Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

O objetivo deste procedimento é quantificar a DPOC, como patologias pulmonares crônicas nos pulmões de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Isso é feito expondo primeiro os ratos à fumaça do cigarro ou ao ar por seis meses. Em seguida, o teste de função pulmonar é realizado nos camundongos usando um ventilador de roedores.

Em seguida, os pulmões são inflados a uma pressão fixa, removidos e fixados em 10% de formalina. Finalmente, um software mais informativo é usado para medir o tamanho do espaço aéreo em seções pulmonares coradas com guelras e matriz extracelular de vias aéreas pequenas, espessura da camada de proteína ou seções pulmonares coradas com tricomas de pedreiro. Em última análise, a medição do aumento do espaço aéreo nos pulmões de camundongos expostos à fumaça de cigarro é realizada de maneira padronizada, imparcial e automatizada.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a medição de interceptação linear média ou o índice destrutivo, é que este protocolo é menos demorado para ser concluído, menos suscetível ao viés do observador e mais eficaz na captura da natureza heterogênea da patologia em camundongos, pois pode analisar a doença em LOBs inteiros e ou ambos os pulmões. Depois de expor os camundongos à fumaça do cigarro e anestesiar de acordo com o protocolo de texto, raspar a pele anterior à traqueia e usar uma solução à base de iodo seguida de etanol para desinfetar a área usando uma tesoura clavada. Faça uma incisão na linha média através da pele e do tecido subcutâneo anterior à traqueia e use uma pinça para separar os músculos tireoidianos de Sterno.

Para expor a traqueia, passe uma sutura de seda de cinco centímetros de comprimento posterior à traqueia, induza uma tesoura traqueal para fazer uma traqueostomia na face anterior da traqueia. Em seguida, insira uma cânula de calibre 18 na traqueostomia. Induza a sutura para prendê-la no lugar através da cânula traqueal.

Conecte o mouse ao tubo Y do adaptador do ventilador mecânico e inicie a ventilação mecânica usando um volume corrente de 10 mililitros por quilograma e uma frequência respiratória de 150 respirações por minuto. Em seguida, infle os pulmões até uma capacidade pulmonar total ou CPT de três vezes por histórico de volume. Para medir a capacidade inspiratória ou ic e reduzir a ectasia dos pulmões, realizar uma oscilação forçada de frequência única, manobrar e avaliar a resistência dinâmica, RRS, elastina ERS e complacência CRS do sistema respiratório.

Em seguida, realize uma frequência de banda larga, oscilação forçada, manobra e meça a resistência das vias aéreas centrais, a resistência do tecido RN, o tecido G, a elastina H e a razão G sobre H. Finalmente, registre a conformidade quase estática CST durante as manobras de fluxo de pressão de volume. Repita cada uma dessas manobras cinco vezes até que leituras consistentes sejam obtidas. Inflar para TL C3 vezes entre cada série repetida.

Registre o valor médio de cada parâmetro para cada mouse. Remova o mouse do ventilador e depois de sacrificá-lo de acordo com o protocolo de texto. Corte o diafragma, abra o tórax na linha média e remova as costelas anteriores para expor os pulmões.

Disseque a pele e o tecido subcutâneo ao redor da traqueia e passe duas suturas de seda de duas polegadas de comprimento posteriores à traqueia. Uma vez que a insuflação pulmonar tenha sido quantificada pela realização de uma lavagem broncoalveolar e o ar tenha sido liberado para fora do conjunto de insuflação pulmonar, conecte o conjunto de insuflação intravenosa à cânula traqueal. Abra a válvula e permita que o PBS flua para os pulmões por gravidade até que os pulmões inflinem totalmente.

Faça um nó com a sutura distal à cânula traqueal. Use uma pinça para levantar a traqueia e corte-a proximal ao nó. Em seguida, disseque o tecido conjuntivo posterior à traqueia e aos pulmões.

Remova cuidadosamente os pulmões e coloque-os em um tubo contendo solução salina a 10%. Fórmula em buffer. Fixe os pulmões em temperatura ambiente durante a noite antes de usar PBS para lavá-los duas vezes.

Incorpore os pulmões em parafina e corte cinco seções grossas de micro corrida. Em seguida, use a coloração branquial para manchar as seções e imaginá-las conforme descrito no protocolo de texto. Para preparar imagens para análise de imagem do Scion, inicie a imagem do Scion e carregue as macros conforme indicado na parte suplementar do protocolo de texto, selecione a macro abrir imagem de campo claro um para selecionar e abrir um arquivo TIFF.

