Name: Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Descubra como quantificar a informação ambiental codificada pelos níveis de expressão gênica em C. elegans sob restrição alimentar. Este método computacional revela estratégias de codificação neural que ligam dieta à longevidade.

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Agradecemos os laboratórios Bargmann e Horvitz para reagentes. Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos também Lipovsek M. para comentários sobre o manuscrito. Esta pesquisa foi apoiada pelo Wellcome Trust (projeto 087146 Grant para Q.C.), BBSRC (BB/H020500/1 e 1/BB/M00757X de Q.C.), Conselho Europeu de investigação (242666 de NeuroAge de Q.C.), nos institutos nacionais de saúde (R01AG035317 e R01GM088333 para H.L.) e U.S. Fundação Nacional de ciência (0954578 de H.L., 0946809 GRFP para magalhaes).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos um novo método para restrição dietética que encapsula uma muito mais ampla gama de concentrações de comida do que os protocolos publicados anteriormente. Este método vincula dois fenômenos anteriormente separados vistos na literatura DR c. elegans , bacteriana privação e restrição dietética clássica, permitindo que ambos os efeitos dietéticos ser estudaram sob um protocolo. Usando o novo paradigma de DR vasta gama, apresentamos um quadro geral para examinar a expressão de gene única célula em resposta a uma sugestão ambiental específica e determinar como esta célula codifica informações. Nosso quadro é composto por dois protocolos experimentais que ilustram como realizar a expectativa de vida e imagem quantitativa, respectivamente, sob a vasta gama Dr. Data destes protocolos experimentais então podem ser examinada com as análises computacionais fornecidas em Este quadro para quantificar as informações codificadas por mudanças nos níveis de expressão do gene ou expectativa de vida em condições diferentes de alimentos.
Experiências de vida útil, utilizando vasta gama DR paradigma envolvem seis níveis distintos de comida (tabela 1). Isto exige uma abordagem mais trabalhosa do que examinando a longevidade sob menos níveis de alimentos, tais como a privação alimentar10,11 ou usando o fundo genético de comer-2 35. No entanto, examinar a expectativa de vida sob uma única condição pode limitar as interpretações do papel de um gene em DR. Por exemplo, mostramos recentemente que mutantes daf-7 tem uma atenuação de bidirecional da resposta à concentração de alimentos em relação ao tipo selvagem animais12 (figura 1A). Na ausência de comida, mutantes daf-7 exibem um encurtamento de sua vida útil em comparação com animais do tipo selvagem. Se nós só tinha considerado privação dietética, interpretaria a que o gene daf-7 como sendo necessário para a extensão de vida útil apenas, , quando na verdade o papel de daf-7 é mais complexa. Portanto, o resultado crítico desta parte do protocolo é estabelecer se um gene de interesse é envolvido em modulando a resposta global às mudanças de expectativa de vida em abundância de comida.
Uma das principais vantagens do presente protocolo em relação a outros métodos é que ele usa um novo método para eliminar a produção de descendência em animais submetidos à análise de expectativa de vida. A maioria dos estudos usa a droga FuDR para inibir a proliferação do germline em adultos, tornando-os estéreis. No entanto, estudos recentes têm mostrado FuDR tratamento pode ter efeitos de condição e gene-específico na expectativa de vida17,18,19,20,21, comparecendo questione sua aplicabilidade geral. Neste protocolo, a eliminação da produção de descendência é conseguida através de um 24h fertilizados de tratamento dos animais com RNAi como alvo o gene 5-ovo , que inibe a formação da casca da ovo de quitina de oócitos de c. elegans , resultando em sua morte de22,23. A vantagem deste método é que é muito tarde-agir e por isso não interfere com da linha germinal, que é um grande regulador da longevidade em c. elegans.
