulação.

Observe que a área de sutura é altamente vascularizada, de modo que o sangramento nesse ponto pode ser acentuado. É essencial aguardar tempo suficiente para que o sangramento cesse. Conecte a bomba de infusão à torre estereotáxica e ligue o controlador.

Insira a agulha de calibre 35 na seringa de preenchimento. Lave a seringa 10 vezes com etanol para esterilizá-la e 10 vezes com solução salina estéril para remover vestígios de etanol. Remova as bolhas de ar da seringa.

Insira a seringa na bomba. Prepare uma dose única da solução de AV e mantenha-a em gelo. Encha a seringa com a solução viral.

Centralize a agulha no bregma e, em seguida, insira suavemente no hipocampo utilizando as seguintes coordenadas: anterior, posterior menos dois, medial lateral mais ou menos um, dorsal ventral menos um. Essas coordenadas estarão localizadas próximo à borda do domínio craniano. Aguarde cinco minutos para que o tecido se estabilize.

Injete zero vírgula sete microlitros de solução AV à taxa de 50 nanolitros por minuto. Aguarde 10 minutos para que o vírus seja completamente absorvido. Remova cuidadosamente a agulha.

Pressione com espuma de gel se houver sangramento. Repita o procedimento no lado contralateral. Coloque a lâmina de vidro estéril e seca sobre a dura-máter dentro da moldura circular perfurada.

Segure o vidro de cobertura com a pinça para suavemente aplainar a dura-máter e aproximar as bordas do vidro de cobertura da superfície do crânio. Usando uma agulha estéril, aplique a cola de cianoacrilato densa nas bordas do vidro de cobertura para fixá-las ao crânio. Aguarde a cola secar.

Coloque uma barra de fixação, porca Anton ou um design personalizado na parte frontal do crânio. Observe que a barra de fixação deve ser posicionada de forma a permitir o alinhamento horizontal da janela craniana durante a sessão de imagem. Aplique a cola sobre as bordas da barra.

Aguarde a secagem da cola. Observe que a barra de fixação deve ser colocada o mais distante possível da janela. Se for colocada muito próxima à janela, a barra e o parafuso que a conecta ao suporte personalizado podem se tornar um obstáculo para a objetiva durante o processo de imageamento.

Prepare o acrílico dental e aplique-o sobre a superfície do crânio ao redor do vidro. É útil formar uma forma semelhante a uma cratera ao redor da janela. Isso criará uma cavidade para a água, que será aplicada posteriormente durante a imagem com a objetiva de imersão em água.

Crie uma capa com a resina acrílica dental, cobrindo as bordas da área operacional e a barra de fixação da pele, reforçando a cratera ao redor da janela craniana. Aguarde a cura do cimento dental. Remova o animal do estereotáxico e coloque-o na câmara de recuperação.

Aguarde a recuperação do animal da cirurgia enquanto observa as funções fisiológicas. Aplique anestesia pós-operatória com citoproferrina, 10 miligramas por quilograma, e tratamento com antibiótico baytril, cinco miligramas por quilograma, durante 48 horas. Ligue o laser de safira de titânio, ligue o microscópio.

O sistema utilizado neste experimento é equipado com um laser de dois fótons, sistema OPO e PMT duplo de arsenieto de gálio falsificado. Coloque o animal na câmara de indução e induza a anestesia. Remova o animal da câmara de indução e posicione-o sob a máscara de anestesia a gás embaixo do microscópio.

Reduza o fluxo de oxigênio para zero vírgula três litros por minuto e a concentração de isoflurano para 1,52%. Fixe o animal ao suporte personalizado do microscópio com um parafuso MT ou outro sistema personalizado. Nivele a janela craniana. Observe que é possível utilizar o sistema de fixação de cabeça do fabricante do microscópio, embora o suporte personalizado específico ofereça melhores resultados, maior estabilidade da cabeça e posicionamento constante em múltiplas sessões durante um experimento crônico.

Usando as configurações do microscópio de campo amplo e uma objetiva de baixa ampliação, centralize a visão em um dos lados do córtex retrosplenial e foque na superfície do lamínula. Aplique uma gota de água no poço acrílico com formato de cratera. Alterne para uma objetiva de imersão em água de longa distância.

Mova a objetiva em direção à janela craniana até que o menisco de água conecte o espécime e a objetiva. Alterne para as configurações de dois fótons e comece a escanear o espécime de cima para baixo usando o menor zoom. A travessia da dura-máter será visível como um brilho de sinal não específico alto.

Ajuste as configurações de aquisição do microscópio em ambos os canais, GFP e mCherry, de acordo com a intensidade do sinal de células fluorescentes, a fim de cobrir toda a faixa dinâmica. Após encontrar um neurônio adequado com a árvore dendrítica separada de outras células, realize uma varredura inicial usando apenas filtros GFP com o menor aumento e distância Z de cinco micrômetros. Obtenha uma projeção máxima da pilha de varredura e imprima-a para anotações usando cores invertidas.

Defina o zoom para um valor que permita imagens dos detalhes morfológicos desejados. Imagem de toda a árvore dendrítica nos canais GFP e mCherry utilizando projeção máxima como guia. Com este protocolo, será possível monitorar repetidamente tanto as estruturas pré como pós-sinápticas no córtex retrosplenial.

Essa abordagem pode ser utilizada em um experimento crônico no qual manipulações comportamentais são esperadas para correlacionar alterações na morfologia de dendritos, espinhos sinápticos ou neurônios pré-sinápticos. As sessões de imagem podem ser realizadas com qualquer frequência, mas um intervalo de 24 horas é preferido para permitir a recuperação adequada do animal e minimizar o efeito da anestesia. Se aplicada corretamente, essa técnica permite realizar múltiplas sessões de imagem ao longo de vários meses.