Use ferramentas de edição de imagem para preparar a imagem. Para análise, selecione a cor do pincel clicando em preto ou branco na parte inferior da janela LUT. Em seguida, clique na ferramenta pincel para alterar o tamanho do pincel.

Clique duas vezes na ferramenta pincel e insira um tamanho de pincel apropriado. Use a ferramenta pincel para forçar áreas que não são espaço aéreo ou paredes alveolares a serem tratadas como espaço aéreo ou tecido, pintando brônquios e vasos de preto para que sejam analisados como tecido. Para medir o comprimento médio do cabo do espaço aéreo, selecione o comprimento macro do cabo air two.

Esta etapa converte a imagem em escala de cinza em uma imagem binária com apenas o limite de pixels pretos ou brancos. A imagem binária clicando perto do centro da imagem e arrastando o mouse para cima ou para baixo. Para ajustar o valor limite, clique com o mouse uma segunda vez para aceitar o valor.

Ajuste o limite para tornar as paredes alveolares da mesma espessura das imagens originais. É crucial não ficar abaixo do limiar e, assim, criar quebras nas paredes alveolares que não existem na imagem original, o que produzirá valores de comprimento de cordão artificialmente altos. Observe uma janela que solicita um novo limite da imagem binária e continue ou cancele a macro para o limite.

Novamente, responda por que ao prompt e selecione o botão ok. Observe a janela de grade horizontal e vertical gerada por macro com linhas separadas por cinco pixels. O programa mede os comprimentos das linhas verticais horizontais que se sobrepõem ao espaço aéreo.

Salve o arquivo em qualquer pasta usando o nome padrão. Isso inclui um formato de arquivo anexado com C LA TXT para o comprimento do cabo do espaço aéreo. Isso permitirá que as macros de relatório do Excel encontrem o arquivo.

Para analisar os relatórios, abra o relatório X Excel TWENTYX XLS. Escolha a multimacro CL m para relatar as medições do comprimento do cordão alveolar para várias pastas correspondentes a imagens de vários mouses da janela do arquivo. Selecione uma pasta de cada vez, destacando a pasta e, em seguida, selecionando, ok.

À medida que cada pasta é selecionada, observe sua planilha que mostra estatísticas para cada arquivo txt CL. Seguido por estatísticas para dados de comprimento de cabo combinados de todos os arquivos, abra o arquivo all CL para exibir dados de todas as planilhas. Por fim, renomeie e salve a planilha.

O nome do arquivo padrão é o nome da pasta pai anexada com c xls. Uma seção de um pulmão bem inflado é mostrada aqui. Os macrófagos nos espaços alveolares são pintados de branco e os vasos e brônquios são pintados de preto.

Em seguida, a imagem é convertida em uma imagem binária sujeita a limiar usando a imagem original e, em seguida, invertida de modo que todos os pixels no espaço alveolar sejam pretos e/ou pixels nas áreas do pulmão que não são alvéolos sejam brancos. Nessas figuras são mostrados os comprimentos verticais e horizontais do cordão alveolar que a macro do software gera. Este experimento ilustra que os camundongos C 57 pretos do tipo selvagem expostos à fumaça têm um aumento de 23% no tamanho do espaço aéreo alveolar quando comparados aos camundongos do tipo selvagem expostos ao ar com idade e sexo pareados.

Os testes de função pulmonar mostram deslocamentos modestos à esquerda nas alças de volume de pressão, refletindo uma perda modesta de recuo elástico do pulmão, consistente com o enfisema leve que se desenvolve em camundongos C 37 pretos de seis tipos selvagens expostos à fumaça de cigarro. Os seis meses mostrados aqui são imagens de seções de pulmões manchadas de tricromo maciço de C 57 camundongos pretos de seis tipos selvagens expostos ao ar ou fumaça de cigarro por seis meses, ilustrando aumentos na deposição de proteínas da matriz extracelular em torno de pequenas vias aéreas no cigarro, animais expostos à fumaça ao tentar este procedimento. É importante lembrar de ter cuidado para não cortar os pulmões ao removê-los da caixa torácica dos camundongos após o desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo das doenças pulmonares para explorar vias que contribuem para a patogênese das doenças pulmonares pró-obstrutivas crônicas em camundongos e avaliar a eficácia de novas terapias de nossa DPOC em um sistema modelo pré-clínico.