Uma ressalva potencial do protocolo DR vasta gama é sua dependência do uso de antibióticos para controlar a proliferação bacteriana para garantir um controlo apertado da concentração bacteriana. Proliferação bacteriana dentro do intestino do verme é conhecida por ser das principais causas de morte em c. elegans16. Assim, o uso de antibióticos bacteriostáticos, como a carbenicilina, em ágar NGM impede a proliferação bacteriana e aumenta a vida útil de vermes em comparação com controles não-antibiótico16. Certos tipos de antibióticos, como a rifampicina36 e membros da tetraciclina família37,38, foram mostrados para estender a vida útil em c. elegans , independentemente do seu efeito sobre bactérias proliferação. No entanto, não há nenhuma evidência na literatura que a carbenicilina ou estreptomicina pode aumentar longevidade, independentemente do seu efeito sobre a proliferação bacteriana.
Expectativa de vida pode ser vista como o resultado de um cálculo complexo onde a informação ambiental, encaminhada pela expressão gênica em redes neuronais, é transmitida à fisiologia. Nosso protocolo fornece uma metodologia para entender como específicos genes afetam o fluxo de informações ambientais. Para resolver esta questão, precisamos confiável para determinar a distribuição das respostas de expressão do gene no nível de célula única de processamento de imagem. Ser capaz de estimar não só as médias das respostas da expressão do gene para mudanças em abundância de comida, mas também a distribuição estatística completa de grandes populações representa um importante requisito para a aplicabilidade do nosso método. Esta descrição precisa de respostas de expressão de gene a abundância de alimentos permite a aplicação da teoria da informação quantificar a informação codificada pelos neurônios específicos, bem como a estratégia de codificação utilizada pelo circuito neural.
Aspectos de imagem e computacionais dos métodos indicados no presente protocolo são aplicáveis a um conjunto maior de contextos biológicos. No nosso trabalho, focamos em uma pequena rede neural envolvida na comida detecção, no entanto, as análises das características de processamento de informações não estão limitadas a um tipo específico de célula ou pistas ambientais específicas. No futuro, essas metodologias potencialmente podem ser estendidas a uma variedade maior de variáveis de entrada, afetando qualquer saída fisiológica. Essas abordagens contribuirá para uma maior compreensão de como as redes reguladoras do gene codifica, processo e transmitir informações.

Todos os organismos precisam ser capazes de perceber e responder às mudanças no ambiente para garantir sua sobrevivência. Em animais, o sistema nervoso é o principal detector e transdutor de informação sobre o ambiente e coordena a resposta fisiológica a qualquer mudança que pode afetar sobrevivência1 do organismo. Abundância de comida é uma sinalização ambiental que está bem estudada em vários contextos que não só regula comportamentos relacionados com os alimentos, tais como forrageamento2, mas também os impactos a longevidade de um animal. A modulação da expectativa de vida por mudanças na abundância de comida é um fenômeno conhecido como restrição dietética (DR) e tem ampla conservação evolutiva3.
O nemátodo Caenorhabditis elegans é um sistema poderoso modelo para abordar questões biológicas fundamentais. Foram desenvolvidas uma infinidade de técnicas que permitem a manipulação do genoma do verme, como gene RNAi e na vivo , técnicas de edição. O pequeno tamanho físico do worm e sua transparência óptica também se prestam a na vivo de imagem de ambos os repórteres fluorescentes transcriptional e translacionais e utilitário de tecnologias de alta produtividade como microfluídica4. Juntas, essas ferramentas podem ser aproveitadas para examinar o comportamento animal direto como neural de circuitos.
