Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

O objetivo geral do experimento a seguir é mapear a distribuição de proteínas de reparo de DNA em torno de quebras de DNA de fita dupla em nanoescala. A fim de estudar a ultra estrutura da cromatina danificada em reparo usando imagens espectroscópicas eletrônicas. Isso é obtido gerando construções de expressão de DNA que codificam proteínas de fusão de proteínas de resposta a danos no DNA usando uma proteína fluorescente e a etiqueta mini SOG.

Como uma segunda etapa, as construções são introduzidas nas células por transfecção e, em seguida, as células são danificadas por irradiação a laser ou gama. Em seguida, as células irradiadas e fixadas passam por etapas de preparação de microscopia eletrônica para tornar visível no microscópio eletrônico a distribuição da proteína de reparo marcada com mini SOG. A imagem espectroscópica eletrônica resultante fornece imagens detalhadas que permitem a análise da ultraestrutura da cromatina e a relação de proteínas específicas com focos de reparo de DNA.

A principal vantagem dessa tecnologia sobre outras tecnologias existentes, como a marcação ImmunoGold, é que ela não depende da acessibilidade de anticorpos e rotula as estruturas de interesse de forma bastante densa. Geralmente, os indivíduos que são novos neste método terão dificuldades porque a foto-oxidação é muito sensível ao pH, intensidade da luz e saturação de oxigênio. A demonstração visual desse método é crítica porque as etapas de fotooxidação, saturação de oxigênio e iluminação são sensíveis a mudanças muito pequenas e, portanto, é importante ilustrar como o método é feito para reproduzi-lo.

O Dr. Hilmar Fadden, um pós-doutorado em meu laboratório, demonstrará o método para sua cultura. Células de osteossarcoma humano que expressam de forma estável as proteínas de reparo marcadas com mini SOG e M cherry, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Depois de dividir as células de um prato de 10 centímetros, cresça as células até 80% de fluência.

Em seguida, coloque as células sob um microscópio de fluorescência e use uma caneta de diamante estéril para delinear uma pequena área de aproximadamente um milímetro quadrado que contém células que expressam as proteínas ectópicas uma vez marcadas, sensibilize as células adicionando herx à solução para que a concentração final seja de 0,5 microgramas por mililitro e, em seguida, coloque-as na incubadora a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, o laser microirradia as células usando o laser de estado sólido de 405 nanômetros de um microscópio confocal para induzir danos ao DNA após danos ao DNA, fixa as células no escuro usando um mililitro de aldeído paraforme 4% em 0,1 molar de sódio. Cate tampão em temperatura ambiente após 30 minutos.

Lave as células duas vezes com quatro mililitros de tampão Cate de sódio 0,1 molar a um pH de 7,4. Em seguida, trate as células fixas com dois mililitros de uma solução contendo 50 milimolares de glicina, cinco milimolares aminotriazol e 10 milimolares de cianeto de potássio a um pH de 7,4 por 30 minutos. Substitua o tampão por dois mililitros de tampão de fotooxidação a um pH de 7,4, que foi preparado conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Em seguida, incube a amostra no escuro no gelo enquanto borbulha oxigênio na solução para mantê-la saturada de oxigênio. Em seguida, monte a antena com as células fixas cuidadosamente em um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma lente objetiva de imersão em óleo de 40 x e mova-a para a área de interesse descrita anteriormente. Excite a etiqueta mini SOG com luz azul usando cubos de filtro para proteína fluorescente verde.

Continue com a iluminação mesmo depois que a fluorescência verde do mini SOG desaparecer completamente. E até que o produto de fotooxidação marrom do dia amino benadina polimerizado surja no canal de luz transmitida. Em seguida, fixe as células com um mililitro de glutaraldeído a 2% em tampão Cate de sódio 0,1 molar a pH 7,4 por 30 minutos.

Em seguida, fixe as membranas celulares com tetróxido de ósmio 0,1 a 0,5% em tampão Cate de sódio 0,1 molar por 20 minutos a pH 7,4. Uma vez fixado, desidrate as células através de uma série de lavagens com etanol. Em seguida, incube as células em uma mistura um-para-um de 100% de etanol e resina acrílica em um agitador por quatro horas.

Em seguida, remova a mistura e adicione resina 100% acrílica às amostras por mais quatro horas. Para polimerizar a resina, corte a tampa de um tubo de microcentrífuga de dois mililitros rotulado com uma lâmina de barbear e cubra a borda com acelerador de resina acrílica. Encha cuidadosamente o tubo com aproximadamente dois terços de resina branca LR usando uma almofada de tubo de pastagem.

Tome cuidado para que a resina não entre em contato com o acelerador no aro. Remova a resina que se infiltrou nas células do prato e coloque o prato de cabeça para baixo no tubo de microcentrífuga vertical de modo que a largura do tubo preencha quase completamente a janela de observação coberta de vidro do peso do prato. Um a dois minutos para o acelerador selar o tubo e a lamínula.

