Quantificação da informação codificada pelos níveis de expressão gênica durante modulação do tempo de vida sob ampla restrição alimentar em C. elegans.

O objetivo geral dessa estrutura é identificar genes envolvidos na restrição alimentar de ampla gama, quantificar as informações ambientais codificadas por seus níveis de expressão e entender a estratégia de codificação subjacente que liga o ambiente à expectativa de vida. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia do envelhecimento, como quais genes transmitem informações do ambiente para modular a expectativa de vida. Embora essa estrutura possa fornecer informações sobre o sistema sensorial C Elegan, ela também pode ser aplicada de forma mais geral a qualquer sistema biológico cujos componentes cooperem para processar informações ambientais.

A principal vantagem dessa técnica é que ela quantifica as informações ambientais codificadas por grupos de neurônios e determina a estratégia de codificação empregada pelos neuroselquites para transmitir essas informações aos alvos a jusante. Depois de cultivar OP50 em placas MGM de acordo com o protocolo de texto, prepare 500 mililitros de meio LB em cada um dos frascos erlenmeyer de dois litros e autoclave-os. Inocular cada frasco com uma única colónia de OP50 e cultivar as culturas a 37 graus Celsius e 200 RPM durante cerca de 14 horas.

Em seguida, suplemente as culturas com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Em seguida, agite os frascos por mais 30 minutos a 37 graus Celsius, antes de colocá-los no gelo por 15 minutos. Transfira 450 mililitros de cada cultura para frascos de centrífuga estéreis separados de 500 mililitros, retenha a cultura restante no gelo, pois ela será usada para determinar a concentração da bactéria.

Gire as garrafas a 4500 x G e quatro graus Celsius por 25 minutos, depois descarte o sobrenadante e guarde as garrafas no gelo. Com 900 microlitros de LB estéril, diluir 100 microlitros de sobras de cultura de cada frasco. Utilizar um mililitro de LB estéril para zerar o espectrofotómetro e, em seguida, determinar o OD600 da diluição de 10 vezes de cada cultura.

Se, por exemplo, o OD600 da diluição de 10 vezes da cultura noturna for 0,28, então a cultura teve um OD600 real de 2,8. A partir deste exemplo, para chegar a uma solução de estoque de trabalho de 1,12 x 10 elevado a 10 células OP50 por mililitro, o que equivale a um OD600 de 56, ressuspenda o pellet da cultura de 450 mililitros em um 20º do volume original ou 22,5 mililitros de solução basal estéril de S ou SB, suplementada com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Efectuar todas as concentrações subsequentes utilizadas nas experiências em SB e estreptococos, a partir de diluições em série do material de trabalho, utilizando os factores de diluição enumerados no presente quadro.

Depois de cultivar e sincronizar as cepas repórter da C Elegans de acordo com o protocolo de texto, use 15 mililitros de SB para lavar em série os vermes das três placas e coletar o líquido em um tubo estéril de 15 mililitros. Permita que as larvas L4 sedimentem naturalmente e, em seguida, aspire tudo, exceto cerca de 0,5 mililitros do líquido. Nas linhagens repórter do tipo selvagem, este tipo remove quaisquer larvas mais jovens do que L4.In fundos mutantes, esta etapa auxilia na remoção de quaisquer larvas presas, como a nossa, no caso de mortes de um OK3125.

Em seguida, use nove mililitros de SB para ressuspender os vermes. Novamente, monitore a taxa de sedimentação das larvas L4 e, em seguida, aspire todos, exceto aproximadamente 0,5 mililitros do sobrenadante, uma vez que a maioria das larvas L4 tenha peletizado antes de repetir o processo. Adicione 10 microlitros de meio basal S estéril, suplementado com 0,1% de F127 plurônico ao líquido que contém as larvas L4.

Isso atua como um surfactante e evita que as larvas grudem na superfície interna das pontas plásticas da pipeta. Usando uma ponta de pipeta de baixa retenção P200, ressuspenda suavemente as larvas e, em seguida, alíquota de 150 microlitros em três placas de RNAi de 10 centímetros que são semeadas com 5 x 225 microlitros de cinco bactérias de RNAi de ovo. Certifique-se de que os vermes estejam igualmente distribuídos em todos os cinco gramados de bactérias.

