Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária
25 de maio de 2017
Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a vasculatura de girinos de Xenopus tropicalis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia cardiovascular, como a regulação da angiogênese. A principal vantagem desta técnica é que os vasos sanguíneos em um embrião intacto do tipo selvagem podem ser visualizados mediante a injeção simples de um corante fluorescente.
Inicie utilizando um microcarregador para encher uma micropipeta de vidro cônica com aproximadamente cinco microlitros de solução clara de LDL diI acetilada, tomando cuidado para que nenhuma partícula precipitada seja carregada. Sob um microscópio estereoscópico, use um par fino de pinças número 55 para cortar a ponta da pipeta, ajustando assim o volume do complexo carregado, e configure o sistema de injeção controlado por pressão para ejetar aproximadamente cinco nanolitros de solução por injeção. Em seguida, submerja a ponta da pipeta em MS-222 a 0,04% em solução salina de Barth modificada 0,1X ou MBS, em um molde de Sylgard personalizado.
Em seguida, transfira o embrião de Xenopus tropicalis para o molde de Sylgard e confirme a sedação completa pela ausência de resposta à estimulação da nadadeira dorsal. Sob o microscópio estereoscópico, posicione o embrião com a face ventral voltada para cima na reentrância em forma de V do molde, em posição ligeiramente oblíqua. Ajuste firmemente dois pinos minutianos de 0,1 milímetro em um suporte para pinos e use um deles para perfurar a pele sobre o coração, que deve estar visivelmente pulsando.
Insira o pino através do orifício no espaço entre o coração e a pele sem perfurar o coração e posicione a ponta inserida na região onde será feita a incisão. Em seguida, esfregue o segundo pino contra o pino inserido para fazer uma incisão linear e use ambos os pinos juntos para alargar suavemente a incisão, expondo o coração. Para injetar a solução de LDL acetilado DiI, insira a ponta da pipeta de vidro no coração e injete de 50 a 60 nanolitros do LDL acetilado DiI em aproximadamente 10 pulsos de ejeção.
Quando toda a solução de corante tiver sido administrada, confirme que o coração ainda está batendo e transfira o embrião para um novo recipiente de Petri contendo MBS 0,1X. Após cinco a 10 minutos, o girino deverá se recuperar da anestesia e começar a se mover. Após um número apropriado de embriões ter sido injetado, examine visualmente os embriões anestesiados corretamente identificados em um microscópio de fluorescência, descartando qualquer animal que apresente outros órgãos marcados.
Embriões que foram insuficientemente marcados podem ser injetados novamente. Em seguida, capture imagens dos embriões corretamente marcados. Para uma visualização mais detalhada dos vasos sanguíneos, fixe os embriões reanestesiados em paraformaldeído 4% por uma hora à temperatura ambiente, protegidos da luz, para visualização por microscopia confocal.
Se uma quantidade suficiente de LDL acetilado diI for injetada no coração, a veia cardinais posterior, ou PCV, deve ficar imediatamente visível sob um microscópio de fluorescência. As veias interssomíticas, ou ISV, emergem dorsalmente da PCV em uma onda de anterior para posterior, começando no estágio 36 e terminando por volta dos estágios 40 a 41, tornando-se levemente ramificadas por volta do estágio 43. A PCV e as ISV crescem em um padrão angiogênico estereotipado que está sob rígido controle do desenvolvimento.
Curiosamente, o silenciamento do sinal TIE-2 por morfolinos antissenso reduz o comprimento e a complexidade das ISV, enquanto a expressão da forma constitutivamente ativa de TIE-2 induz ramificação excessiva das ISV. Um Índice de Complexidade de Veias pode ser calculado para avaliar a complexidade das ISV e caminhos renderizados podem ser gerados para visualizar a arquitetura geral do sistema vascular de embriões de Xenopus tropicalis. O protocolo original foi descrito para o uso de Xenopus laevis por Levin e Colics, e nós o adaptamos para Xenopus tropicalis.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em uma hora se for realizada corretamente. Antes deste procedimento, podem ser realizadas manipulações genéticas e farmacológicas para responder perguntas adicionais, como quais genes e vias de sinalização regulam o desenvolvimento vascular. Utilizando este procedimento, a vasculatura marcada pode ser visualizada em um animal intacto em tempo real, fornecendo uma ferramenta poderosa para investigar a dinâmica do desenvolvimento vascular.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar LDL aceticolado diI no coração de uma girina de Xenopus tropicalis para visualizar sua vasculatura.
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Visão Geral
Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis. A técnica permite a obtenção de imagens dos vasos sanguíneos logo após a injeção de um corante fluorescente no coração do embrião, facilitando estudos sobre o desenvolvimento cardiovascular in vivo.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biologia cardiovascular
- Angiogênese
- Biologia do desenvolvimento
Antecedentes
- Xenopus tropicalis é um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento vertebrado.
