Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

O objetivo geral deste experimento é caracterizar polissacarídeos da parede celular vegetal. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia da parede celular vegetal, incluindo estrutura e quantidade de glucomanano. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer treinamento especializado ou equipamentos caros.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a interpretação dos géis, portanto, a inclusão e a compreensão de todos os controles descritos são críticas. O resíduo alcoólico e solúvel, ou AIR, é previamente preparado a partir de material vegetal colhido, conforme descrito no protocolo de texto. Pesar seis miligramas de AR em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicionar água até uma concentração final de dois miligramas por mililitro.

Vórtice para obter uma suspensão uniforme. Alíquota de 500 microgramas em tubos de microcentrífugas. Seque as alíquotas usando uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius durante a noite.

Pré-trate o AIR incluindo uma alíquota para um controle de AIR sem enzima com um hidróxido de sódio molar por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, adicione 200 microlitros de água e 20 microlitros de ácido clorídrico molar a cada tubo para neutralizar o hidróxido de sódio. Teste se o pH é de cerca de seis a sete, removendo um microlitro e manchando-o nas tiras indicadoras de pH de papel.

Adicione 50 microlitros de tampão de acetato de amônio molar pH 6,0 e adicione água a um volume total de 500 microlitros a cada tubo. Para iniciar este procedimento, adicione uma quantidade predeterminada de mananas às alíquotas e ao tampão do AIR. Incluir controlos negativos adequados, bem como um controlo positivo.

Vortex e depois gire brevemente para coletar a mistura de reação no fundo do tubo. Incube a 37 graus Celsius com agitação suave durante a noite. No dia seguinte, pare a reação incubando a 95 graus Celsius por 20 minutos.

Centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos. Guarde o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 250 microlitros de água. Centrifugue novamente e retenha o sobrenadante.

Combine os dois sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius por cerca de três horas. Antes do procedimento de derivatização, preparar os reagentes necessários conforme descrito no protocolo de texto. Aqueça a solução estoque de ANTS 0,2 molar a 60 graus Celsius para dissolver completamente o sólido.

A cada amostra, adicione cinco microlitros de ANTS, cinco microlitros de dois-picolina-borano e 10 microlitros de tampão de derivatização. Gire brevemente para coletar no fundo do tubo, bata completamente e depois gire brevemente novamente. Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius protegidas da luz.

No dia seguinte, secar as amostras em uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius por cerca de duas horas. Ressuspenda cada amostra em oligossacarídeo padrão e 100 microlitros de uréia de três molares. Armazene a menos 20 graus Celsius protegido da luz até que seja necessário.

A montagem do equipamento de fundição em gel dependerá da marca. Para o equipamento usado nesta demonstração, um gel equivale a 50 mililitros. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, misture 20,2 mililitros de água, cinco mililitros de tampão PACE 10x, 24,6 mililitros de acrilamida 40% / Bis-acrilamida, 200 microlitros de APS e 20 microlitros de TEMED.

Inverta suavemente para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Use uma pipeta sorológica ou outra pipeta de grande volume para derramar o gel de resolução aproximadamente quatro centímetros abaixo do topo das placas de vidro. Cubra cuidadosamente o gel com álcool isopropílico.

Deixe o gel polimerizar por 20 a 30 minutos. Despeje a camada superior. Seque o excesso de líquido com papel mata-borrão.

Em seguida, faça o gel de empilhamento. Em um tubo de centrífuga de 15 mililitros, misture 6,8 mililitros de água, um mililitro de tampão PACE 10x, 2,8 mililitros de acrilamida/Bis-acrilamida, 80 microlitros de APS e oito microlitros de TEMED. Inverta para misturar e sobreponha o gel de resolução polimerizado.

Insira suavemente o pente evitando prender bolhas de ar sob os dentes do pente. Depois que o gel polimerizar, embrulhe-o em tecido úmido e depois em filme plástico e guarde a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para ajudar a acompanhar a ordem de carregamento e identificar onde estão os poços depois que o pente é removido, use um marcador permanente para rotular as posições dos poços no vidro.

Retire o pente. Encha os poços com tampão PACE de um X. Use uma microsseringa de 10 microlitros para carregar dois microlitros de padrões e amostras nos poços.

Evite usar as pistas mais externas, que tendem a executar mal as amostras e deixar uma pista vazia entre as amostras. Monte a câmara superior do aparelho de funcionamento em gel e coloque o gel em um tanque de funcionamento resfriado contendo um tampão PACE em um X. Encha a câmara superior com um amortecedor PACE de um X.

Ligue a energia e ligue o gel a 200 volts por 30 minutos. Após 30 minutos, aumente a tensão para 1.000 volts por uma hora e 40 minutos. Proteja o gel da luz.

Comece limpando o sistema de imagem em gel com um tecido úmido sem fiapos para garantir que esteja livre de poeira. Remova o gel do tanque PACE e veja brevemente enquanto o gel ainda está nas placas de vidro para determinar se a frente do corante ainda está no gel. Use uma ferramenta de cunha para abrir o gel e, enquanto o gel ainda estiver em uma placa de vidro, use um cortador de pizza para remover o gel de empilhamento e o fundo do gel se a frente do corante ainda estiver no gel.

Dispense cerca de cinco mililitros de água na superfície do transiluminador e, em seguida, transfira o gel diretamente para o transiluminador. Usando o software, defina o filtro para UV 605 e ligue o transiluminador UV de ondas longas. Tire várias imagens em vários tempos de exposição, certificando-se de desligar a luz UV entre as imagens para evitar a degradação da fluorescência.

Certifique-se de que pelo menos duas das imagens não tenham bandas saturadas. Salve os arquivos como imagens TIFF de alta resolução. Um gel representativo de um ensaio PACE padrão do conteúdo de manano da parede celular é mostrado.

As pistas um, dois e três mostram uma escada de oligossacarídeos comprados comercialmente na concentração de cinco, 10 e 50 picomoles, respectivamente. A pista quatro mostra uma digestão de mananase de glucomanano konjac que serve como um controle positivo tanto para a digestão enzimática quanto para a reação de derivatização na presença da enzima e dos sais tampão. A pista cinco mostra a impressão digital PACE de um caule de Arabidopsis do tipo selvagem.

A pista seis mostra a impressão digital PACE do caule de uma planta Arabidopsis sem a manano sintase do caule principal. Em comparação com o tipo selvagem, apenas uma pequena quantidade de manano está presente, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzidas para todos os oligossacarídeos derivados da mananase. A pista 10 mostra a impressão digital PACE da madeira de pinho que contém galactoglucomanano e tem um padrão de oligossacarídeos liberados claramente diferente do da Arabidopsis.

As raias sete, oito, nove e 11 são vários controles negativos que revelam faixas inespecíficas marcadas por asteriscos que devem ser excluídas da análise. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a estrutura do manano usando o PACE. Uma vez dominada, essa técnica pode ser aplicada a outros polissacarídeos de interesse usando diferentes glicosil hidrolases.

Tivemos sucesso na aplicação dessa técnica a muitas outras espécies de plantas, além de Arabidopsis, bem como a outras espécies não vegetais, como o manano de levedura.