Name: Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a visualizar proteínas de reparo de DNA marcadas com miniSOG usando microscopia eletrônica de imagem espectroscópica. Este método permite analisar a ultraestrutura da cromatina danificada em nanometros.

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Agradecemos ao Dr. Roger Tsien por nos fornecer as construções miniSOG. Dr. Xuejun Sun pela ajuda com o TEM. Lisa Lem e Peter Shipple do Cross Cancer Institute pelo fornecimento de oxigênio. Hilmar Strickfaden possui uma bolsa de pós-doutorado da Alberta Cancer Foundation e foi apoiado pelo Bayrische Forschungsallianz. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e da Fundação do Câncer de Alberta.

1. Geração de Celulares linhas de miniSOG <ol><li> Cresça U2OS (osteossarcoma humano) as células num prato de 35 mm contendo 2 ml de baixo teor de glucose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que é suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 atmosfera. </li><li> Transfectar as células quando estas são 80% confluentes por lipofecção com qualidade transfecção purificada (A269 / 280 1,8-2,0 rácio) construções de plasmídeo contendo as sequências para miniSOG e mCherry proteínas marcadas de reparação de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção 19. Os plasmídeos de expressão miniSOG pode ser encomendado a partir do Tsien-Lab: <a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li> Ordenar as células que expressam a proteína recombinante com a tag miniSOG mCherry e de fluorescência de células activadas por triagem dois dias após a transfecção. Coletar célulascom intensidade de fluorescência intermediário, a fim de evitar que as células que sobre-expressam são 20. </li><li> Cultura das células positivas em uma placa de 10 cm em 10 ml de meio DMEM que é suplementado com 10% de FBS e 0,6 mg / ml de agente de selecção de G418 (geneticina). </li><li> Depois de colónias visíveis surgiram nas placas, para tela mCherry colónias positivas utilizando um microscópio invertido de fluorescência e desenhar círculos em torno deles (na parte inferior da placa), com um marcador permanente. Use uma lente objetiva de ar de baixa ampliação (por exemplo, 10x) e escolher clones usando técnica estéril riscando cuidadosamente as colônias fora e, lentamente, chupando-os em um estéril 1000 ul ponteira. </li><li> Expandir as colónias seleccionadas e congelar partes delas para baixo utilizando o meio de crescimento descrito no passo 1.1 suplementado com 10% de sulfóxido de dimetilo. Testar as células para a formação DRF crescente por eles em estéreis 18 x 18 mm 2 lamelas e expondo-os a2 Gy de radiação. As células irradiadas expressando estavelmente uma miniSOG mCherry marcado proteína reparação deve mostrar o padrão característico focal típico de LAP quando visualizados com um microscópio de fluorescência utilizando um filtro definido para a imagem latente mCherry. </li></ol> 2. Cultura celular <ol><li> Cultura células U2OS expressam de forma estável o miniSOG e mCherry proteínas marcadas reparação sob as condições descritas na etapa 1.1. Crescer as células a 80% de confluência num prato de 35 mm de diâmetro com fundo de vidro contendo 2 ml de DMEM. Certifique-se de que a cola que liga a lâmina de cobertura para a plástica e que o plástico usado é resistente a soluções aquosas e alcoólicas e resistente à resina utilizada! </li><li> Antes de realizar o ensaio, o contorno de uma pequena área de aproximadamente 1 mm 2 que contém células que expressam as proteínas ectópicas por raspagem com uma caneta de diamante estéril, utilizando um microscópio de fluorescência para identificar a região de interesse. Como alternativa, use um prato de vidro de fundo tchapéu contém uma lamela com um sistema de rede de pré-gravadas embutido na lamela. NOTA: Se estiver usando microscopia correlativo de alta qualidade combinando ESI e fluorescência imagens microscópicas 21, certifique-se de que a espessura da lamela é compatível com os objectivos de imersão em óleo. Deve ter a espessura n ° s 1.5 (0,16-0,18 mm). Escolha de uma área perto do centro do prato para a região a ser examinada na MET, a fim de evitar problemas com a polimerização da resina, que pode ocorrer perto das bordas (ver ponto de 4,10-4,13). </li></ol> 3. DNA danos Indução <ol><li> Irradiam-se as células com radiação gama, usar uma droga radiomimético, ou induzir o dano por micro irradiação laser em um microscópio confocal (por exemplo, tal como descrito em 18,22 ou 23). </li><li> Neste exemplo, irradiam-se as células com 2 e 6 Gy de irradiação gama de uma fonte de césio-137 ou radiação de laser microirradiate utilizando a Sol 405 nmID de laser de estado de um microscópio confocal após a sensibilização das células durante 20 minutos com 0,5 ug / ml de Hoechst. </li></ol> Preparação 4. Amostra <ol><li> Fixar as células com 1 ml de paraformaldeído a 4% em tampão de cacodilato CUIDADO de sódio 0,1 M ou 0,1 M em tampão de fosfato de pH 7,4 durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. CUIDADO: paraformaldeído e cacodilato de sódio são tóxicas! