Um Método Padronizado para Medição da Superfície de Pulmão Interna via Neumonectomia de Mouse e Implante de Prótese

O objetivo geral deste procedimento é medir com precisão a área da superfície interna de um pulmão de camundongo após pneumonectomia e implante de prótese. Este método ajuda a analisar as funções morfológicas e fisiológicas do pulmão na regeneração pulmonar adulta induzida por força mecânica. A principal vantagem dessa técnica é quantificar com precisão a área de superfície pulmonar interna, o que promete aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade do estado da função pulmonar.

Prepare o mouse para a cirurgia em uma plataforma de intubação com o lado ventral acessível. Em seguida, puxe a língua para fora e inspecione as cordas vocais com um laringoscópio de pequenos animais compatível com cateteres-guia. Em seguida, insira suavemente uma cânula de intubação intravenosa de calibre 20 na traqueia em um ângulo interno.

Em seguida, coloque o mouse em uma posição reclinada lateral direita e conecte a cânula a um ventilador mecânico. Observe o tórax para avaliar a inserção da cânula na traqueia. Defina a pressão inspiratória para 12 centímetros de água e defina a frequência respiratória para 120 respirações por minuto.

Agora, limpe a pele exposta com pelo menos três esfoliações alternadas de Betadine e etanol 70%. Em seguida, comece a cirurgia com uma incisão de toracotomia posterolateral de dois a três centímetros no quinto espaço intercostal. Penetre na musculatura usando uma tesoura de mola Noyes.

Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetro para expor o pulmão esquerdo. Conforme necessário durante a cirurgia, use um cauterizador de alta temperatura para parar o sangramento. Em seguida, levante 1/3 do lobo do pulmão esquerdo do tórax com uma pinça de ponta romba e use um cotonete para retirar todo o pulmão esquerdo.

Agora, identifique a artéria pulmonar e os brônquios do lobo pulmonar esquerdo e ligue firmemente os brônquios e vasos do hilo com uma sutura cirúrgica encharcada. Em seguida, corte o lobo do pulmão esquerdo a três a quatro milímetros da ligadura, tomando cuidado para não cortar a sutura, o que pode resultar em pneumotórax. Em seguida, feche a parede torácica com uma sutura.

Em seguida, costure a camada muscular e a camada de pele sequencialmente, usando cinco a seis suturas interrompidas com lacunas de três a quatro milímetros. Certifique-se de manter a agulha de sutura cirúrgica longe do coração. A punção cardíaca é letal.

Por fim, desinfete a área cirúrgica com iodopovidona. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada térmica de 38 graus Celsius. Continue usando o ventilador até que a respiração espontânea retorne.

Realize a operação descrita anteriormente, mas logo após a remoção do pulmão, prepare-se para inserir a prótese. Usando uma pinça embotada, segure o centro da prótese de silicone elipsóide. Em seguida, enquanto segura a costela com uma pinça para expor a cavidade torácica, insira suavemente a prótese.

Entre em um ângulo de 45 graus entre o plano frontal da prótese e a superfície torácica. Usando uma pinça romba, certifique-se de que a prótese esteja totalmente dentro da cavidade torácica vazia esquerda. Agora, feche o baú e monitore o mouse conforme descrito anteriormente.

Para este procedimento, monte um tubo de insuflação personalizado que consiste em um êmbolo removido de uma pipeta sorológica de 10 mililitros, um tubo flexível de 40 centímetros de comprimento com um adaptador de agulha, uma válvula de controle de vazão e uma agulha de calibre 18. Depois de montada, prenda a pipeta a um aparador com fita adesiva. A distância entre o topo da pipeta e a bancada deve ser de pelo menos 30 centímetros.

Depois de sacrificar o camundongo por injeção anestésica, prenda-o a uma placa esterilizada e abra cuidadosamente o tórax para cortar o esterno e expor os lobos pulmonares. Em seguida, exponha a traqueia. Em seguida, encha o tubo de inflação com 4% PFA recém-feito e remova todas as bolhas do tubo.

Em seguida, insira a agulha na traqueia. Para evitar vazamentos, prenda a traqueia com clipes de vaso. Agora, infle o pulmão com fixador a uma pressão transpulmonar constante de 25 centímetros de água.

Incube os pulmões em temperatura ambiente por duas horas para expansão total. Após a inflação, observe o deslocamento de volume do fixador. Agora, ligue a traqueia e disseque suavemente os pulmões intactos dos tecidos conjuntivos circundantes.

Use uma tesoura e seja muito gentil. Em seguida, incube os pulmões em um tubo cônico de 50 mililitros cheio de 4% de PFA por 12 horas a quatro graus Celsius com agitação suave em um shaker. Em seguida, prossiga com o processamento e a coloração conforme descrito no protocolo de texto.

Para quantificar o MLI, use imagens do agente usado em seções coletadas sob campo claro com aumento de 20x. A partir de três seções pulmonares diferentes, selecione aleatoriamente um total de 15 visualizações não sobrepostas, cada uma com cerca de um milímetro quadrado, e depois ventile-as. Use apenas áreas sem artérias e veias, vias aéreas principais ou ductos alveolares.

Para a análise, desenhe uma grade de 10 por 10 sobre cada área selecionada usando uma ferramenta de régua. As linhas de grade estão, portanto, separadas por cerca de 100 mícrons. Em seguida, para encontrar uma interceptação ao longo da linha como o comprimento entre dois epitélios alveolares adjacentes.

Por exemplo, as setas de duas pontas ilustram os comprimentos. Conte todos esses comprimentos ao longo de cada linha de grade e o MLI é o valor médio dos comprimentos de interceptação. Usando os protocolos descritos, os camundongos tratados com PNX foram comparados com camundongos implantados com próteses.

Os camundongos usados eram machos CD-1 de oito semanas de idade e seus lobos pulmonares esquerdos foram ressecados. A prótese imita o tamanho e a forma do lobo do pulmão esquerdo e foi inserida no tórax após a remoção do lobo do pulmão esquerdo. 14 dias após a cirurgia, um tubo de insuflação personalizado foi usado para determinar o volume interno do pulmão direito remanescente.

O volume médio do pulmão direito nos cinco camundongos tratados com PNX foi de aproximadamente 1,4 mililitros, o que foi significativamente maior, 1,05 mililitros para os cinco camundongos implantados com prótese. Os valores de MLI nos pulmões direitos restantes também foram significativamente maiores. Usando esses parâmetros, a área de superfície pulmonar interna foi calculada e foi significativamente menor nos camundongos implantados com prótese.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como calcular a área da superfície pulmonar interna para o modelo de camundongo de regeneração alveolar induzida por força mecânica.