C. elegans é um bacterivore e foram publicados vários métodos que permitem o controle preciso da abundância de alimentos através da manipulação de concentração bacteriana5,6,7,8 . Dentro da comunidade de pesquisa de c. elegans , DR tem sido estudado em dois contextos diferentes. O primeiro pode ser denominado 'DR clássica', como reflete as alterações observadas em resposta à diminuição dos teores de alimentos em outros organismos. Neste contexto, diminuindo a abundância de alimento de ad libitum níveis resulta em uma crescente expectativa de vida até uma ótima é alcançada, depois deste ponto longevidade diminui com a redução de alimentos6,7, 9. O segundo contexto em que o DR tem sido estudada em c. elegans é privação dietética em que a longevidade dos vermes é aumentada pela remoção completa de qualquer fonte de alimento bacteriana10,11. Em Entchev et al. (2015)12, mostramos que a complexidade em DR resultantes destes dois paradigmas diferentes pode ser examinada simultaneamente sob um contexto chamamos 'vasta gama DR'. Usando o protocolo descrito abaixo, identificamos uma nova classe de genes envolvidos no DR que bidirecionalmente modulam a resposta de expectativa de vida de abundância de alimento e estão envolvido em circuitos neurais que detetam alimentos12 (Figura 1).
A resposta de um animal para mudanças no ambiente integra uma sequência de processos biológicos que ligam o sistema sensorial para interações complexas regulamentares, transmissão de informações ambientais para a fisiologia. Embora os detalhes mecanicistas do tal "fluxo de informações" estão, frequentemente, desconhecidos, ferramentas genéticas podem ser usadas para adquirir uma visão sobre como esse cálculo complexo é organizado entre diferentes componentes biológicos. Em nosso recente trabalho, mostramos que a daf-7 e tph-1 estão envolvidos na transmissão de informações ambientais sobre a abundância de alimentos através de um circuito neural que modula a expectativa de vida em c. elegans12 sensor de comida , 13. aplicando a estrutura matemática da teoria da informação14, fomos capazes de quantificar a quantidade de informação ambiental, em termos de bits, que é representada pelas alterações de expressão de gene em daf-7 e tph-1 em neurônios específicos em níveis diferentes de comida. A partir disso, então fomos capazes de descobrir a codificação estratégia utilizada por este circuito neural e como é geneticamente controlada (Figura 2).
No protocolo a seguir, descrevem as etapas necessárias para compreender quais são os efeitos de genes de interesse expressado em neurônios específicos e como eles participam para o fluxo de informação sobre os alimentos do ambiente a expectativa de vida. Em termos gerais, nossa estrutura é dividida em dois protocolos experimentais e um fluxo de trabalho computacional. Para os aspectos experimentais, é essencial dispor de mutantes dos genes de interesse que podem ser examinadas sob vasta gama repórteres transcriptional Faithful Dr. também são necessários para quantificar o nível de expressão dos genes em níveis diferentes de alimentos. Para ser capaz de efectuar a análise computacional, discutida em nosso método, o conjunto de dados precisa ser de tamanho suficiente para fornecer estimativas significativas das distribuições de expressão. Mesmo que nós fornecemos códigos de fonte de modelo para as análises, o usuário precisa estar familiarizado com a linguagem da teoria da informação que é usada extensivamente em toda a nossa estrutura computacional. Os códigos-fonte são escritos em R e C++. Portanto, um certo nível de proficiência de programação também é necessário para aplicá-las de uma forma significativa.