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas. </li><li> Lavar as células duas vezes com 4 ml de 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou tampão de fosfato de pH 7,4. </li><li> Tratar as células fixadas com 2 ml de 50 mM de glicina, 5 mM de aminotriazolo e 10 mM de cianeto de potássio CUIDADO em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (verificar o pH!) Durante 30 min, a fim de bloquear que não reagiu grupos aldeído e para suprimir as espécies de oxigénio reactivas geradas por grupos heme, o que pode aumentar o fundo. CUIDADO: cianeto de potássio é extremamente tóxico! Wluvas de ouvido, trabalhar sob um capuz e eliminar as substâncias tóxicas adequadamente. A reacção é muito sensível ao pH por isso, é importante que o pH verificado e precisas. </li><li> Grave a área que foi selecionada na etapa 2.2 em 2D ou 3D em um microscópio de fluorescência invertido, se microscopia correlativo é desejado. </li><li> Prepara-se uma solução de cloridrato de CUIDADO ml 1 mg / diaminobenzidina, colocando um 10 mg de cloridrato de diaminobenzidina comprimido para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Adicionar 980 ul de H2O destilada e 20 pi de ácido clorídrico concentrado (11,65 M) e misturar até que a solução é castanho claro e translúcidos. Dilui-se esta solução em 0,1 M de fosfato ou tampão de cacodilato de sódio 0,1 M a uma concentração final de 1 mg / ml, enquanto ajustando o pH com hidróxido de sódio a um pH entre 7,0 e 7,6 (pH 7,4 é recomendada). CUIDADO: diaminobenzidina é tóxico! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas. </li><li> Para fotooxidação, rmoran Jr. o tampão com 2 ml de uma solução de cloridrato de 1 ml mg / diaminobenzidina em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão fosfato. Proteger da luz esta solução e arrefecer-se em gelo a 4 ° C, a fim de aumentar a solubilidade do oxigénio. Saturar a solução com oxigénio fazendo borbulhar oxigénio através da solução (usar uma mangueira que é inserida na solução e ligada a uma garrafa de oxigénio). Verifique novamente o pH e ajustar, se necessário. NOTA: É crucial para a reacção de foto-oxidação que o pH é entre pH 7,0 e pH 7,6. </li><li> Monte o prato com as células fixas com cuidado sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com uma lente objetiva de 40x de imersão em óleo e movê-lo para a área de interesse. Excitar a tag miniSOG com luz azul, usando filtros de cubos para GFP ou PCP. MiniSOG tem um máximo de excitação a 448 nm com um ombro a 473 nm de 10. </li><li> Continue com a iluminação, mesmo após a miniSOG fluorescência ha verdeé completamente desaparecido e até que o produto de foto-oxidação marrom do diaminobenzidina polimerizado surge no canal de luz transmitida. Quando o produto de oxidação é visível na maioria das células, desligar a iluminação de fluorescência para parar o foto-oxidação. NOTA: A foto-oxidação pode levar vários minutos, dependendo da lente objetiva, comprimentos de onda de transmissão de filtro e eficiência, e da fonte de iluminação. </li><li> Sufixo as células com 1 ml de glutaraldeído a 2% em cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,4 tampão de fosfato ou tampão de pH 7,4 durante 30 min. </li><li> Fixar as membranas das células com 0,1% -0,5% de tetróxido de ósmio durante 20 minutos em 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4. NOTA: Recomenda-se usar a menor concentração possível de tetróxido de ósmio necessário para estabilizar as membranas. Uma vez que os precipitados DAB polimerizado ter uma elevada densidade de azoto, o qual pode ser detectado directamente por ESI, um fortecoloração ósmio não é necessário identificar a proteína miniSOG-marcado e pode ser prejudicial para a ESI. Tetróxido de ósmio é muito tóxico! Trabalhar em um exaustor e descartar o lixo tóxico adequadamente. </li><li> Desidratar, as células através de uma série de etanol, utilizando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% passos de etanol (100% a cada 5 min). Subsequentemente, incubar as células numa proporção de 1: 1 mistura de etanol a 100% e resina acrílica (LR branco) e colocar o prato num agitador durante 4 h, para facilitar a infiltração das células antes da incubação das células durante, pelo menos, mais 4 h em 100 resina acrílica% (LR Branco). </li><li> De modo a polimerizar a resina, retira a tampa de um tubo de microcentrifugação de 2 ml rotulados com uma lâmina de barbear e o revestimento da jante com acelerador de resina acrílica. Certifique-se de que o acelerador só cobre a borda e não flui para dentro do tubo. Subsequentemente, cuidadosamente encher o tubo, aproximadamente, dois terços com resina LR branco, utilizando uma pipeta de Pasteur. Tome cuidado para que a resina não entrar em contato with o acelerador no aro! </li><li> Remover a resina de que as células infiltradas no prato e colocar o prato de cabeça para baixo no tubo de microcentrífuga que está na posição vertical de modo a que a largura do tubo preenche quase completamente a janela de observação de vidro revestido do prato. </li><li> Aguardar 1 a 2 minutos para o acelerador para selar o tubo e a lamela, em seguida, inverter o tubo de modo que a resina no tubo de cobre agora as células. </li><li> Colocar