Uma vez que o líquido tenha sido absorvido pelo ágar, remova todas as larvas não L4 das placas que não foram eliminadas pelo procedimento de lavagem, retirando-as manualmente. Em seguida, armazene as placas a 20 graus Celsius por 24 horas. Para iniciar a DR de ampla gama, retire todas as larvas jovens que escaparam da etapa anterior de remoção manual, deixando apenas os adultos de um dia nas placas.

Para cada cepa, use 15 mililitros de estreptococos SB estéreis, para lavar os adultos de um dia das três placas, em um tubo de 15 mililitros. Permita que os vermes sedimentem naturalmente e, em seguida, aspire todos, exceto 0,5 mililitros do sobrenadante. Ressuspenda os vermes com 9,5 mililitros de estreptococos SB e repita as etapas de sedimentação e lavagem.

Após a lavagem final e aspiração de todos, exceto 0,5 mililitros do sobrenadante, adicione 10 microlitros de SB Plu e use uma ponta de pipeta P200 para ressuspender suavemente as larvas. Alíquota de 100 microlitros das larvas em uma placa NSC, semeada com 5 x 225 microlitros de bactérias, a uma concentração de 2 x 10 para a nona célula por mililitro. Distribua os 100 microlitros uniformemente em todos os cinco gramados de bactérias.

Ao microscópio, estime o número de animais presentes na placa, visando entre 100 e 150 vermes por placa. Determine o volume de líquido necessário para atingir uma densidade de vermes dentro dessa faixa e, em seguida, aliquota-o em duas placas adicionais. Ajuste o número de vermes na primeira placa para também cair nesse intervalo.

Em seguida, armazene as placas a 20 graus Celsius por 24 horas. No dia seguinte, colete os dois dias de idade e distribua os vermes para novas placas NSC semeadas com o desejo de concentração experimental de alimentos. Assim que o líquido for absorvido pelo ágar, mude as placas para a temperatura experimental desejada por 24 horas.

No dia seguinte, coletar os adultos de três dias e distribuí-los em placas NSC frescas, semeadas com a mesma concentração experimental de alimento. Uma vez que o líquido é absorvido pelo ágar, retorne as placas à temperatura experimental por 48 horas. Por fim, use um dispositivo microfluídico para obter imagens dos animais antes de montar e quantificar os dados de acordo com o protocolo de texto.

Como mostrado aqui, a vida útil média da cepa n2 do tipo selvagem exibe uma resposta complexa à ampla faixa de DR. A magnitude dessa resposta é atenuada em um mutante do gene daf-7, sugerindo que esse gene afeta a capacidade do verme de responder corretamente às mudanças na abundância de alimentos. Os níveis médios de expressão de um repórter transcricional para o gene daf-7 e o fundo do tipo selvagem também exibem uma resposta complexa não monotônica a uma ampla gama DR.In o daf-7 (fundo genético, a expressão deste repórter transcricional é altamente atenuada e mostra pouca resposta a mudanças no nível de alimentos. Esta figura ilustra a estimativa da distribuição conjunta da expressão de TPH1 em neurônios ADF e expressão de daf-7 em neurônios ASI para um determinado nível alimentar.

Esses gráficos de barras apresentam as informações alimentares codificadas, combinatória ou individualmente, pelos neurônios ADF, ASI e NSM, com base nos níveis de expressão gênica de TPH1 e daf-7. Caracteres redundantes e sinérgicos da codificação, resulta da comparação entre informações combinatórias e individuais codificadas por neurônios representadas pela diferença de altura das barras empilhadas à direita e as informações codificadas pelo circuito completo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a replicação da teoria da informação para quantificar a estratégia de codificação requer uma estimativa precisa das distribuições de expressão gênica.

Por esse motivo, o tamanho da amostra é um fator crítico para a aplicabilidade geral dessa estrutura. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de restrição alimentar de ampla gama para identificar e caracterizar novos genes que ligam a abundância de alimentos à expectativa de vida.