<table><tbody><tr><td>Sal de carbenicilina dissódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>Sal de sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501-50G</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>&nbsp; Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Indutor Sigma-Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td>para placas de RNAi</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380-1KG-M</td><td>Usado em S basal e NGM ágar</td></tr><tr><td>hidrogenofosfato dipotássico (K2HPO 4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05104.1000</td><td>Usado em S basal, e ágar NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de di-hidrogênio de potássio (KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-1KG</td><td>Usado em S basal, e ágar NGM</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-1KG</td><td>Usado em ágar</td></tr> <tr><td>NGMCloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td>Usado em ágar NGM</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687-500G</td><td>Usado para branqueamento</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td>Usado em imagens</td></tr><tr><td>de hipoclorito de sódio (NaClO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05614.2500</td><td>Usado para branqueamento</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Invitrogen</td><td>12780052</td><td>Usado para cultivar bactérias</td></tr><tr><td>Adavanced TC 6 cm Placas de cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628960</td><td>Placas para vida útil</td></tr><tr><td>CellStar 10cm Placas</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>Placas para imagens</td></tr><tr><td>Pontas P200 de baixa retenção</td><td>Brandt</td><td>732832</td><td>Dicas para o manuseamento de vermes em</td></tr><tr><td>ágar</td> líquido <td>BD</td><td>214510</td><td>Ágar para placas NGM, RNAi e NSC</td></tr><tr><td>Bacto-peptona</td><td>BD</td><td>211820</td><td>Peptona para placas NGM, RNAi e NSC</td></tr></tbody></table>

quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em c. elegans.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Os sistemas sensoriais permitem animais detectar, processar e responder ao seu ambiente. Abundância de comida é uma sinalização ambiental que tem profundos efeitos no comportamento e fisiologia animal. Recentemente, nós mostramos que modulação de longevidade no nematódeo Caenorhabditis elegans , pela abundância de comida é mais complexa do que anteriormente reconhecido. A capacidade de resposta de recuperação às alterações no nível de comida é determinada por genes específicos que agem controlando informações de processamento dentro de um circuito neural. Nosso quadro combina análise genética, elevado-throughput imagem quantitativa e teoria da informação. Aqui, descrevemos como essas técnicas podem ser usadas para caracterizar qualquer gene que tem uma relevância fisiológica a vasta gama de restrição dietética. Especificamente, este fluxo de trabalho destina-se a revelar como um gene de interesse regula a expectativa de vida sob a vasta gama de restrição dietética; em seguida, estabelecer como a expressão do gene varia com o nível de alimentos; e finalmente fornecer uma quantificação imparcial a quantidade de informação veiculada pela expressão do gene sobre a abundância de comida no ambiente. Quando vários genes são examinados simultaneamente sob o contexto de um circuito neural, este fluxo de trabalho pode revelar a estratégia de codificação utilizada pelo circuito.

Realizando experiências de vida útil sobre os mutantes dos genes de interesse ao lado o tipo selvagem N2 tensão, pode-se estabelecer se estes genes têm um papel na resposta de comida ao DR vasta gama. A resposta de tipo selvagem deve ser comparável ao representado na Figura 1A. Qualquer modulação da resposta pelos mutantes, refletido por um efeito de não-uniforme através de condições de alimentação, indica que estes genes afetam a capacidade do worm para responder correctamente às mudanças em abundância de comida, no qual ponto outras investigações do respostas de expressão destes genes a vasta gama DR é garantido. Se, no entanto, a resposta de longevidade dos mutantes não é significativamente diferente do tipo selvagem, então os genes não tem nenhum papel no transducing os efeitos da vasta gama DR, pelo menos ao nível da esperança média de vida. Se as mutações causam uma mudança uniforme da expectativa de vida de toda resposta então os genes têm um efeito independente de comida sobre a longevidade. Isto não exclui a possibilidade de que a expressão dos genes de interesse é comida-responsivo, em cujo caso as informações transportadas por estes genes não é transmitido a expectativa de vida.
A próxima etapa do protocolo é determinar como os níveis de expressão mudam sob DR vasta gama para os genes de interesse. Na Figura 1B, podemos ilustrar isso através dos níveis de expressão de um repórter transcriptional do daf-7, que mostra uma resposta às mudanças no nível de comida nos neurônios sensoriais ASI. Em um mutante de daf-7(-) , a resposta da expressão do transcriptional repórter é alterada. Se os genes de interesse são verdadeiramente comida-responsivo ao nível de expectativa de vida em seguida pode-se esperar que sua expressão também vai mudar com a comida. Correspondentemente, um repórter transcriptional no fundo mutante deve ter um perfil de expressão alterada em resposta a vasta gama de DR. No entanto, também é possível que o repórter transcricional do gene de interesse em um plano de tipo selvagem não mostra qualquer alimento-sensível a mudanças na expressão. Nessa situação, isso pode indicar um efeito regulatório pós-transcricional que cai fora do âmbito do presente protocolo.