a cápsula com o tubo num forno a 60 ° C e curar durante 12 horas. </li><li> Quando o bloco é curado, remover o prato com o tubo de microcentrífuga cheio de resina ligada a partir do forno e separar o tubo de microcentrífuga do prato. Facilitar a separação por ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido e água quente. </li><li> Descarte o prato fundo de vidro e corte cuidadosamente abrir o tubo de microcentrífuga com uma lâmina de barbear, a fim de eliminar o bloqueio. </li><li> Rotular o bloco com um marcador permanente. </li><li> Use uma lâmina de barbear para trim do bloco de modo que nada a não ser a região de 1 mm2 que contém a área previamente marcado com a caneta de diamante ou de tungsténio (ou contém a área com as células de interesse) permanece. </li><li> Monte o bloco em um ultramicrótomo, cortar o bloco com uma faca de aparar e cortar seções ultra-finas de cerca de 50 nm usando uma faca de diamante. </li><li> Pegue as seções sobre-elevada da transmissão 300 redes de malha. Estas redes têm muito pequenas barras de grade e, assim, cobrir menos células na área de interesse. </li><li> Brasão as seções sobre as grades com cerca de 0,2-0,4 nm de carbono, usando um aplicador de carbono para ajudar a estabilizá-los sob o feixe de elétrons do TEM. </li></ol> 5. Microscopia Eletrônica <ol><li> Carregar as grades em uma TEM que esteja equipado com um filtro de energia. Depois de ajustar o microscópio e o filtro de energia de acordo com as instruções do fabricante, inspeccionar as células sobre as secções no modo de ampliação baixa (de transmissão normal) e compararlos para dados de fluorescência quando apropriado (obtido na etapa 4.4). </li><li> Uma vez que um núcleo com características interessantes (DNA danos trilha ou reparo de DNA focos) é encontrado, mude para o modo de filtragem de energia e gravar um mapa espessura. NOTA: Este procedimento inclui a gravação de um-zero perda e uma imagem não filtrada. Espessuras de até 0,3 livre percurso médio (30% dos elétrons do feixe incidente fica espalhada por amostra) são finas o suficiente para gerar bons mapas elementares. </li><li> Mapas relação ficha do fósforo e nitrogênio elementos usando o software que controla o filtro de energia do microscópio usado. Grave as imagens mapa fósforo pós ponta a 175 eV perda de energia com a largura da fenda de 20 eV e pré-edge imagens em 120 eV perda de energia, também com uma largura da fenda de 20 eV. Para os mapas de nitrogênio, ficha imagens pós ponta em 447 eV com a largura da fenda de 35 eV e pré-edge imagens em 358 eV, também com uma largura da fenda de 35 eV. Observação: Uma vez que o teor dos elementos clonados (fosforus e nitrogênio) é relativamente baixa (aprox. 1%), escolha &quot;Proporção da imagem&quot; (mapa elementar qualitativa) sobre o &quot;método 3 janela&quot; (quantificar mapa elementar), a fim de gerar imagens com uma melhor relação sinal-ruído. </li></ol> 6. Processamento de Imagem <ol><li> Abra os mapas de relação elementares em um software de processamento de imagem que pode lidar com o formato de arquivo das imagens adquiridas (por exemplo, Micrografia Digital). Copie o nitrogênio mapa para o canal vermelho eo mapa de fósforo para o canal verde de uma imagem RGB, em seguida, sobrepor e alinhar os mapas. </li><li> Exportar a imagem composta como um arquivo de imagem formato de arquivo (TIFF). Abra a imagem em um software de processamento de imagem que podem usar camadas (por exemplo, Photoshop). </li><li> Ajustar a gama dinâmica de cada canal por rescaling a valores mínimos e máximos na imagem para um conjunto de dados de 8 bits (0 a 255). </li><li> Subtrair o teor de fósforo a partir do nitrogênio mapa (usando oJanela &quot;camadas&quot;), a fim de gerar um mapa qualitativo, que mostra a distribuição da proteína. </li><li> Converter os mapas do ácido nucleico (fósforo) e a proteínas (azoto) criado na etapa anterior em &quot;cores indexadas&quot; e criar uma tabela de pesquisa amarelo no espaço de cores CMYK para o mapa que mostra a distribuição do ácido nucleico e uma tabela de pesquisa ciano para mostrar o mapa não-nucleoproteína. As cores são escolhidas para gerar o máximo contraste entre os dois mapas elementares. </li><li> Crie uma nova imagem e importar os mapas que mostram as distribuições de fósforo e proteínas como diferentes camadas. Use o modo de transparência &quot;screen&quot;, a fim de ver as duas camadas sobrepostas umas sobre as outras. </li><li> Abra a imagem perda de zero adquirido na etapa 5.2. Esta imagem representa uma imagem da área gravada que se parece com uma imagem TEM convencional, mas contém apenas os elétrons que passaram através do espécime sem colidir com o modelo. Exportaçãoesta imagem como uma imagem TIFF. </li><li> Abra a imagem zero perda exportado em um editor de fotos e copiá-lo para a camada superior da imagem que mostra o mapa elementar. Alinhe a imagem usando o modo de transparência &quot;tela&quot;. </li><li> Opcionalmente, o limiar de imagem perda de zero para o segmento de sinal que se origina a partir do miniSOG. Adicionar a imagem resultante como uma camada separada, tal como descrito acima. </li></ol>

