Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

O objetivo geral do experimento a seguir é mapear a distribuição de proteínas de reparo de DNA ao redor de quebras de DNA de dupla fita em escala nanométrica. Para estudar a ultraestrutura da cromatina danificada em processo de reparo, utilizando imagem espectroscópica de elétrons. Isso é conseguido por meio da geração de construtos de expressão de DNA codificando proteínas de fusão de proteínas de resposta ao dano no DNA com uma proteína fluorescente e a marcação mini SOG.

Como segundo passo, os construtos são introduzidos nas células por transfeção, e então as células são danificadas por irradiação com laser ou gama. Em seguida, as células irradiadas e fixadas passam por etapas de preparação para microscopia eletrônica, a fim de tornar visível a distribuição da proteína de reparo marcada com mini SOG no microscópio eletrônico. A imagem espectroscópica eletrônica resultante fornece imagens detalhadas que permitem a análise da ultraestrutura da cromatina e da relação de proteínas específicas com focos de reparo do DNA.

A principal vantagem desta tecnologia em comparação com outras tecnologias existentes, como a marcação com ImmunoGold, é que ela não depende da disponibilidade de anticorpos e marca as estruturas de interesse de forma bastante densa. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque a foto-oxidação é muito sensível ao pH, à intensidade da luz e à saturação de oxigênio. A demonstração visual deste método é fundamental, pois os passos de foto-oxidação, saturação de oxigênio e iluminação são sensíveis a mudanças muito pequenas, sendo, portanto, importante ilustrar como o método é realizado para que possa ser reproduzido.

O Dr. Hilmar Fadden, pós-doutorando no meu laboratório, demonstrará o método para vocês. Células de osteossarcoma humano que expressam estavelmente as proteínas de reparo marcadas com miniSOG e M-cherry, conforme descrito no protocolo textual complementar. Após dividir as células de uma placa de 10 centímetros, cultivar as células até atingirem 80% de confluência.

Em seguida, coloque as células sob um microscópio de fluorescência e use uma caneta de diamante estéril para delinear uma pequena área de aproximadamente um milímetro quadrado que contenha células expressando as proteínas ectópicas; uma vez demarcada, sensibilize as células adicionando herx à solução, de modo que a concentração final seja de 0,5 microgramas por mililitro, e então coloque-as no incubador a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, irradie as células com microcirurgia a laser utilizando o laser de estado sólido de 405 nanômetros de um microscópio confocal, a fim de induzir danos ao DNA; após os danos ao DNA, fixe as células no escuro usando um mililitro de paraformaldeído a 4% em tampão de citrato de sódio 0,1 molar, à temperatura ambiente, após 30 minutos.

Lave as células duas vezes com quatro mililitros de tampão de Cate de sódio 0,1 molar em pH 7,4. Em seguida, trate as células fixadas com dois mililitros de uma solução contendo 50 milimolar de glicina, 5 milimolar de amino triazol e 10 milimolar de cianeto de potássio em pH 7,4 durante 30 minutos. Substitua o tampão por dois mililitros de tampão de fotooxidação em pH 7,4, preparado conforme descrito no protocolo textual complementar.

Em seguida, incube a amostra no escuro sobre gelo, borbulhando oxigênio na solução para mantê-la saturada de oxigênio. Depois, monte cuidadosamente a lâmina com as células fixadas em um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma objetiva de imersão a óleo de 40 x e posicione-a na área de interesse previamente delimitada. Excite a marcação mini SOG com luz azul utilizando cubos de filtro para proteína verde fluorescente.

Continue com a iluminação mesmo após a fluorescência verde do mini SOG ter desaparecido completamente e até que o produto marrom de foto-oxidação da diaminobenzidina polimerizada surja no canal de luz transmitida. Em seguida, fixe as células com um mililitro de 2% de glutaraldeído em tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar, pH 7,4, por 30 minutos.

Em seguida, fixe as membranas celulares com tetróxido de ósmio a 0,1 a 0,5% em tampão de Cate de sódio 0,1 molar por 20 minutos a pH 7,4. Após a fixação, desidrate as células por meio de uma série de lavagens com etanol. Em seguida, incube as células em uma mistura um para um de etanol a 100% e resina acrílica em agitador durante quatro horas.

Em seguida, remova a mistura e adicione resina acrílica a 100% às amostras por mais quatro horas. Para polimerizar a resina, corte a tampa de um tubo microcentrífugo de dois mililitros rotulado com uma lâmina de barbear e cubra a borda com acelerador de resina acrílica. Encha cuidadosamente o tubo aproximadamente até dois terços com resina LR white usando uma pipeta de Pasteur.

Tenha cuidado para que a resina não entre em contato com o acelerador na borda. Remova a resina que infiltrou nas células na placa e coloque a placa de cabeça para baixo sobre o tubo de microcentrífugo posicionado verticalmente, de modo que a largura do tubo preencha quase completamente a janela de observação coberta com lâmina de vidro do peso da placa. Espere um a dois minutos para que o acelerador selle o tubo e a lamínula.

