Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

O objetivo geral desses procedimentos é estudar a formação das paredes aórticas embrionárias e perinatais durante o desenvolvimento normal, bem como as perturbações nesse processo durante a doença. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento vascular, como qual é a fonte das células que contribuem para o meio vascular embrionário e perinatal. A principal vantagem dessas técnicas é que elas permitem a avaliação da patogênese e morfogênese do músculo liso que ocorrem durante os estágios embrionários e perinatais de desenvolvimento.

A implicação dessas técnicas decorre para a terapia de doenças vasculares, como estenose aórtica supravalvar de doença periódica que causa produção excessiva de células sumo. O procedimento de colocação da mini bomba será realizado pelo Dr. Jiasheng Zhang, um cientista pesquisador que dirige um núcleo de microcirurgia e a Universidade de Yale. Comece configurando pares de acasalamento entre camundongos de dois a seis meses de idade com Cre ER e camundongos com um repórter cre.

Usando uma sonda de metal, verifique se há tampões vaginais todas as manhãs, separando a fêmea do macho quando um plug for detectado. Para indução embrionária precoce, injete tamoxifeno por via intraperitoneal na umidade da grávido. Para marcar as células no meio do período gestacional e no final e rastrear seu destino ou clonalidade no camundongo pós-natal, injete progesterona na cavidade intraperitoneal da umidade grávida incompetentemente com tamoxifeno em uma proporção de uma a duas doses.

Para colher os embriões na data embrionária apropriada, limpe o abdômen da umidade grávida com etanol a 70% e use uma tesoura para abrir o abdômen para remover o útero. Colete os embriões do útero usando uma pinça e um microscópio estéreo para separá-los cuidadosamente da placenta e do saco vitelino. Fixe os embriões em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius por duas horas.

Seguido de três lavagens em PBS para remover o excesso de fixador. Após a terceira lavagem, incubar os embriões em sacarose a 30% em PBS, em tubos individuais de 15 mililitros até que os embriões afundem. Em seguida, encha os moldes de congelamento de plástico com composto de temperatura de corte ideal até dois terços do volume máximo e coloque um embrião verticalmente em cada molde.

Após 10 minutos em temperatura ambiente, congele os tecidos na vertical em um banho de gelo seco com etanol a 70% e ajuste a temperatura do criostato para 22 graus Celsius. Corte os blocos de tecido para gerar fatias de tecido transversal de 10 a 20 micrômetros de espessura em toda a aorta, capturando cada seção em uma lâmina de microscópio de vidro à medida que são obtidas. Quando todas as amostras tiverem sido adquiridas, seque as lâminas à temperatura ambiente durante 30 minutos antes do armazenamento a 80 graus Celsius.

Para manchar as amostras de tecido, descongele as lâminas à temperatura ambiente, proteja-as da luz para evitar o branqueamento com fluoróforo e lave as lâminas em 0,1% PBS twin 20. Para análise clonal, corar os tecidos com um corante nuclear apropriado e obter imagens diretas dos outros fluróforos do repórter arco-íris em um microscópio fluorescente. Para mapeamento de destino, com o repórter mTmG cre, visualize a expressão de GFP por imagem direta com ou sem imunocoloração.

Para cultivar e explantar uma aorta embrionária, coloque o embrião em decúbito dorsal e prenda os membros estendidos a uma placa de dissecção sob um microscópio estereoscópico. Usando uma tesoura, faça uma incisão vertical do abdômen através do esterno até a parte superior do tórax. Disseque os melhores pulmões traqueais, esôfago, fígado e intestino.

Use uma pinça para puxar suavemente o coração ventralmente, usando uma tesoura para dissecar a aorta para longe do aspecto dorsal das cavidades torácica e abdominal. Corte a aorta na raiz proximal e nas posições abdominais distais para liberá-la e coloque a aorta colhida em PBS gelado estéril em uma capa de cultura de células. Após uma breve lavagem, transfira a aorta para um poço de uma placa de 24 poços, contendo meio DMEM suplementado com 0,5% de PBS e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células por até 24 horas.