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<li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135(2013).</li>
<li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li>
<li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li>
<li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprint+of+%27Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+%28QuEST%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li>
<li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li>
<li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, Georgetown, Tex. 308-322 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

ESI pode servir como uma ferramenta excelente para examinar diferentes estados de cromatina e ribonucleoproteínas no núcleo, porque é capaz de mapear especificamente áreas que são ricos em fósforo. É profundamente aumenta a quantidade de detalhe que pode ser obtida por um microscópio electrónico, e não é dependente de métodos de contraste não específicos. Uma desvantagem de ESI é que ele requer secções mais finas do que MET convencional com a mesma voltagem de aceleração. Isso pode ser superado por trabalhar com cortes ...

Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos 1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de determinar a composição bioquímica das estruturas visualizadas. Na ausência de membranas internas para ajudar a diferenciar estruturas nucleares, o núcleo tem sido particularmente difícil. Electron espectroscópica imagiologia (ESI) resolve algumas destas limitações, permitindo a detecção e diferenciação simultâneas de ADN, ARN, e Protein baseada em estruturas nucleares 2-5. Electron imagens espectroscópicas: Para mapear distribuições elementares em alta sensibilidade e resolução do microscópio eletrônico, pode-se usar um espectrômetro de imagem que seleciona os elétrons que foram inelasticamente espalhadas através de interações com electrões de interiores de um elemento na amostra 6. Devido quantidades específicas do elemento de energia são perdidos em consequência de ionização de átomos presentes na amostra, estes electrões pode ser separada e visualizada utilizando um espectrómetro que está ligado ao microscópio electrónico. Assim, a análise do espectro dos electrões que interagiram com o espécime revela informação qualitativa e quantitativa sobre a composição elementar da amostra 7. Os electrões que não perdem energia ao passar através da amostra encontram-se na &quot;perda do pico a zero&quot; da perda de energia dos electrõesespectro. A abundância destes electrões está relacionada com a massa, densidade e espessura do espécime e é composta de electrões que passam através do espécime, sem colidir com a amostra ou a perda de energia durante a passagem através da amostra. Esta informação pode ser útil para a quantificação absoluta do número de átomos de um elemento específico presente na amostra 8. Uma vez que as amostras biológicas consistem principalmente em elementos leves que mal desviar os electrões no feixe incidente do MET, utilizando métodos de coloração de metal pesado sais têm de ser aplicadas, a fim de gerar contraste na amostra. A falta de especificidade da maior parte destes agentes de contraste e a incapacidade para visualizar mais do que uma mancha, onde é possível a especificidade tem limitado o valor de microscopia electrónica convencional no estudo do núcleo. ESI tem vantagens significativas sobre MET convencional, nomeadamente para o estudo das estruturas do núcleo da célula.É possível explorar a natureza rica em fósforo de ADN e de complexos macromoleculares contendo ARN para distinguir os complexos nucleoproteicos de complexos de proteínas e diferentes para resolver os complexos nucleoproteicos com base na sua densidade de ácidos nucleicos. O restante material biológico pode ser trabalhada com base na sua abundância de azoto. Mapeamento apenas estes dois elementos e análise de sua distribuição e abundância relativa dentro de estruturas anatômicas diferentes nos fornece uma série de informações sobre o núcleo. Por exemplo, é fácil de identificar cromatina e os ribossomas no mapa representam abundância de fósforo. O espaço interchromatin, complexos de poros nucleares, e corpos nucleares, por outro lado, pode ser facilmente detectada na imagem do mapa de azoto. Mini sistema gerador de oxigênio singlete (miniSOG) Enquanto ESI representa uma técnica poderosa para estudar na estrutura da cromatina situ porque tomarA vantagem dos índices característicos na composição elementar entre fósforo e nitrogênio, a composição elementar não pode normalmente ser usado para discriminar entre diferentes populações de complexos de proteínas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pequenas na gama nanométrica têm sido amplamente utilizados para mapear a localização de moléculas individuais. Uma vez que a partícula de ouro está geralmente ligado a um anticorpo secundário, que aparece dentro de uma circunferência de cerca de 20 nm, em torno do epitopo detectada pelo anticorpo primário. Em amostras de pós-incorporação, anticorpos pode detectar apenas os epítopos expostos à superfície das secções. Embora seja possível para provar a presença de um