Em Diana et al. (2017)13, extraímos a expressão valores para daf-7 na ASI e tph-1 no ADF e NSM. Na Figura 2,podemos ilustrar a estimativa da distribuição expressão da ASI e ADF para um nível dado alimento. Múltiplas leituras de imagens de worm única permite-nos analisar não só a quantidade de informação codificada de forma independente por cada neurônio, mas também a informação combinatória do circuito inteiro neural (Figura 2B-2C). Combinar estas duas medidas de informação teórica nos permite caracterizar o sistema em termos de estratégia de codificação utilizada pelos neurônios para transmitir informações sobre comida. A quantidade de redundância no circuito pode ser obtida levando a soma da informação mútua para cada neurônio e subtraindo a informação mútua conjunta (capacidade de canal) obtida, considerando as leituras combinatórias do circuito. Um valor positivo de tal diferença denota um caráter redundante da estratégia de codificação, porque a informação cumulativa entre as partes é maior do que a real informação codificada pelo circuito inteiro. Inversamente, um valor negativo reflete uma estratégia sinérgica porque a verdadeira informação codificada é maior do que a soma de seus componentes (Figura 2B). Informações e redundância podem ser comparados entre diferentes genótipos para explorar possíveis funções de ordem superiores da regulação genética, por exemplo, Diana et al (2017) 13 o efeito da mutação daf-7 muda a estratégia de codificação de redundante para sinérgica (Figura 2C-2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg"> 
Figura 1 : Resposta da expressão de gene e vida útil sob vasta gama Dr. (A) a média expectativa de vida do tipo selvagem N2 estirpe (linha preta) exibe uma resposta complexa à vasta gama DR. A magnitude da resposta é atenuada em um mutante nulo do gene daf-7 (linha vermelha). Barras de erro representam o erro padrão da média, dados em pool de Entchev et al (2015) 12. níveis de expressão (B), a média de um repórter transcriptional gene daf-7 no fundo tipo selvagem (linha preta) também exibir uma resposta não-monotônicas complexa a vasta gama DR. No fundo genético de daf-7(-) a expressão deste repórter transcriptional é altamente atenuada e mostra pouca resposta às mudanças no nível de comida. Barras de erro representam o erro padrão da média, dados de um único julgamento em Entchev et al (2015) 12. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg"> 
Figura 2 : Metodologia computacional. (A) ilustração da estimativa de densidade bidimensional de tph-1 expressão de ADF e daf-7 em ASI como obtido o pacote 'ks' R usando uma grade dimensão 30 x 30. (B) visualização da informação codificada pela expressão conjunta de tph-1 e 7-daf (inteira) e individualmente (soma das partes) para ADF, ASI e NSM neurônios. Redundantes e sinérgicos caracteres da codificação são representados pela diferença entre a altura das barras empilhadas sobre o direito e a informação codificada pelo circuito completo. (C) comparação entre codificada pelo tipo selvagem animais e o mutantes daf-7(-) informação sobre os alimentos. (D) a redução de informação mútua observada nos mutantes é acompanhada por um interruptor para codificação sinérgica. Os painéis B-D são adaptados de Diana et al . (2017) 13. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Concentração bacteriana (células/ml)</td>
			<td>Densidade óptica (600nm)</td>
			<td>Factor de diluição (do anterior)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.12E + 10</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 08</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E + 07</td>
			<td>0,316</td>
			<td>10,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E + 07</td>
			<td>0,100</td>
			<td>3.16.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S basal)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>AT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: níveis de alimento e fatores de diluição utilizados na vasta gama Dr. Bactériasconcentrações de l (células/mL) usadas no protocolo DR vasta gama, junto com suas respectivas medições de600 OD e o factor de diluição necessária para alcançar cada concentração da anterior.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">Temperatura experimental de expectativa de vida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dia</td>
			<td>12,5 ° C</td>
			<td>15° C</td>
			<td>17,5 ° C</td>
			<td>20° C</td>
			<td>22,5 ° C</td>
			<td>25° C</td>
