Um Método Padronizado para Medição da Superfície de Pulmão Interna via Neumonectomia de Mouse e Implante de Prótese

O objetivo geral deste procedimento é medir com precisão a área da superfície interna do pulmão de camundongo após pneumonectomia e implante de prótese. Este método auxilia na análise das funções morfológicas e fisiológicas do pulmão na regeneração pulmonar induzida por forças mecânicas em adultos. A principal vantagem desta técnica é a quantificação precisa da área da superfície interna do pulmão, o que promete aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade do estado da função pulmonar.

Prepare o camundongo para cirurgia em uma plataforma de intubação com o lado ventral acessível. Em seguida, puxe a língua para fora e inspecione as cordas vocais com um laringoscópio para pequenos animais compatível com guias de cateter. Depois, insira suavemente uma cânula de intubação intravenosa de calibre 20 na traqueia em um ângulo interno.

Em seguida, posicione o camundongo em decúbito lateral direito e conecte a cânula a um ventilador mecânico. Observe o tórax para avaliar a inserção da cânula na traqueia. Ajuste a pressão inspiratória para 12 centímetros de água e defina a frequência respiratória como 120 movimentos por minuto.

Agora, limpe a pele exposta com pelo menos três esfregações alternadas de Betadine e etanol 70%. Em seguida, inicie a cirurgia com uma incisão toracotômica posterolateral de dois a três centímetros no quinto espaço intercostal. Penetre a musculatura utilizando tesoura de mola Noyes.

Em seguida, faça uma incisão de 1,5 centímetro para expor o pulmão esquerdo. Conforme necessário durante a cirurgia, utilize um cautério de alta temperatura para estancar o sangramento. Depois, levante 1/3 do lobo pulmonar esquerdo do tórax com pinça de ponta romba e use um cotonete para retirar todo o pulmão esquerdo.

Agora, identifique a artéria pulmonar e os brônquios do lobo pulmonar esquerdo e ligue firmemente os brônquios e vasos no hilo com um fio cirúrgico embebido. Em seguida, resseque o lobo pulmonar esquerdo a três ou quatro milímetros da ligadura, tomando cuidado para não cortar o fio, o que poderia resultar em pneumotórax. A seguir, feche a parede torácica com um ponto de sutura.

Em seguida, feche a camada muscular e a camada da pele sequencialmente, utilizando cinco a seis suturas interrompidas com intervalos de três a quatro milímetros. Certifique-se de manter a agulha de sutura cirúrgica longe do coração. A punção cardíaca é letal.

Por fim, desinfete a área cirúrgica com iodopovidona. Em seguida, posicione o camundongo sobre uma placa térmica de 38 graus Celsius. Continue utilizando o ventilador até que a respiração espontânea retorne.

Realize a operação previamente descrita, mas logo após a remoção do pulmão, prepare-se para inserir a prótese. Usando pinça romba, segure o centro da prótese de silicone com formato elipsoidal. Em seguida, enquanto segura a costela com a pinça para expor a cavidade torácica, insira suavemente a prótese.

Insira em um ângulo de 45 graus entre o plano frontal da prótese e a superfície torácica. Usando uma pinça romba, certifique-se de que a prótese esteja completamente dentro da cavidade torácica esquerda vazia. Agora, feche o tórax e monitore o camundongo conforme descrito anteriormente.

Para este procedimento, monte um tubo de insuflação personalizado composto por um êmbolo retirado de uma pipeta serológica de 10 mililitros, um tubo flexível de 40 centímetros com adaptador para agulha, uma válvula de controle de vazão e uma agulha de calibre 18. Após a montagem, fixe a pipeta à borda de uma bancada com fita adesiva. A distância entre o topo da pipeta e a bancada deve ser de pelo menos 30 centímetros.

Após eutanasiar o camundongo por injeção de anestésico, fixe-o em uma placa esterilizada e abra cuidadosamente o tórax para remover o esterno e expor os lobos pulmonares. Em seguida, exponha a traqueia. Depois, encha o tubo de insuflação com PFA a 4% recém-preparado e remova todas as bolhas do tubo.

Em seguida, insira a agulha na traqueia. Para evitar vazamentos, prenda a traqueia com clipes vasculares. Agora, insufle o pulmão com fixador a uma pressão transpulmonar constante de 25 centímetros de água.

Incube os pulmões à temperatura ambiente por duas horas para obter a expansão completa. Após a insuflação, anote o deslocamento de volume do fixador. Agora, ligue a traqueia e dissecce cuidadosamente os pulmões intactos dos tecidos conjuntivos circundantes.

Use uma tesoura e seja muito cuidadoso. Em seguida, incube os pulmões em um tubo cônico de 50 mililitros contendo PFA a 4% por 12 horas a quatro graus Celsius, com agitação suave em um agitador. Depois, prossiga com o processamento e coloração conforme descrito no protocolo no texto.

Para quantificar o MLI, utilize imagens do agente usado em cortes coletados em campo claro com aumento de 20x. De três cortes pulmonares diferentes, selecione aleatoriamente um total de 15 campos não sobrepostos, cada um com cerca de um milímetro quadrado, e então ventile-os. Utilize apenas áreas sem artérias e veias, vias aéreas principais ou ductos alveolares.

Para a análise, desenhe uma grade de 10 por 10 sobre cada área selecionada utilizando uma ferramenta de régua. Assim, as linhas da grade ficam separadas por cerca de 100 micrômetros. Em seguida, determine um intercepto ao longo da linha como o comprimento entre dois epitélios alveolares adjacentes.

Por exemplo, as setas de duas pontas ilustram os comprimentos. Conte todos esses comprimentos ao longo de cada linha da grade, e o MLI é o valor médio dos comprimentos de interseção. Utilizando os protocolos descritos, camundongos tratados com PNX foram comparados com camundongos com implante protético.

Os camundongos utilizados eram machos CD-1 com oito semanas de idade, e seus lobos pulmonares esquerdos foram ressecados. A prótese imita o tamanho e a forma do lobo pulmonar esquerdo e foi inserida na cavidade torácica após a remoção do lobo pulmonar esquerdo. Quatorze dias após a cirurgia, um tubo de insuflação personalizado foi utilizado para determinar o volume interno do lobo pulmonar direito remanescente.

O volume médio do pulmão direito nos cinco camundongos tratados com PNX foi de aproximadamente 1,4 mililitros, o que foi significativamente maior do que os 1,05 mililitros observados nos cinco camundongos com prótese implantada. Os valores de MLI nos pulmões direitos remanescentes também foram significativamente maiores. Com base nesses parâmetros, calculou-se a área superficial interna do pulmão, que se mostrou significativamente menor nos camundongos com prótese implantada.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como calcular a área da superfície interna do pulmão para o modelo de camundongo de regeneração alveolar induzida por força mecânica.