antigénio e relacioná-la com uma determinada estrutura anatómica da célula, a informação que é obtida é incompleta, uma vez que a maioria dos epitopos são obscurecidos por resina. As técnicas que utilizam protocolos semelhantes aos usados ​​para a microscopia de fluorescência pré-incorporação, permitir o acesso a todo antigéniostoda a profundidade da amostra, mas as etapas permeabilização que são necessários para permitir que o anticorpo para penetrar a célula normalmente requerem a remoção de membranas lipídicas e remover componentes que não podem ser fixados por aldeídos. Além disso, o fixador de aldeído preferido para a preservação ultraestrutura, glutaraldeído, comumente destrói epitopos e, consequentemente, paraformaldeído é normalmente necessária. Esta é menos eficaz a reticulação da proteína-proteína. Outra desvantagem de que os anticorpos são marcados com uma nanopartícula de ouro é que o ouro é um material muito denso de electrões que criam uma forte contraste que podem obscurecer detalhes estruturais interessantes da amostra, o que tem mais fraco contraste. O surgimento da proteína fluorescente verde (GFP) como uma marca de proteína expressa transformou a utilização de microscopia de fluorescência para responder a perguntas em biologia celular. Marcação de uma proteína com um domínio pequeno fluorescente permite o mapeamento de sua distribuição in vivo </em&gt; sem a necessidade de procedimentos de permeabilização que podem alterar a estrutura. A fim de traduzir o princípio elegante de usar etiquetas proteicas para mapear distribuições de proteína numa célula para microscopia de electrões, foi necessário um sistema que é capaz de produzir um sinal para fechar a estrutura de interesse e gerar contraste na MET. Diaminobenzidina polimerizada é um corante que é muitas vezes usado em histologia para detectar a ligação do anticorpo. Este corante é geralmente depositado utilizando peroxidase de rábano (HRP) conjugado com um anticorpo secundário. Embora a reacção produz um resultado fiável, a HRP não é cataliticamente activo no citosol de células 9. Os produtos da reacção de HRP pode também difundir para longe do local de geração de modo que a sua resolução é pior do que o método nanogold 10. Para contornar esses problemas, o Sistema de Flash / ReAsH foi desenvolvido 11. É constituída por proteínas de fusão recombinantes que possuem um motivo tetracisteï¿½a. Este motivo permite a ligação deum fluoróforo biarsenic. Quando excitado, o flash ligado ou ReAsH é capaz de gerar o oxigénio singeleto altamente reactivo e portanto photoconvert diaminobenzidina (DAB) num polímero que precipita imediatamente no local das proteínas marcadas. O polímero DAB pode ser coradas com tetróxido de ósmio, que é de electrões denso e, portanto, pode ser utilizada para mapear a distribuição da proteína de fusão recombinante em MET. Em 2011, Shu et al. 10, apresentado o sistema miniSOG, que consiste de uma pequena 106 amino ácidos tag de fusão derivada de uma flavoproteína de Arabidopsis que é fluorescente e capaz de criar muitos radicais de oxigénio singleto quando excitado com luz azul de 448 nm. Esses radicais oxigénio singuleto pode ser usado para oxidar foto-diaminobenzidina para formar polímeros sobre e perto da superfície da proteína marcada, que é consideravelmente mais estreita do que os anticorpos marcados por imuno 11. Enquanto o sistema de flash / ReAsH requer trazendo o flúorcromo eo diaminobenzidina para as células antes de fazer a fotoconversão, o sistema requer apenas miniSOG diaminobenzidina e luz e, além disso é de cerca de duas vezes mais eficaz na polimerização de diaminobenzidina. Aqui, miniSOG é empregada em combinação com ESI, a fim de mapear a ultra-estrutura de reparo do DNA focos. Reparo do DNA focos (DRF) DNA reparado rupturas de filamentos duplos representam uma séria ameaça para a célula, uma vez que pode levar a translocações e perda de informação genética. Por sua vez, isto pode levar a senescência, cancro, e morte celular. Muitas proteínas que estão envolvidas na reparação de DNA dupla vertente pausa acumular em focos que montar em torno de um DNA dupla vertente quebrar 12-14. Embora sua função não é conhecida, eles representam o site no núcleo que contém o DNA quebra de cadeia dupla e é o local de DNA dupla vertente de reparação pausa. Reparo do DNA foci (DRF) foram caracterizados por microscopia de fluorescência e que servem como biomarcadores para o dano ao DNA 12,15. Eles são em massa em relação ao tamanho da ruptura de fita dupla e foram consideradas relativamente homogénea até recentes estudos de microscopia de super-resolução revelou alguma evidência de sub-compartimentação de moléculas dentro de cada foco 16. A fim de compreender como estes locais são organizadas, é necessário visualizar todas as estruturas biológicas subjacentes em relação ao outro. Isso não pode ser alcançado por microscopia de fluorescência, mas é possível através de microscopia eletrônica de 17,18. Aqui, é descrito um método que combina eletrônica espectroscópica de imagem com o método miniSOG para ilustrar o potencial dessa abordagem combinada para explorar a ultra-estrutura de reparo de DNA de fita dupla ruptura.