			<td>27,5 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">Bolão de todas as estirpes para placas NGM frescas e manter a 20° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">P0 geração de cepas daf-7(-) e manterão a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">Configurar a geração de P0 de estirpes de tipo selvagem e manter a 20° C (1 L4 por placa, 5 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">Configurar a geração F1 de cepas daf-7(-) e manter a 20° C (1 L4 por placa, 90 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">Geração F1 de estirpes de tipo selvagem e manterão a 20° C (1 L4 por placa, 30 placas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">Escolher as larvas L4 F2 para &gt; RNAi ovo-5 placas e manter a 20° C (15 L4 por placa, 24 chapas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">Passo 1 - velhos dias adultos para placas NSC semearam com 2.0 e + 9 células/ml em nível alimentar e mantêm a 20 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">Passo 2 - velhos dias adultos para placas NSC semearam com condições experimentais de comida e a temperatura experimental</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>Transferência</td>
			<td>Transferência</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>Transferência</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: cronograma para lifespans conduzida em temperaturas diferentes. Esboço esquemático das etapas necessárias para configurar vasta gama DR vida útil experimentos em temperaturas diferentes usando cepas daf-7(-) e tipo selvagem como exemplos. O número de transferências para pratos frescos de cada nível de comida experimental diminui com o aumento da temperatura. Esta é a conta para o fato de que os animais a temperaturas mais elevadas estão envelhecendo mais rapidamente e então um mais propensas a danos físicos por transferência.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dias</td>
			<td>Ima</td></tr></tbody></table>Ging Pipeline
		
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>Cepas de repórter pedaço no fundo daf(-). Manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>Cepas de repórter pedaço no fundo do tipo selvagem. Manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>Configure o P0 geração de cepas de repórter de daf-7(-). Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>Configure a geração de P0 de estirpes de tipo selvagem repórter. Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Usar 2 placas e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>Configure a geração F1 de cepas de repórter de daf-7(-). Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. 12 placas de usar e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>Configure a geração F1 de estirpes de tipo selvagem repórter. Use 3 larvas L4 por placa de 10cm NGM. Use 4 placas e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>Alvejante daf-7(-) cepas de repórter na tarde (~ 5 pm) e depositar os ovos em 3 placas de 10cm NGM e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>Lixívia selvagem tipo repórter cepas manhã (~ 10 m) e o depósito de ovos em 3 a 10 cm placas NGM e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>Lave L4 para placas de RNAi de ovo-5 de 10 cm. Use 3 placas por estirpe e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lave 1 dia adultos para placas NSC semeados com 2.0 e + 9 células / ml. usar 3 placas por estirpe e manter a 20 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Lavagem dia 2 adultos para placas NSC semearam com níveis de comida experimental. Use 3 placas por estirpe e shift para temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>Transfira para pratos frescos de NSC. Use 3 placas por estirpe e manter a temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Transfira para pratos frescos de NSC. Use 3 placas por estirpe e manter a temperatura experimental.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>Escolher animais pratos e prepare-se para a imagem latente.</td>
		</tr>
	

Tabela 3: programação para gasoduto de imagem. Esboço esquemático das etapas necessárias para configurar o DR vasta gama de experimentos utilizando cepas de repórter transcriptional fluorescente em fundos daf-7(-) e tipo selvagem em temperaturas diferentes como exemplos de imagens.

Aqui, apresentamos um quadro para relacionar a restrição dietética de vasta gama de expectativa de vida e expressão gênica. Descrevemos os protocolos para a vasta gama de restrição dietética e para a imagem latente quantitativa da expressão do gene sob esse paradigma. Nós esboçamos mais análises computacionais para revelar subjacentes recursos de processamento de informações dos circuitos genéticos envolveram na detecção comida.

Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

O objetivo geral dessa estrutura é identificar genes envolvidos na restrição alimentar de ampla gama, quantificar as informações ambientais codificadas por seus níveis de expressão e entender a estratégia de codificação subjacente que liga o ambiente à expectativa de vida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia do envelhecimento, como quais genes transmitem informações do ambiente para modular a expectativa de vida. Embora essa estrutura possa fornecer informações sobre o sistema sensorial C Elegan, ela também pode ser aplicada de forma mais geral a qualquer sistema biológico cujos componentes cooperem para processar informações ambientais.A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica as informações ambientais codificadas por grupos de neurônios e determina a estratégia de codificação empregada pelos neuroselquites para transmitir essas informações aos alvos a jusante. Depois de cultivar OP50 em placas MGM de acordo com o protocolo de texto, prepare 500 mililitros de meio LB em cada um dos frascos erlenmeyer de dois litros e autoclave-os. Inocular cada frasco com uma única colónia de OP50 e cultivar as culturas a 37 graus Celsius e 200 RPM durante cerca de 14 horas.Em seguida, suplemente as culturas com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Em seguida, agite os frascos por mais 30 minutos a 37 graus Celsius, antes de colocá-los no gelo por 15 minutos. Transfira 450 mililitros de cada cultura para frascos de centrífuga estéreis separados de 500 mililitros, retenha a cultura restante no gelo, pois ela será usada para determinar a concentração da bactéria.Gire as garrafas a 4500 x G e quatro graus Celsius por 25 minutos, depois descarte o sobrenadante e guarde as garrafas no gelo. Com 900 microlitros de LB estéril, diluir 100 microlitros de sobras de cultura de cada frasco. Utilizar um mililitro de LB estéril para zerar o espectrofotómetro e, em seguida, determinar o OD600 da diluição de 10 vezes de cada cultura.Se, por exemplo, o OD600 da diluição de 10 vezes da cultura noturna for 0,28, então a cultura teve um OD600 real de 2,8. A partir deste exemplo, para chegar a uma solução de estoque de trabalho de 1,12 x 10 elevado a 10 células OP50 por mililitro, o que equivale a um OD600 de 56, ressuspenda o pellet da cultura de 450 mililitros em um 20º do volume original ou 22,5 mililitros de solução basal estéril de S ou SB, suplementada com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Efectuar todas as concentrações subsequentes utilizadas nas experiências em SB e estreptococos, a partir de diluições em série do material de trabalho, utilizando os factores de diluição enumerados no presente quadro.Depois de cultivar e sincronizar as cepas repórter da C Elegans de acordo com o protocolo de texto, use 15 mililitros de SB para lavar em série os vermes das três placas e coletar o líquido em um tubo estéril de 15 mililitros. Permita que as larvas L4 sedimentem naturalmente e, em seguida, aspire tudo, exceto cerca de 0,5 mililitros do líquido. Nas linhagens repórter do tipo selvagem, este tipo remove quaisquer larvas mais jovens do que L4.In fundos mutantes, esta etapa auxilia na remoção de quaisquer larvas presas, como a nossa, no caso de mortes de um OK3125.Em seguida, use nove mililitros de SB para ressuspender os vermes. Novamente, monitore a taxa de sedimentação das larvas L4 e, em seguida, aspire todos, exceto aproximadamente 0,5 mililitros do sobrenadante, uma vez que a maioria das larvas L4 tenha peletizado antes de repetir o processo. Adicione 10 microlitros de meio basal S estéril, suplementado com 0,1% de F127 plurônico ao líquido que contém as larvas L4.Isso atua como um surfactante e evita que as larvas grudem na superfície interna das pontas plásticas da pipeta. Usando uma ponta de pipeta de baixa retenção P200, ressuspenda suavemente as larvas e, em seguida, alíquota de 150 microlitros em três placas de RNAi de 10 centímetros que são semeadas com 5 x 225 microlitros de cinco bactérias de RNAi de ovo. Certifique-se de que os vermes estejam igualmente