Em seguida, inverta o tubo para que a resina no tubo cubra agora as células. Coloque o recipiente com o tubo no forno a 60 graus Celsius e polimerize por 12 horas. Após a polimerização do bloco, retire o recipiente com o tubo de microcentrífuga preenchido com resina do forno e separe o tubo de microcentrífuga do recipiente.

Descarte o recipiente de fundo de vidro e corte cuidadosamente o tubo de microcentrífuga com uma lâmina de barbear para liberar o bloco. Com uma lâmina de barbear, modele o bloco de modo que apenas a região de um milímetro quadrado que contém a área previamente marcada com caneta de diamante ou tungstênio permaneça. Em seguida, monte o bloco em um ultramicrótomo e corte o bloco com uma faca de corte até que as células sejam alcançadas.

Em seguida, mude para uma lâmina de diamante e corte seções ultrfinas de aproximadamente 50 nanômetros através das células. Recolha as seções em grades de alta transmissão com malha de 300. Em seguida, coloque as grades em um revestidor de carbono e recubra as seções com cerca de 0,2 a 0,4 nanômetros de carbono para ajudar a estabilizá-las sob o feixe de elétrons do microscópio eletrônico de transmissão.

Carregue as grades em um microscópio eletrônico de transmissão equipado com filtro de energia. Inspecione as células nas seções usando o modo de transmissão normal em baixa ampliação e compare-as com as imagens de fluorescência obtidas anteriormente. Assim que um núcleo com uma trilha de dano ao DNA ou focos de reparo de DNA for localizado, mude para o modo de filtragem de energia e registre a amostra com um mapa de espessura.

Em seguida, registre as imagens do mapa de fósforo após a borda em 175 de perda de energia eletrônica com uma largura de fenda de 20 elétron-volts. Também registre imagens pré-borda em 120 elétron-volts de perda de energia, igualmente com uma largura de fenda de 20 elétron-volts para o registro dos mapas de nitrogênio. Registre imagens após a borda em 447 elétron-volts com uma largura de fenda de 35 elétron-volts e imagens pré-borda em 358 elétron-volts.

Também com uma largura de fenda de 35 elétron-volts. Abra os mapas de razão elementar em um software de processamento de imagens, como este. Copie o mapa de nitrogênio para o canal vermelho e o mapa de fósforo para o canal verde de uma imagem RGB.

Em seguida, sobreponha e alinhe os mapas. Exporte a imagem composta como um arquivo no formato de arquivo de imagem marcado e, depois, abra a imagem em um software de processamento de imagens que possa utilizar camadas. Ajuste então a faixa dinâmica de cada canal reescalando os valores mínimo e máximo da imagem para um conjunto de dados de oito bits.

Em seguida, subtraia o conteúdo de fósforo do mapa de nitrogênio dentro da janela de camadas. Converta a imagem em uma cor indexada e crie uma tabela de consulta amarela no espaço de cor CMYK para o mapa que mostra a distribuição de ácidos nucleicos e uma tabela de consulta ciano para mostrar o mapa de proteína não cromatínica. Em seguida, crie uma nova imagem e importe os mapas que mostram as distribuições de fósforo e proteína não cromatínica como camadas diferentes.

Utilize o modo de transparência da tela para visualizar ambas as camadas sobrepostas uma sobre a outra. São mostrados aqui mapas de razão espectroscópica eletrônica do interior de um núcleo celular, indicando as localizações de fósforo e nitrogênio quando os dois mapas de razão são sobrepostos no espaço de cores RGB. Uma imagem como a mostrada aqui é obtida nesta imagem.

As estruturas amarelas representam proteínas nucleares, refletindo a presença de fósforo e nitrogênio. Aqui, a imagem espectroscópica de elétrons é utilizada para observar as alterações na estrutura dos focos após irradiação gama em células U2 OS. Na linha superior, células estavelmente expressando proteínas de reparo marcadas com M cherry mostram imagens de células que não foram irradiadas.

A segunda linha mostra células que foram fixadas três horas após a irradiação. A terceira linha mostra células fixadas seis horas após a irradiação. A imagem espectroscópica de elétrons revela que a estrutura dos focos parece se reorganizar ao longo do tempo, já que a quantidade relativa da proteína 53BP1 no foco, indicada pelo aumento no sinal de nitrogênio, parece aumentar, enquanto a cromatina, indicada pelo sinal de fósforo, assume uma posição mais periférica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar células irradiadas expressando proteínas de reparo mini so para analisar a ultraestrutura da cromatina em focos de reparo de DA utilizando imagem espectroscópica de elétrons. Não se esqueça de que trabalhar com tampão de cianeto de sódio, correta de potássio e óxido de ósmio pode ser extremamente perigoso e precauções, como trabalhar em uma câmara de fluxo laminar e usar luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.