<table><tbody><tr><td>Pratos de fundo de vidro de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro de 35 mm em grade</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp;</td><td>não feito para objetivas de imersão</td></tr><tr><td>LR Branco: resina de acrílico</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LR Acelerador branco</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg</td><td>comprimidos Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de laboratório de ponta de tungstênio</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Coater 208 carbono</td><td>Cressington</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra micrótomo Leica EM UC6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>Adobe</td><td></td><td>pode até funcionar com versões mais antigas</td></tr><tr><td>Digital Micrograph V.2.30</td><td>Gatan</td><td></td><td>pode até funcionar com versões mais antigas</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td></tr><tr><td>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fonte de radiação de césio 137 "MARCA 1"</td><td>&nbsp;( J.L. Pastor & Associado)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>open source</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>tubos Eppendorf de 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Faca de Diamante ultra 35&deg;</td>Faca de Corte <td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultratrim</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de Sódio trihidratado</td><td>emsdiasum</td><td>12300</td><td>Cuidado Tóxico!</td></tr><tr><td>Glutaraldeído EM Grau 8%</td> <td>emsdiasum</td><td>16020</td><td>Cuidado Tóxico!</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>emsdiasum</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>emsdiasum</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>emsdiasum</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio solução a 4%</td><td>emsdiasum</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Micoscópio de fluorescência invertida Axiovert 200M</td> Ácido clorídrico <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Hidróxido de Sódio 10M</td><td>Fluka</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Oxigênio</td><td>Medigas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>Cianeto de potássio</td><td>Sigma</td><td>207810</td><td>Cuidado Tóxico!</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>Cuidado Tóxico!</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de aço carbono de borda única</td><td>emsdiasum</td><td>71960</td><td>Cuidado afiado!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Eletrônico de Transmissão 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 Filtro de energia</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de minisog proteínas tagged reparo de dna em combinação com electron espectroscópica imagem (esi)