distribuídos em todos os cinco gramados de bactérias.Uma vez que o líquido tenha sido absorvido pelo ágar, remova todas as larvas não L4 das placas que não foram eliminadas pelo procedimento de lavagem, retirando-as manualmente. Em seguida, armazene as placas a 20 graus Celsius por 24 horas. Para iniciar a DR de ampla gama, retire todas as larvas jovens que escaparam da etapa anterior de remoção manual, deixando apenas os adultos de um dia nas placas.Para cada cepa, use 15 mililitros de estreptococos SB estéreis, para lavar os adultos de um dia das três placas, em um tubo de 15 mililitros. Permita que os vermes sedimentem naturalmente e, em seguida, aspire todos, exceto 0,5 mililitros do sobrenadante. Ressuspenda os vermes com 9,5 mililitros de estreptococos SB e repita as etapas de sedimentação e lavagem.Após a lavagem final e aspiração de todos, exceto 0,5 mililitros do sobrenadante, adicione 10 microlitros de SB Plu e use uma ponta de pipeta P200 para ressuspender suavemente as larvas. Alíquota de 100 microlitros das larvas em uma placa NSC, semeada com 5 x 225 microlitros de bactérias, a uma concentração de 2 x 10 para a nona célula por mililitro. Distribua os 100 microlitros uniformemente em todos os cinco gramados de bactérias.Ao microscópio, estime o número de animais presentes na placa, visando entre 100 e 150 vermes por placa. Determine o volume de líquido necessário para atingir uma densidade de vermes dentro dessa faixa e, em seguida, aliquota-o em duas placas adicionais. Ajuste o número de vermes na primeira placa para também cair nesse intervalo.Em seguida, armazene as placas a 20 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, colete os dois dias de idade e distribua os vermes para novas placas NSC semeadas com o desejo de concentração experimental de alimentos. Assim que o líquido for absorvido pelo ágar, mude as placas para a temperatura experimental desejada por 24 horas.No dia seguinte, coletar os adultos de três dias e distribuí-los em placas NSC frescas, semeadas com a mesma concentração experimental de alimento. Uma vez que o líquido é absorvido pelo ágar, retorne as placas à temperatura experimental por 48 horas. Por fim, use um dispositivo microfluídico para obter imagens dos animais antes de montar e quantificar os dados de acordo com o protocolo de texto.Como mostrado aqui, a vida útil média da cepa n2 do tipo selvagem exibe uma resposta complexa à ampla faixa de DR. A magnitude dessa resposta é atenuada em um mutante do gene daf-7, sugerindo que esse gene afeta a capacidade do verme de responder corretamente às mudanças na abundância de alimentos. Os níveis médios de expressão de um repórter transcricional para o gene daf-7 e o fundo do tipo selvagem também exibem uma resposta complexa não monotônica a uma ampla gama DR.In o daf-7 (fundo genético, a expressão deste repórter transcricional é altamente atenuada e mostra pouca resposta a mudanças no nível de alimentos. Esta figura ilustra a estimativa da distribuição conjunta da expressão de TPH1 em neurônios ADF e expressão de daf-7 em neurônios ASI para um determinado nível alimentar.Esses gráficos de barras apresentam as informações alimentares codificadas, combinatória ou individualmente, pelos neurônios ADF, ASI e NSM, com base nos níveis de expressão gênica de TPH1 e daf-7. Caracteres redundantes e sinérgicos da codificação, resulta da comparação entre informações combinatórias e individuais codificadas por neurônios representadas pela diferença de altura das barras empilhadas à direita e as informações codificadas pelo circuito completo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a replicação da teoria da informação para quantificar a estratégia de codificação requer uma estimativa precisa das distribuições de expressão gênica.Por esse motivo, o tamanho da amostra é um fator crítico para a aplicabilidade geral dessa estrutura. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de restrição alimentar de ampla gama para identificar e caracterizar novos genes que ligam a abundância de alimentos à expectativa de vida.

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