Soutien métabolique des excisées, les tissus de cerveau vivants lors de l’Acquisition de la microscopie par résonance magnétique

L’objectif global de cette procédure est de fournir des conditions métaboliques favorables aux échantillons de tissus vivants lors de la collecte de données de microscopie par résonance magnétique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’imagerie médicale en révélant les propriétés de contraste MR des cellules vivantes et d’autres composants tissulaires microscopiques. Les avantages de cette technique sont qu’elle garantit un contrôle précis des conditions de perfusat à l’intérieur du scanner IRM et permet un flux continu de perfusat, même pendant l’acquisition d’images.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’assemblage de la sonde de la bobine et du matériel de l’oxygénateur est compliqué et difficile à décrire. Pour préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel, ou perfusat de LCR, pour l’expérimentation, équilibrez le liquide céphalo-rachidien préalablement préparé à la température ambiante tout en gazant avec 95 % de carbogyn par bouillonnement direct pendant au moins une heure. Une fois que l’aCSF atteint la température et la saturation en carbogène souhaitées, assurez-vous que le pH se situe dans la plage physiologique en plaçant une sonde pH-mètre dans le liquide aCSF.

Afin de maintenir la teneur en oxygène dissous et les conditions de pH appropriées pour un métabolisme tissulaire sain, continuez à faire des bulles gazeuses directement dans le réservoir de perfusat pendant l’expérience. Avant de commencer la procédure d’amorçage, assurez-vous que le placement de la ligne de profusion n’interfère pas avec l’assemblage du corps de la sonde ou l’insertion de la sonde dans l’alésage. Pour amorcer les conduites de profusion, immergez le tube d’entrée relié à la micropompe péristaltique dans l’aCSF préparé.

Ensuite, passez l’appareil d’oxygénation et les lignes de profusion à travers l’alésage de l’aimant et l’empilement de bobines dégradées de haut en bas. Mettez les bobines de côté jusqu’à l’assemblage de la sonde. Afin de capter un effluent de LCR, suspendez l’oxygénateur au-dessus d’un bécher.

Sélectionnez et confirmez le débit prévu de deux millilitres par minute. Allumez la pompe pour commencer à remplir les conduites de profusion. Déplacez l’air à l’intérieur avec un LCR en inversant le piège à bulles en ligne vide.

Ensuite, connectez l’orifice gazeux de l’oxygénateur à une deuxième source de carbogène tout en réglant un débit d’un 16e litre par minute. Pour vous assurer que le carbogène s’écoule sur la membrane d’échange gazeux de l’oxygénateur, trempez l’orifice d’échappement sur le dessus de l’oxygénateur dans l’eau. Une fois que le LCR commence à s’égoutter de la chambre de profusion, agitez manuellement les conduites d’entrée pour libérer les bulles de gaz visibles.

Ensuite, immergez l’électrode d’oxygène dans l’aCSF qui s’écoule de la chambre de profusion pour confirmer que l’oxygénateur fonctionne correctement. Après avoir retiré le cerveau de l’affaissement du rat euthanasié, comme décrit dans le protocole textuel, remettez-le en position couchée. Pour isoler l’hippocampe contenant la partie centrale du cerveau, utilisez un rasoir droit pour faire deux incisions le long du plan transversal afin d’enlever tous les tissus dorlotés à la fissure transversale et rostrals à la fimbria.

Ensuite, utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer le plan le plus choyé de la partie centrale au centre d’un bain de coupe Vibratome. Ajoutez de l’aCSF glacé et à bulles de carbogène, puis placez le matériel de rétention en nylon à l’intérieur du bain de coupe Vibratome. Ensuite, coupez des tranches de 300 micromètres d’épaisseur pour obtenir trois à quatre tranches utilisables par hémisphère, ce qui donne un total de six à huit.

Utilisez un scalpel et une micro-pince pour isoler l’hippocampe ou les sections corticales d’un hémisphère, et coupez la tranche afin de l’adapter au puits de tissu de cinq millimètres de diamètre de la micro-bobine. Pour préparer la micro-bobine, utilisez une pipette de transfert pour remplir sa chambre tissulaire avec de l’aCSF oxygéné provenant du bain de coupe du Vibratome. Ensuite, utilisez la pipette de transfert pour placer l’échantillon de cerveau coupé dans le puits tissulaire de la micro-bobine.

