Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária Xenopus tropicalis
25 de maio de 2017
Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a vasculatura de girinos de Xenopus tropicalis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia cardiovascular, como a forma como a angiogênese é regulada. A principal vantagem desta técnica é que os vasos sanguíneos em um embrião do tipo poço intacto podem ser visualizados por uma simples injeção de corante fluorescente.
Comece usando um micro carregador para encher uma micropipeta de vidro cônico com aproximadamente cinco microlitros de solução transparente de LDL diI acetilada, tomando cuidado para que nenhuma partícula precipitada seja carregada. Sob um microscópio de dissecação, use um par fino de pinças número 55 para prender a ponta da pipeta para ajustar o volume do complexo carregado e ajuste o sistema de injeção controlado por pressão para ejetar aproximadamente cinco nanolitros de solução por injeção. Em seguida, mergulhe a ponta da pipeta em 0,04% MS-222 em solução salina de Barth modificada 0,1X ou MBS em um molde Sylgard feito sob medida.
Em seguida, transfira o embrião de Xenopus tropicalis para o molde de Sylgard e confirme a sedação completa com falta de resposta à estimulação da barbatana dorsal. Sob o microscópio de dissecação, carregue o lado ventral do embrião para cima no recuo em forma de V do molde em uma posição ligeiramente oblíqua. Encaixe firmemente dois pinos minucianos de 0,1 milímetro em um porta-pinos e use um pino para perfurar a pele sobre o coração, que deve estar pulsando visivelmente.
Insira o pino pelo orifício no espaço entre o coração e a pele sem perfurar o coração e posicione a ponta inserida dentro da região onde será feita a incisão. Em seguida, esfregue o segundo pino contra o pino inserido para fazer uma incisão linear e use os dois pinos juntos para alargar suavemente a incisão, expondo o coração. Para injetar a solução de LDL acetilada DiI, insira a ponta da pipeta de vidro no coração e injete 50 a 60 nanolitros de LDL acetilada DiI em aproximadamente 10 pulsos de ejeção.
Quando toda a solução de corante tiver sido entregue, confirme se o coração ainda está batendo e transfira o embrião para uma nova placa de Petri contendo 0,1X MBS. Após cinco a 10 minutos, o girino deve se recuperar da anestesia e começar a se mover. Depois que um número adequado de embriões tiver sido injetado, examine visualmente os embriões anestesiados corretamente marcados sob um microscópio de fluorescência, descartando quaisquer animais que tenham outros órgãos marcados.
Embriões que foram insuficientemente marcados podem ser injetados novamente. Em seguida, capture imagens dos embriões corretamente marcados. Para uma imagem mais completa dos vasos sanguíneos, fixe os embriões reanestesiados em paraformaldeído a 4% por uma hora em temperatura ambiente protegido da luz para visualização por microscopia confocal.
Se uma quantidade suficiente de LDL diI acetilada for injetada no coração, a veia cardinal posterior, ou PCV, deve ser imediatamente visível sob um microscópio de fluorescência. As veias intersomíticas, ou ISVs, emergem dorsalmente do PCV em uma onda anterior para posterior, começando no estágio 36 e terminando em torno do estágio 40 a 41, tornando-se levemente ramificadas em torno do estágio 43. O PCV e o ISV crescem em um padrão angiogênico estereotipado que está sob rígido controle do desenvolvimento.
Curiosamente, o knockdown da sinalização TIE-2 por morfolinos antisense diminui o comprimento e a complexidade dos ISVs, enquanto a expressão da forma constitutivamente ativa do TIE-2 induz a ramificação excessiva do ISV. Um Índice de Complexidade de Veias pode ser calculado para avaliar a complexidade dos ISVs e caminhos renderizados podem ser gerados para visualizar a arquitetura geral da vasculatura embrionária de Xenopus tropicalis. O protocolo original foi descrito para o uso de Xenopus laevis por Levin e Colics e o adaptamos para Xenopus tropicalis.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se for executada corretamente. Antes desse procedimento, manipulações genéticas e farmacológicas podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como quais genes e vias de sinalização regulam o desenvolvimento vascular. Usando este procedimento, a vasculatura marcada pode ser visualizada em um animal intacto em tempo real, fornecendo uma ferramenta poderosa para investigar a dinâmica do desenvolvimento vascular.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar LDL acetilado diI no coração de um girino Xenopus tropicalis para visualizar sua vasculatura.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis. A técnica permite a imagem de vasos sanguíneos logo após a injeção de um corante fluorescente no coração do embrião, facilitando estudos sobre o desenvolvimento cardiovascular in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia cardiovascular
- Angiogênese
- Biologia do desenvolvimento
Contexto
- Xenopus tropicalis é um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados.
- Compreender o desenvolvimento vascular é crucial para insights sobre várias doenças.
- As técnicas de imagem fluorescente melhoram a visualização de estruturas biológicas.
- Este método permite a observação em tempo real das mudanças vasculares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a vasculatura de girinos de Xenopus tropicalis.
- Investigar a regulação da angiogênese.
- Fornecer um método simples e eficaz para estudar o desenvolvimento cardiovascular.
Métodos Utilizados
- Injeção de um corante fluorescente no coração do embrião.
- Uso de um micro carregador e micro pipeta de vidro cônico para entrega precisa do corante.
- Visualização dos vasos sanguíneos sob um microscópio de dissecação.
- Aplicação de manipulações genéticas e farmacológicas para estudar efeitos sobre a vasculatura.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de vasos sanguíneos em embriões intactos.
- Quantificação da complexidade vascular alcançada através da imagem.
- Insights obtidos sobre a dinâmica do desenvolvimento cardiovascular.
- Demonstração da eficácia do método de injeção do corante fluorescente.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para estudar o desenvolvimento vascular.
- A imagem fluorescente é uma ferramenta poderosa para análise em tempo real.
- Esta abordagem pode facilitar pesquisas adicionais em biologia cardiovascular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