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Os limites para a resolução óptica e o desafio de identificar populações específicas de proteínas em microscopia eletrônica de transmissão têm sido obstáculos na biologia celular. Muitos fenómenos não pode ser explicado por meio de análise in vitro em sistemas simplificados e necessitam de informação estrutural adicional in situ, em particular na gama entre 1 nm e 0,1 um, a fim de ser completamente compreendida. Aqui, imagens espectroscópicas elétron, uma técnica de microscopia eletrônica de transmissão que permite o mapeamento simultâneo da distribuição de proteínas e ácidos nucleicos, e uma tag de expressão, miniSOG, são combinados para estudar a estrutura e organização do DNA de fita dupla focos reparo ruptura.

ESI Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor diferen...

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

O objetivo geral do experimento a seguir é mapear a distribuição de proteínas de reparo de DNA ao redor de quebras de DNA de dupla fita em escala nanométrica. Para estudar a ultraestrutura da cromatina danificada em processo de reparo, utilizando imagem espectroscópica de elétrons. Isso é conseguido por meio da geração de construtos de expressão de DNA codificando proteínas de fusão de proteínas de resposta ao dano no DNA com uma proteína fluorescente e a marcação mini SOG.Como segundo passo, os construtos são introduzidos nas células por transfeção, e então as células são danificadas por irradiação com laser ou gama. Em seguida, as células irradiadas e fixadas passam por etapas de preparação para microscopia eletrônica, a fim de tornar visível a distribuição da proteína de reparo marcada com mini SOG no microscópio eletrônico. A imagem espectroscópica eletrônica resultante fornece imagens detalhadas que permitem a análise da ultraestrutura da cromatina e da relação de proteínas específicas com focos de reparo do DNA.A principal vantagem desta tecnologia em comparação com outras tecnologias existentes, como a marcação com ImmunoGold, é que ela não depende da disponibilidade de anti

visualization-minisog-tagged-dna-repair-proteins-combination-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós apresentamos um procedimento pelo qual duas dimensões de análise agarose-gel pode ser usado para identificar a estrutura de intermediários de replicação que ocorrer após a irradiação UV.

Visualização dos Intermediários UV-induzida replicação em E. coli Usando bidimensional Análise Agarose-gel

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Aqui, o estudo de diferentes abordagens de reconhecimento de lesões de DNA por meio de imagens AFM de molécula única é demonstrado com o sistema de reparo por excisão de nucleotídeos como exemplo. Os procedimentos de preparações de amostras de DNA e proteína e detalhes experimentais, bem como analíticos para os experimentos de AFM são descritos.

Microscopia de Força Atômica Investigações do Reconhecimento de Lesão de DNA no Reparo de Excisão de Nucleótidos

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

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Investigação de recrutamento de proteína para lesões de DNA usando 405 Nm Laser Microirradiação

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Aprenda a visualizar proteínas de reparo de DNA marcadas com miniSOG usando microscopia eletrônica de imagem espectroscópica. Este método permite analisar a ultraestrutura da cromatina danificada em nanometros.

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

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