Ao final da incubação, lave a aorta duas vezes com PBS e fixe o tecido em paraformaldeído a 4% por 20 minutos. Após mais três lavagens de PBS, transfira a aorta para um tubo de 1,5 mililitro contendo 30% de sacarosina PBS até que o tecido afunde. Para o isolamento das células musculares lisas da aorta perinatal, use uma agulha de calibre 23 para perfurar o ventrículo esquerdo de um camundongo pós-natal de 0,5 dia e use um tubo de plástico para conectar a agulha a uma seringa estéril contendo PBS, mantida verticalmente em uma posição elevada, de modo que o PBS flua para o ventrículo esquerdo por gravidade.

Quando o fígado branquear, use uma pinça para remover o tecido adventício do lado de fora da aorta e colha a aorta como acabamos de demonstrar. Dissocie o tecido aórtico em 500 microlitros de solução de digestão com agitação manual a cada cinco a 10 minutos. Após 45 minutos, transfira o tubo para uma capa de cultura de células estéril e use uma pipeta de 200 microlitros para triturar a pasta de tecido até obter uma suspensão de célula única.

Transferir as células para um tubo cónico de 15 mililitros e, em seguida, adicionar dois mililitros de DMEM e recolher as células por centrifugação. Ressuspender o sedimento em três mililitros de meio de cultura de células musculares lisas e semear as células numa placa de cultura de 35 milímetros. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius, atualizando o meio de cultura de células a cada três dias.

Para colocar uma mini bomba osmótica subcutânea, comece raspando a parte inferior das costas de um camundongo anestesiado com uma tesoura e coloque o mouse em decúbito ventral em uma placa cirúrgica aquecida. Esfregue as costas com betadine e álcool isopropílico e coloque o mouse sob um microscópio estéreo. Em seguida, use um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele de 0,5 a um centímetro aproximadamente três a cinco centímetros rostral à base da cauda, sem ferir o músculo subjacente.

Insira um hemostático na incisão e abra e feche as mandíbulas do hemostático para criar uma bolsa subcutânea. Insira uma mini bomba osmótica cheia do agente de interesse na bolsa e use suturas não absorvíveis de 6o para fechar a incisão. Em seguida, permita que o camundongo se recupere com monitoramento até a obtenção da decúbito esternal.

Os embriões mutantes para o gene que codifica a proteína da matriz extracelular, a elastina, acumulam excesso de células musculares lisas nas camadas internas da aorta, começando após o dia embrionário 15,5. A análise clonal das células musculares lisas com o repórter cre multicolorido durante este processo, indica que as células são de várias cores e, portanto, são policlonais. A imunocoloração de seções de aorta explantadas revela que as aortas embrionárias mutantes de elastina no dia 15,5 tornam-se hipermusculares e estenódicas dentro de 18 horas após a cultura, um processo que é atenuado pela adição de um anticorpo bloqueador beta três anti-antegrina.

Células musculares lisas isoladas da aorta de camundongos do tipo selvagem que pós-natal dia 0,5 expressam marcadores de células musculares lisas, mas não CD31. A infusão contínua de um inibidor da integrina beta três em umidade grávida a partir do dia embrionário 13,5 atenua significativamente a estenose aórtica e a hipermuscularização em camundongos mutantes para a proteína da matriz extracelular, elastina. Mas não altere as aortas de camundongos selvagens.

Uma vez dominada, a técnica de colocação da mini bomba osmótica pode ser concluída em menos de 10 minutos se for executada corretamente. Seguindo esses procedimentos, essas abordagens também podem ser extrapoladas para estudar o músculo liso codificado, não vascular, como tecido do trato gastrointestinal ou áreas pulmonares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir o mapeamento de ajuste embrionário in vivo e análise clonal, cultura de aortas embrionárias explantadas, células musculares lisas aórticas perinatais e minibombas osmóticas subcutâneas explantadas.

Não se esqueça de que trabalhar com ratos, tamoxifeno e um redutor fixo pode ser perigoso e que precauções como usar luvas e jaleco e tomar cuidado extra devem sempre ser tomadas ao realizar esses procedimentos.