Positionnez la région d’intérêt sur la microbobine à l’aide d’un microscope à dissection. Pour maintenir la position de l’échantillon tout au long de l’expérience d’imagerie, insérez le dispositif de rétention des tissus, tel qu’un filet en maille de nylon fixé à une rondelle en nylon. La confirmation visuelle du placement correct de l’échantillon après l’insertion des composants de rétention est essentielle, car ce sera la dernière occasion d’ajuster la position du tissu.

Ensuite, fixez l’ensemble de micro-bobine modifié dans une pince de table et insérez la cheville de support en acétol de l’oxygénateur dans le trou situé sur le dessus de la micro-bobine. Ensuite, placez la chambre de profusion sur le tissu de la micro-bobine et serrez-les ensemble pour sceller le système de profusion. Utilisez des coupe-fils pour couper l’excédent d’attache de câble.

Lorsque l’étanchéité a réussi, le LCR commence à s’écouler par les conduites d’écoulement dans un tube de collecte. Fixez la micro-bobine et l’oxygénateur en haut du corps de la sonde d’imagerie. Enfin, faites glisser la pile de dégradé sur l’ensemble et placez le dégradé sur le dessus de la sonde.

Pour insérer la sonde assemblée dans l’alésage de l’aimant, placez d’abord le corps de la sonde près de l’ouverture de l’alésage du spectromètre au bas de l’aimant. Ensuite, rétractez la longueur excessive des lignes de perfusion à travers l’ouverture de l’alésage en haut de l’aimant. Une fois que tout le mou disponible a été absorbé des lignes de profusion, avancez le corps de la sonde dans l’alésage de l’aimant à la base.

Simultanément, retirez plus de mou des lignes de profusion par le haut de l’alésage. Ensuite, fixez deux vis de fixation dans les fentes correspondantes de la pile de cales à la base de la sonde. Avant de continuer, fixez la conduite d’évacuation dans le réservoir de déchets et vérifiez que les conduites de perfusion n’ont pas été pincées ou pliées lors de l’insertion de la sonde.

Après avoir connecté le corps de la sonde, commencez la collecte d’images. Si l’oxygénateur dans le trou fonctionne correctement, le pourcentage d’oxygène dissous du perfusat de LCR doit correspondre au pourcentage de concentration d’oxygène dans le gaz d’alimentation, comme indiqué ici. Lorsque des mélanges de carbogène avec des concentrations variables d’oxygène ont été utilisés comme gaz d’alimentation, le pourcentage de saturation en oxygène à la vue de la profusion tissulaire approchait 100 % de la concentration d’oxygène dans le mélange utilisé.

Des essais de stabilité du signal de diffusion ont été effectués et comparés entre des tranches superfusionnées, des témoins fixes et non perfusés. Les valeurs normalisées du signal de diffusion dans quatre coupes de cortex soumises à différentes conditions de perfusion restent stables pendant une période de 15,5 heures après l’euthanasie, ainsi que dans le cortex fixé au formaldéhyde comme témoin positif contrairement au cortex non perfusé. Le bon placement des échantillons est essentiel pour la microscopie par résonance magnétique et peut être confirmé visuellement par des balayages pilotes plus rapides et de plus faible résolution.

Dans cette analyse préliminaire, une faible pondération de diffusion entraîne un faible contraste entre la couche cellulaire pyramidale et les tissus adjacents de l’hippocampe. À une pondération de diffusion élevée, le contraste entre la couche cellulaire pyramidale et les tissus adjacents de l’hippocampe augmente, et la couche cellulaire pyramidale devient plus foncée que les tissus adjacents, confirmant que l’échantillon est correctement centré et ne s’est pas déplacé depuis qu’il a été positionné sous la lunette de dissection. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer la superfusion dès que possible pour maximiser la viabilité de la tranche.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’offrir un soutien métabolique aux tissus cérébraux excisés subissant des études de microscopie IRM. Avec des altérations des gaz perfusés et dissous, d’autres types de tissus vivants excisés avec des exigences métaboliques différentes peuvent être étudiés.