Em seguida, inverta o tubo para que a resina no tubo cubra as células. Coloque o prato com o tubo no forno a 60 graus Celsius e cure por 12 horas. Quando o bloco estiver curado, remova o prato com o tubo de microcentrífuga cheio de resina anexado do forno e separe o tubo de microcentrífuga do prato.

Descarte o prato com fundo de vidro e abra cuidadosamente o tubo da microcentrífuga com uma lâmina de barbear para liberar o bloco. Usando uma lâmina de barbear, apare o bloco de modo que nada além da região de um milímetro quadrado que contém a área previamente marcada com a caneta de diamante ou tungstênio permaneça. Em seguida, monte o bloco em um ultramicrótomo e apare o bloco com uma faca de corte até que as células sejam abordadas.

Em seguida, mude para uma faca de diamante e corte seções ultrafinas de aproximadamente 50 nanômetros através das células. Pegue as seções em grades de malha de 300 de alta transmissão. Em seguida, coloque as grades em uma coer de carbono e cubra as seções com cerca de 0,2 a 0,4 nanômetros de carbono para ajudar a estabilizá-las sob o feixe de elétrons do microscópio eletrônico de transmissão.

Carregue as grades em um microscópio eletrônico de transmissão equipado com um filtro de energia. Inspecione as células nas seções usando o modo de transmissão normal de baixa ampliação e compare-as com as imagens de fluorescência tiradas anteriormente. Assim que um núcleo com um rastreamento de dano ao DNA ou focos de reparo de DNA for encontrado, mude para o modo de filtragem de energia e registre a amostra com um mapa de espessura.

Em seguida, registre as imagens de borda do mapa de fósforo com perda de energia de 175 elétrons com uma largura de fenda de 20 elétron-volts. Também registre imagens preed com perda de energia de 120 elétron-volts, também com uma largura de fenda de 20 elétron-volts para o registro de mapas de nitrogênio. Imagens de borda de postagem em 447 elétron-volts com uma largura de fenda de 35 elétron-volts e imagens pré-escritas em 358 elétron-volts.

Também com uma largura de fenda de 35 elétron-volts. Abra os mapas de proporção elementar em um software de processamento de imagem como este. Copie o mapa de nitrogênio para o canal vermelho e o mapa de fósforo para o canal verde de uma imagem RGB.

Em seguida, sobreponha e alinhe os mapas. Exporte a imagem composta como um arquivo de formato de arquivo de imagem marcado e abra a imagem em um software de processamento de imagem que possa usar camadas. Em seguida, ajuste a faixa dinâmica de cada canal redimensionando os valores mínimo e máximo na imagem para um conjunto de dados de oito bits.

Em seguida, subtraia o teor de fósforo do mapa de nitrogênio dentro da janela de camadas. Converta a imagem em uma cor indexada e crie uma tabela de pesquisa amarela no espaço de cores CMYK para o mapa mostrando a distribuição de ácidos nucleicos e uma tabela de pesquisa ciano para mostrar o mapa de proteínas sem cromatina. Em seguida, crie uma nova imagem e importe os mapas mostrando as distribuições de fósforo e proteína não cromatina como diferentes camadas.

Use o modo de transparência da tela para ver as duas camadas sobrepostas uma à outra. Aqui são mostrados mapas de razão espectroscópica de elétrons de dentro de um núcleo de célula mostrando as localizações de fósforo e nitrogênio quando os dois mapas de proporção são sobrepostos um ao outro no espaço de cores RGB. Uma imagem como a mostrada aqui é obtida nesta imagem.

As estruturas amarelas representam proteínas nucleares refletindo a presença de fósforo e nitrogênio. Aqui, a imagem espectroscópica eletrônica é usada para visualizar as mudanças na estrutura dos focos após a irradiação gama em células U2 OS. As proteínas de reparo marcadas com cereja M que expressam de forma estável na linha superior são imagens de células que não foram irradiadas.

A segunda linha mostra células que foram fixadas três horas após a radiação. A terceira linha mostra células fixadas seis horas após a radiação. A imagem espectroscópica eletrônica revela que a estrutura dos focos parece se reorganizar ao longo do tempo à medida que a quantidade relativa de 53 BP uma proteína no foco indicada pelo aumento no sinal de nitrogênio parece aumentar enquanto a cromatina indicada pelo sinal de fósforo assume uma posição mais periférica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células irradiadas que expressam proteínas mini e de reparo para analisar a ultraestrutura da cromatina em focos de reparo de DA usando imagens espectroscópicas eletrônicas. Não se esqueça de que trabalhar com tampão correlato de sódio, cianeto de potássio e óxido de ósmio pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar em uma capela e usar luvas devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.