Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária Xenopus tropicalis

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a vasculatura de girinos de Xenopus tropicalis. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia cardiovascular, como a forma como a angiogênese é regulada. A principal vantagem desta técnica é que os vasos sanguíneos em um embrião do tipo poço intacto podem ser visualizados por uma simples injeção de corante fluorescente.

Comece usando um micro carregador para encher uma micropipeta de vidro cônico com aproximadamente cinco microlitros de solução transparente de LDL diI acetilada, tomando cuidado para que nenhuma partícula precipitada seja carregada. Sob um microscópio de dissecação, use um par fino de pinças número 55 para prender a ponta da pipeta para ajustar o volume do complexo carregado e ajuste o sistema de injeção controlado por pressão para ejetar aproximadamente cinco nanolitros de solução por injeção. Em seguida, mergulhe a ponta da pipeta em 0,04% MS-222 em solução salina de Barth modificada 0,1X ou MBS em um molde Sylgard feito sob medida.

Em seguida, transfira o embrião de Xenopus tropicalis para o molde de Sylgard e confirme a sedação completa com falta de resposta à estimulação da barbatana dorsal. Sob o microscópio de dissecação, carregue o lado ventral do embrião para cima no recuo em forma de V do molde em uma posição ligeiramente oblíqua. Encaixe firmemente dois pinos minucianos de 0,1 milímetro em um porta-pinos e use um pino para perfurar a pele sobre o coração, que deve estar pulsando visivelmente.

Insira o pino pelo orifício no espaço entre o coração e a pele sem perfurar o coração e posicione a ponta inserida dentro da região onde será feita a incisão. Em seguida, esfregue o segundo pino contra o pino inserido para fazer uma incisão linear e use os dois pinos juntos para alargar suavemente a incisão, expondo o coração. Para injetar a solução de LDL acetilada DiI, insira a ponta da pipeta de vidro no coração e injete 50 a 60 nanolitros de LDL acetilada DiI em aproximadamente 10 pulsos de ejeção.

Quando toda a solução de corante tiver sido entregue, confirme se o coração ainda está batendo e transfira o embrião para uma nova placa de Petri contendo 0,1X MBS. Após cinco a 10 minutos, o girino deve se recuperar da anestesia e começar a se mover. Depois que um número adequado de embriões tiver sido injetado, examine visualmente os embriões anestesiados corretamente marcados sob um microscópio de fluorescência, descartando quaisquer animais que tenham outros órgãos marcados.

Embriões que foram insuficientemente marcados podem ser injetados novamente. Em seguida, capture imagens dos embriões corretamente marcados. Para uma imagem mais completa dos vasos sanguíneos, fixe os embriões reanestesiados em paraformaldeído a 4% por uma hora em temperatura ambiente protegido da luz para visualização por microscopia confocal.

Se uma quantidade suficiente de LDL diI acetilada for injetada no coração, a veia cardinal posterior, ou PCV, deve ser imediatamente visível sob um microscópio de fluorescência. As veias intersomíticas, ou ISVs, emergem dorsalmente do PCV em uma onda anterior para posterior, começando no estágio 36 e terminando em torno do estágio 40 a 41, tornando-se levemente ramificadas em torno do estágio 43. O PCV e o ISV crescem em um padrão angiogênico estereotipado que está sob rígido controle do desenvolvimento.

Curiosamente, o knockdown da sinalização TIE-2 por morfolinos antisense diminui o comprimento e a complexidade dos ISVs, enquanto a expressão da forma constitutivamente ativa do TIE-2 induz a ramificação excessiva do ISV. Um Índice de Complexidade de Veias pode ser calculado para avaliar a complexidade dos ISVs e caminhos renderizados podem ser gerados para visualizar a arquitetura geral da vasculatura embrionária de Xenopus tropicalis. O protocolo original foi descrito para o uso de Xenopus laevis por Levin e Colics e o adaptamos para Xenopus tropicalis.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora se for executada corretamente. Antes desse procedimento, manipulações genéticas e farmacológicas podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como quais genes e vias de sinalização regulam o desenvolvimento vascular. Usando este procedimento, a vasculatura marcada pode ser visualizada em um animal intacto em tempo real, fornecendo uma ferramenta poderosa para investigar a dinâmica do desenvolvimento vascular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar LDL acetilado diI no coração de um girino Xenopus tropicalis para visualizar sua vasculatura.