- O entendimento do desenvolvimento vascular é fundamental para obter insights sobre diversas doenças.
- As técnicas de imagem fluorescente melhoram a visualização de estruturas biológicas.
- Este método permite a observação em tempo real de alterações vasculares.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a vasculatura de girinos de Xenopus tropicalis.
- Investigar a regulação da angiogênese.
- Fornecer um método simples e eficaz para estudar o desenvolvimento cardiovascular.
Métodos Utilizados
- Injeção de um corante fluorescente no coração do embrião.
- Uso de um microcargador e micropipeta de vidro com ponta afilada para entrega precisa do corante.
- Visualização dos vasos sanguíneos sob microscópio estereoscópico.
- Aplicação de manipulações genéticas e farmacológicas para estudar os efeitos na vasculatura.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de vasos sanguíneos em embriões intactos.
- Quantificação da complexidade vascular obtida por meio de imagens.
- Conhecimentos adquiridos sobre a dinâmica do desenvolvimento cardiovascular.
- Eficiência demonstrada do método de injeção de corante fluorescente.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para o estudo do desenvolvimento vascular.
- A imagem fluorescente é uma ferramenta poderosa para análise em tempo real.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas adicionais na biologia cardiovascular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização direta e a quantificação da complexidade vascular em um modelo vertebrado, apoiando a validação precoce de alvos em vias de angiogênese. Ao fornecer leituras quantitativas da brotação e ramificação dos vasos, ele facilita a redução de riscos mecanicistas de alvos vasculares antes do compromisso com campanhas de identificação de compostos líderes. O sistema Xenopus tropicalis oferece uma plataforma relevante para doenças na avaliação de fenótipos angiogênicos, com confiança preditiva em pesquisas cardiovasculares pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas a reguladores angiogênicos, como a sinalização de TIE-2, por meio da observação direta dos padrões de brotamento vascular.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho rápido, de uma semana, para avaliar o impacto de genes ou vias no desenvolvimento vascular, sem necessidade de modelos geneticamente modificados.
- Valor Preditivo: Resultados quantificáveis, como o Índice de Complexidade Venosa, permitem a avaliação objetiva dos efeitos da modulação de alvos para decisões de triagem de portfólio.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Gera marcação vascular padronizada e reprodutível, compatível com pipelines downstream de imagem e análise.
- Saída Quantitativa: Permite a medição do comprimento da veia interessegmental e da complexidade da ramificação como leituras dependentes da dose para triagem de compostos.
- Escalabilidade: Procedimento simples de injeção de corante e aquisição de imagens permite avaliação de média escala de perturbações farmacológicas ou genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a angiogênese estereotípica em Xenopus tropicalis, oferecendo insights sobre as vias de desenvolvimento vascular humano.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica por meio de mecanismos angiogênicos conservados.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite testes rápidos de moduladores de vias para esclarecer a biologia do alvo antes de investir em estudos com modelos mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores, fornecendo dados de fenótipo vascular que orientam decisões de prosseguir ou interromper programas focados em angiogênese.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao associar perturbações genéticas ou farmacológicas a alterações quantificáveis na arquitetura vascular.
- Triagem: Fornece leituras reprodutíveis baseadas em imagens, adequadas para avaliar os efeitos de compostos no brotamento angiogênico.
- Análises: Oferece métricas quantitativas de complexidade vascular que permitem comparação objetiva entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Aproveita mecanismos conservados de angiogênese para apoiar a continuidade desde modelos embrionários até sistemas vasculares de mamíferos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de fenotipagem vascular aplicável em múltiplos projetos com alvos de angiogênese.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos angiogênicos por meio da visualização direta e quantitativa de redes vasculares.
- Valor Operacional: Padroniza a avaliação vascular por meio de injeção simples de corante e obtenção de imagens reprodutíveis, minimizando a variabilidade entre experimentos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos associados a alvos vasculares, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados de programas cardiovasculares.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de moduladores da angiogênese com base em desfechos fenotípicos quantitativos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas para manipulação de embriões e microinjeção cardíaca.
- Depende de infraestrutura de microscopia de fluorescência para visualização dos vasos e captura de imagens.
- Necessita padronização do estadiamento embrionário e do momento da injeção para uma marcação vascular consistente.
- Envolve considerações de adaptação ao estender os achados a outros sistemas modelo ou contextos com relevância humana.
- As limitações práticas incluem a dependência da acessibilidade embrionária e a necessidade de otimização cuidadosa da concentração do corante para evitar marcação não específica.
