Transplante de Schwann células dentro de conduítes de PVDF-TrFE a ponte rato necrosante tocos de medula espinhal para promover a regeneração do axônio através da abertura

O objetivo geral deste procedimento de intervenção cirúrgica é usar um conduíte preenchido com células de Schwann e matriz injetável para estabelecer uma ponte entre cotos de medula espinhal completamente seccionados para promover a regeneração do axônio através da ponte. Nosso objetivo é preencher um local de lesão na medula espinhal no rato para restaurar a função. A lesão que estamos usando é a criação de uma lacuna completa de transecção.

É somente usando esse tipo de lesão que podemos dizer com segurança que os axônios se regeneraram quando os encontramos no local da lesão. A ponte que estamos usando é um canal de polímero que contém células de Schwann, sendo as células de Schwann tão importantes para a regeneração dos axônios. Mostramos neste vídeo como introduzir essa ponte em uma lacuna de transecção completa.

Os investigadores novos neste método precisarão de prática, pois a transecção completa da medula espinhal e a introdução do conduto podem ser desafiadoras para iniciantes. Antes de iniciar o procedimento, use uma lâmina número 10 para cortar o conduíte em cinco milímetros. Isso também pode ser realizado sob um microscópio de dissecação, se preferir.

Dobre o conduíte suavemente ao longo do lado longitudinal e use uma tesoura Vannas de ponta reta para cortar quatro pequenas incisões com cerca de 0,4 milímetros de comprimento, pelo menos um milímetro das aberturas e cerca de um milímetro de distância. Em seguida, desdobre o conduíte e corte entre as duas incisões ao longo do mesmo lado para criar duas janelas lado a lado, certificando-se de que as janelas possam ser abertas e fechadas corretamente ao longo do lado não cortado. Para realizar a laminectomia T7-T9, após confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em uma rata Fischer fêmea anestesiada de 180 a 200 gramas, localize o ponto de referência para os processos espinhosos T9-T11.

Eles vão parecer uma pequena protuberância triangular através da pele. Usando uma lâmina número 10, faça uma incisão na linha média da pele de quatro a cinco centímetros de T4 a T11, seguida por uma pequena incisão na camada superficial de gordura com uma tesoura curva de ponta romba. Depois de dissecar a gordura, use a lâmina número 10 para localizar os processos espinhosos T7-T9 e use uma pinça romba para manter o músculo em cerca de T4. Faça uma incisão no músculo ao longo de cada lado das vértebras de T6 a T10 o mais próximo possível das vértebras para fazer uma abertura limpa e causar o mínimo de ferimentos ao animal.

Coloque o retrator em torno de T7 a T9. Use a lâmina número 10 para cortar os músculos e ligamentos entre o processo individual de T6 a T10 e use um rongeur para remover qualquer músculo ou ligamento nas lâminas de T7 a T9 o mais lateralmente possível. Quando as lacunas entre os processos transversos de T7 a T9 forem visíveis, use o rongeur para remover o processo espinhoso T9, levantando suavemente o processo espinhoso T8 com uma pinça romba para elevar a lâmina T9 na pequena abertura entre os processos T9 e T10. Em seguida, use o rongeur para remover a lâmina o mais lateralmente possível, começando pela abertura e movendo-se rostralmente em T9. Quando todas as lâminas tiverem sido removidas, confirme se as lacunas entre os processos transversos são visíveis, especialmente em T8, e examine os ossos ao longo de ambos os lados entre T7 e T9 para confirmar que não há fragmentos ósseos salientes para fora e que as raízes dorsais devem se tornar visíveis.

Usando uma tesoura de mola angular, corte as raízes dorsal e ventral acima e abaixo de T8 e adicione solução salina à medula espinhal para ajudar a parar o sangramento. Em seguida, coloque a tesoura de mola angular acima da medula espinhal nos espaços entre os processos transversos em T8 e faça um corte para cortar completamente o tecido nervoso. Coloque um pequeno pedaço de espuma comprimida na lacuna resultante de dois a 2,5 milímetros e adicione imediatamente solução salina à área.

Enquanto espera que os tocos de cordão cortados atinjam a hemostasia, corte os triângulos de absorção em pedaços longos e finos e remova um conduíte do armazenamento de PBS. Coloque alguns triângulos no conduíte para remover o excesso de PBS e confirme se as janelas pré-cortadas estão abertas. Em seguida, remova o meio de um pellet GFP Schwann Cell e ressuspenda as células Schwann em 10 microlitros de DMEM/F-12 frio.

Adicione 10 microlitros de gel injetável frio à suspensão celular e misture bem com pipetagem repetida. Em seguida, coloque a suspensão celular no gelo. Quando os cotos do cordão estiverem prontos, remova a espuma comprimida e, em seguida, use pedaços longos dos triângulos de absorção para remover a solução salina e o sangue da área de laminectomia.

Em seguida, use uma microespátula para levantar suavemente o coto rostral e deslize o conduíte sobre o coto com as janelas voltadas para cima, tomando cuidado para que todo o coto seja inserido e que não haja sangramento excessivo no conduto. Levante suavemente o coto caudal e deslize a outra extremidade do conduíte sobre ele, tomando cuidado para que todo o coto seja inserido e que as janelas fiquem na superfície dorsal. Em seguida, use uma micropipeta equipada com uma ponta de carregamento de western blot para injetar 20 microlitros da mistura de matriz injetável GFP Schwann Cell no conduíte através de uma das janelas pré-cortadas e feche as janelas.

Uma nota de advertência. É muito importante que os cotos de cordão sejam manuseados o mais rápido e com o cuidado possível. Um atraso pode causar inchaço dos cotos, dificultando o deslizamento do conduíte sobre a medula espinhal, criando mais lesões.

Três semanas após o transplante, imagens fluorescentes confocais de seções de tecido espinhal sagital do criostato revelam uma distribuição uniforme das células de Schwann ao longo e dentro do conduto, bem como vasos sanguíneos e axônios mielinizados no centro da ponte. A regeneração do axônio também está intimamente associada à presença de células de Schwann, confirmando a eficácia do uso de uma ponte de células de Schwann dentro de um conduto estruturado para promover a regeneração do axônio ao longo da ponte entre os cotos rostral e caudal. Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em 45 minutos quando executado corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como o rastreamento EndoRay, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, quantos axônios se regeneram na ponte e quantos deles saem da ponte para reentrar na medula espinhal? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transeccionar a medula espinhal, inserir um conduíte e injetar células dentro de uma matriz para criar uma ponte confiável para a regeneração do axônio e outras avaliações de resultados.