Картирование генома всей доступной хроматина в основной человеческий Т-лимфоцитов, ATAC-Seq

Общей целью этого высокопроизводительного метода с использованием транспозазы является идентификация доступных участков хроматина в геноме человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в эпигеномных областях, таких как расположение регуляторных элементов по всему геному. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он надежен, относительно короток и требует меньше исходного материала по сравнению с другими методами измерения доступности хроматина, такими как DNase-seq или FAIRE-seq.

Хотя этот метод может дать представление о регуляторном ландшафте Т-лимфоцитов человека, он также может быть применен к другим системам, таким как другие первичные клетки человека, раковые клетки, клинические образцы человека, клетки других млекопитающих и организмов. Разморозьте аликвоту объемом в один миллилитр из 10 миллионов человеческих PBMC и перенесите ее в 50-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров дополненной среды RPMI. Их центрифугируют в клетках при 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Далее удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 15 миллилитрах дополненной среды РПМИ. Затем перенесите клетки в колбу для культуры Т-75 и инкубируйте их в течение ночи с увлажнением. На следующий день перенесите плавающие клетки стерильной 25-миллилитровой пипеткой в 50-миллилитровую пробирку.

Затем подсчитайте живые клетки с помощью исключения трипанового синего. Затем выделите CD4-положительные клетки из 10 миллионов живых неадгезивных PBMC с помощью колонки для разделения микрогранул. После того, как клетки изолированы, пластинируйте и активируйте Т-клетки в условиях поляризации Th1 и Th2 в соответствии с текстовым протоколом, а затем изолируйте их ядра.

Для этого приготовьте свежий буфер для лизиса и храните его охлажденным на льду. Также, готовясь к реакции транспозиции, нагрейте термошейкер до 37 градусов Цельсия. Затем загрузите полмиллиона Т-клеток в 1,5-миллилитровые микропробирки и вращайте их при давлении 500 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Далее промойте клетки одним миллилитром холодного PBS и повторите цикл отжима, но теперь суспензируйте клетки в одном миллилитре холодного буфера для лизиса. Смешивайте клетки с помощью щадящего пипетирования, чтобы предотвратить чрезмерное разрушение ядер. Затем быстро примите аликвоты по 10 микролитров, чтобы наблюдать за фракцией лизиса клеток.

Обязательно держите клетки в холоде и работают быстро. В течение пяти минут приступайте к реакции транспозиции. Для начала перенесите 100 000 ядер в микропробирку объемом 1,5 миллилитра и раскрутите образец при давлении 500 G в течение 10 минут в холодной центрифуге.

Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость. Далее добавьте компоненты реакции транспозиции к ядрам. Затем ресуспендируйте ядра с помощью щадящего пипетирования и инкубируйте ядра в термошейкере при давлении 500 RMP в течение 30 минут, чтобы завершить реакцию транспозиции.

Затем выполните этап очистки ДНК и разбавьте фрагменты ДНК в 20 микролитрах трис гидрохлорида. Затем с помощью ПЦР выполните первоначальную амплификацию библиотек секвенирования ATAC. Далее оцените оптимальное количество дополнительных циклов, необходимых для окончательной амплификации методом количественной ПЦР.

Исходя из результатов измерений, определите количество циклов, необходимых для окончательной амплификации ПЦР библиотек секвенирования ATAC. Затем выполните окончательное усиление. Настройка оптимального размера фрагментов библиотеки ДНК может улучшить секвенирование следующего поколения.

Сначала разогрейте магнитные шарики до комнатной температуры и приготовьте свежий 70% этанол в воде без нуклеаз. Далее добавьте в библиотеки ATAC-секвенирования воду без нуклеаз в объеме 100 микролитров. Затем добавьте 50 микролитров ресуспендированных магнитных шариков, связывающих ДНК.

Внесите шарики в ДНК пипеткой не менее 10 раз и подождите пять минут. Если капли бусин застряли на стенке трубки или крышке, кратковременно закрутите трубку. Теперь поместите образец рядом с магнитом на две минуты, а затем перенесите надосадочную жидкость в новую микропробирку.

Измерьте объем сбора и добавьте 70% объема магнитной суспензии шариков. Смешайте бусины, как и раньше, и дайте им инкубироваться в течение пяти минут, прежде чем продолжить. Затем отделите бусины с помощью магнита в течение двух минут и теперь выбросьте надосадочную жидкость.

Все еще находясь против магнита, добавьте в бусины 200 микролитров 70% этанола. Подождите 30 секунд, затем выбросьте этанол и повторите промывку этанолом еще раз. Завершите стирку, полностью удалив остатки этанола и дав шарикам высохнуть на воздухе в течение пяти минут на магните.

При необходимости кратковременно раскрутите трубку и отасуньте видимый этанол с помощью пипетки объемом 10 микролитров. Теперь снимите трубку с магнита и добавьте 22 микролитра триса гидрохлорида. Через две минуты верните пробирку на магнитную подставку и дайте раствору очиститься.

Затем соберите 20 микролитров элюата, содержащего подготовленную библиотеку, и храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Этот протокол создает библиотеки секвенирования ATAC, которые обычно имеют размер от 3 до 20 нанограмм на микролитр. Когда они работают на системе для анализа целостности ДНК, они имеют вид лестницы.

Среди прочего, еще одним важным фактором контроля качества является обогащение системы позитивного контроля. По сравнению с отрицательным контролем, третья пара праймеров должна быть обогащена не менее чем в 25 раз, а четвертая пара праймеров должна быть обогащена не менее чем в 75 раз. После первых 10 миллионов прочтений, если выборка соответствует всем критическим параметрам в файле отчета FastQC и от 1 000 до 2 000 пиков получены в результате вызова пиков, то библиотека может быть более глубоко секвенирована для более чем 30 миллионов прочтений.

Из библиотек, отвечающих стандартам качества, только от 6 до 20% прочтений соответствуют митохондриальному геному. Остальные уникальные чтения соответствуют референсному геному человека, и от 7 до 12% находятся в пределах пиков секвенирования ATAC. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать библиотеки ATAC-seq, отправлять и предоставлять секвенирование рационов, а также анализировать полученные данные.

После освоения подготовка библиотеки ATAC-seq может быть выполнена за один или два рабочих дня. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что вам, возможно, придется сначала оптимизировать некоторые этапы, такие как количество клеток и состав буфера для лизиса на этапе выделения ядер. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунопреципитация хроматина, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какой транскрипционный фактор связывается с открытыми областями хроматина в исследуемых образцах.