In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Os efeitos sistêmicos dos tumores primários são agora reconhecidos por desempenhar um papel significativo no processo de disseminação metastática. No entanto, isso geralmente é perdido em ensaios experimentais de metástase. Este modelo visa fornecer aos pesquisadores uma maneira de avaliar esse efeito.

Este protocolo inclui avaliação de metástase espontânea após a remoção cirúrgica de um tumor primário, que é clinicamente relevante. Principalmente, ele também aproveita a imagem de bioluminescência para monitorar o crescimento da metástase pulmonar em tempo real. Essa configuração experimental pode ser estendida para avaliar intervenções farmacológicas ou genéticas para câncer de mama no cenário neoadjuvante, bem como a relevância de vias de sinalização específicas no processo metastático.

Para começar, colha as células aspirando o meio de cultura celular e lave com PBS estéril. Em seguida, incube com dois mililitros de solução de tripsina-EDTA a 0,25% por cerca de dois a três minutos a 37 graus Celsius até que as células se desprendam e, em seguida, lave com oito milímetros de meio completo para extinguir a reação. Depois de aspirar o sobrenadante e lavar as células com PBS, ressuspenda as células em PBS no volume calculado necessário para diluir as células para 6 milhões de células por mililitro.

Em seguida, transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e mantenha no gelo até que esteja pronta para a injeção. Raspe o cabelo do abdômen do camundongo anestesiado usando uma tesoura elétrica e, em seguida, coloque-o em decúbito dorsal. Em seguida, limpe a região abdominal preparada com etanol a 70% e solução de iodopovidona.

Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão na linha média através da pele abdominal ao nível do quarto tecido mamário, expondo, mas não penetrando, através do peritônio subjacente. Em seguida, segure a pele longe do peritônio usando uma pinça e separe a pele do peritônio com cotonetes estéreis embebidos em solução salina, movendo-se lateralmente para expor a almofada de gordura mamária direita e repita no lado esquerdo para expor a almofada de gordura mamária esquerda. Depois de ressuspender a suspensão da célula E0771 usando uma pipeta manual, transfira 100 microlitros para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione um volume igual de solução de matriz de membrana basal e misture bem, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Depois, mantenha o tubo no gelo. Puxe 100 microlitros de suspensão celular em uma seringa de insulina U-100 de calibre 28 de 0,5 mililitro e mantenha no gelo.

Usando uma pinça, levante a pele e agarre e exponha suavemente a almofada de gordura mamária esquerda. Em seguida, injete 50 microlitros de suspensão celular na almofada de gordura mamária e aguarde de três a cinco segundos antes de remover a seringa. Em seguida, solte a pele da pinça, permitindo que ela retorne naturalmente à sua posição normal, e feche a incisão da pele, aplicando grampos na pele.

Para monitorar o crescimento da lesão ortotópica do tumor de mama, meça o comprimento e a largura do tumor primário usando paquímetros três vezes por semana. Após a anestesia, administre 40 microlitros de meloxicam por via subcutânea para controle da dor e, em seguida, coloque o camundongo em decúbito dorsal. Em seguida, remova os grampos cirúrgicos anteriores, se necessário, e limpe o abdômen com etanol a 70% e solução de iodopovidona.

Usando uma tesoura, faça uma pequena incisão na linha média através da pele abdominal ao nível do quarto tecido mamário, expondo, mas não penetrando, através do peritônio subjacente. Em seguida, remova o tumor ortotópico cortando o tecido mamário normal, localizado proximal e distalmente ao tumor usando uma tesoura. Descarte o tecido tumoral em uma bolsa de risco biológico enquanto repete o procedimento com o tumor contralateral.

Em seguida, feche o local da cirurgia usando um a três grampos e transfira o mouse para uma gaiola de recuperação limpa com uma almofada de aquecimento quente embaixo. Injetar nos animais 100 microlitros de solução de D-luciferina usando uma injeção retroorbital, inserindo a agulha no canto medial do olho em um ângulo de 45 graus em relação ao nariz até sentir a resistência óssea, garantindo que a agulha seja colocada dentro do seio venoso retroorbital. Confirme a injeção bem-sucedida pela falta de descarga de qualquer líquido no momento da entrega e aguarde dois minutos antes da obtenção de imagens.

Enquanto espera, transfira os animais para os cones do nariz localizados dentro do gerador de imagens bioluminescentes em decúbito dorsal. Para medir o fluxo de fótons, crie um ROI quadrado para cada animal representado na imagem no menu suspenso da ferramenta ROI clicando no botão ROI quadrado. Reposicione o ROI gerado automaticamente sobre o tórax de cada animal clicando e arrastando com o mouse.

Em seguida, clique no botão medir ROI. Faça uma incisão na linha média abaixo do processo xifóide, cortando a pele, a musculatura e o peritônio para expor a parte inferior da cavidade torácica usando uma tesoura até que o diafragma fique visível. Depois, perfure o diafragma para colapsar os pulmões e, em seguida, corte o diafragma.

Corte a caixa torácica do lado direito e esquerdo e, em seguida, use um hemostático para agarrar o processo xifóide e mover a caixa torácica para fora do caminho, expondo o coração e os pulmões. Em seguida, corte o átrio direito usando uma tesoura. Em seguida, perfunda o animal com 10 mililitros de PBS gelado através do ventrículo esquerdo e avalie a completude da perfusão, confirmando que o fluido que flui do átrio direito fica claro e que o fígado fica com uma cor amarela pálida.

Em seguida, identifique a traqueia e insira uma seringa de agulha de calibre 22 com três mililitros de paraformaldeído a 4%, segurando-a paralela à traqueia. Em seguida, administre a solução em um ritmo lento até que os pulmões estejam totalmente inflados. Continue segurando suavemente a traqueia.

Corte-o com uma tesoura acima da pinça e comece a levantar cuidadosamente o tecido enquanto remove todo o tecido conjuntivo. Em seguida, disseque o coração para longe dos pulmões. Depois, coloque o tecido pulmonar em 4% de paraformaldeído em PBS durante a noite e armazene a quatro graus Celsius para fixação.

Utilizando camundongos C57 black 6, o sinal significativo de bioluminescência de metástase pulmonar é normalmente detectado cerca de duas semanas após a ressecção do tumor primário e pode ser acompanhado ao longo do tempo, embora alguma variação possa ser encontrada dependendo do tipo de repórter de luciferase e da cepa do camundongo. A imagem de bioluminescência ex vivo do tecido pulmonar no endpoint fornece quantificação precisa e sensível da carga metastática pulmonar que pode ser plotada para comparação com outros tratamentos. A contagem de nódulos pulmonares sob o estereoscópio e a análise histológica da hematoxilina e eosina podem ser utilizadas para complementar os estudos de quantificação.

Atrasar ligeiramente a retirada da agulha após a injeção de almofada de gordura mamária permite que a solução da matriz gelifique, o que é fundamental para evitar o vazamento da suspensão celular e o desenvolvimento de tumores extramamários. Agora estamos utilizando essa técnica em combinação com vários modelos genéticos de camundongos knockout e knockin para estudar mais a cascata metastática, particularmente o desenvolvimento do nicho pré-metastático.