Name: Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a caracterizar polissacarídeos de parede celular em plantas usando eletroforese em gel PACE. Este método acessível permite analisar estrutura e quantidade de manana sem equipamentos especializados.

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O método do ritmo foi desenvolvido e otimizado por vários membros do grupo de Dupree (Universidade de Cambridge, UK) ao longo dos anos, e agradecemos todas as suas contribuições. Este trabalho foi financiado no âmbito do Instituto de bioenergia comum DOE (http://www.jbei.org) suportado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de biológicos e investigação ambiental, através de contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Laboratório nacional de Berkeley e o departamento de energia dos EUA. Agradecemos também Thea Pick e Vy Ngo para ajuda com a preparação das amostras de csla9 .

1. colheita de Material vegetal <ol><li>colher material de planta fresco (~ 20 mg) e, imediatamente, submirja em etanol a 96% (v/v) e incubar a 70 ° C por 30 min; isto desativa qualquer parede celular presentes enzimas degradantes. Para material seco, comece pela etapa 2. 
	Cuidado: O álcool etílico é inflamável. 
	Nota: Uma única folha de haste ou Roseta irá fornecer material suficiente para análise. No entanto, menos erros surgirem se uma maior quantidade de tecido é agrupada e analisada desde que isto é mais fácil para pesar e lidar com.</li>
	<li>Registrar cuidadosamente o tipo de tecido e grau de desenvolvimento, como estrutura de polissacarídeo varia com os dois. Por exemplo, com Arabidopsis thaliana (usado aqui), fase o tecido de acordo com os métodos de Boyes et al 15 Nota: Este protocolo, usamos a metade inferior da haste da inflorescência, onde a primeira síliqua é totalmente alongada mas não amarelamento.</li></ol>
 2. preparação de álcool insolúvel resíduo (ar) <ol><li>preparar ar, seguindo o método de Mortimer et al 9 ou outro método semelhante, a fim de produzir um pó falta de açúcares solúveis, como sacarose e amido.</li>
</ol> 3. Alíquotas e pré-tratamento de ar Nota: A quantidade exata de ar necessária para cada amostra dependerá do (a) a abundância do polissacarídeo de interesse no material e (b) o tamanho médio dos oligossacarídeos, lançado pela o GH. O método adiciona uma molécula fluorescente ao final de cada oligossacarídeo, reduzindo assim o número de oligossacarídeos determina a sensibilidade do experimento. Como uma diretriz, para glucomannan no tronco de Arabidopsis digerido com GH5/GH26 (como descrito), 500 µ g é recomendado 11, Considerando que para xilana em tronco de Arabidopsis digerido com GH11, recomenda-se 100 µ g como em Mortimer &#39; estudo s 3. <ol><li>pesa ar (10-15 mg) em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionar H 2 O a uma concentração final de 2 mg/mL. Vórtice para conseguir uma suspensão mesmo. Se isto é problemático, usar um homogeneizador de vidro para ajudar neste processo.</li>
	Tubos <li>alíquota 500 µ g em microcentrífuga. Alíquotas utilizando uma centrífuga a vácuo a seco (veja a Tabela de materiais) durante a noite em 30 ° C.</li>
	<li>Pré-tratamento de ar com 1 M de NaOH (20 µ l) por 1h à temperatura ambiente; isto de acetylates os polissacarídeos e incha as microfibrilhas de celulose, rompendo a estrutura de biomassa e permitindo o acesso de GH. 
	Nota: Este passo pode ser ignorado para polissacarídeos purificados. Cuidado &#8211; ácido/base forte.
	<ol><li>Incluem uma alíquota para um controle de ar não-enzimática (tratados da mesma forma como todas as amostras, exceto passo 4.1. é excluído).</li>
	</ol></li> <li>Adicionar 200 µ l de H 2 O e 20 µ l 1m HCl para neutralizar. Teste que o pH é ~ 6-7, removendo 1 µ l e mancha-lo em tiras de papel indicador de pH.</li>
	<li>De amónio de 1m adicionar 50 µ l de tampão de acetato, pH 6.0 (ou qualquer que seja o pH é apropriado para o GHs utilizado no estudo) e H 2 O para dar um volume total de 500 µ l. 
	Nota: Acetato de amônio é usado desde que sublima-se após a secagem, e então não adiciona sal adicional à amostra. Um excesso de sal pode levar a banda-forma pobre e resolução sobre o gel ritmo.</li>
</ol> 4. Hidrólise do ar com Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: como mencionado na discussão, a pureza do GHs é crítica. Use somente heterologously expressado, afinidade purificado de enzimas. Após o recebimento de cada lote do fabricante, hidrolisar alíquotas definidas de substrato (por exemplo, 500 µ g ar) com o aumento da quantidade de GH durante a noite (por exemplo, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unidades / µ l). Quando há um excesso de GH, a impressão digital ritmo vai olhar idêntico. Um excesso de enzima é necessário para entregar um resultado reprodutível, porque deve estar certo de que a reação de hidrólise aproxima-se o ponto de extremidade.
Controle <ol><li>Adicionar uma quantidade pré-determinada (veja acima), de mannanases (GH5 e GH26 11) para as alíquotas de ar no buffer da etapa 3.5, bem como um positivo (30 µ g de glucomannan konjac) e um controle negativo não-ar (mistura de enzima em um tubo vazio). Vórtice e em seguida girar brevemente para recolher a mistura de reação no fundo do tubo.</li>
	<li>Incubar durante uma noite a 37 ° C (ou a temperatura apropriada para o GH de escolha), com agitação suave (~ 100 rpm).</li>
	<li>Parar a reação incubando a 95 ° C por 20 min. 
	Nota: Tampas de Cap podem ser usadas para selar os tubos de microcentrífuga flip-top.
	<ol><li>Centrífuga usando uma microcentrífuga de bancada superior na velocidade máxima por 10 min e reter sobrenadante.</li>
	</ol></li> <li>Resuspenda o pellet em 250 µ l H 2 O, centrífuga como acima e reter sobrenadante.</li>
	<li>Combinar ambos os sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo (veja a Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 3 h ou durante a noite sem aquecimento).</li>
</ol> 5. Elaboração de normas Oligosaccharide <ol><li>estoque de 1 mM de preparar soluções em H 2 O da manose (homem), mannobiose (homem 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (homem 4), mannopentaose (homem 5) e mannohexaose (homem 6), todos os β, 1-4 ligados. Alíquota e loja a-20 ° C até necessário.</li>
	<li>Preparar 3 diferentes concentrações de um homem mistura de 1-6, combinando 1 µ l (padrão S1), 2 µ l (S2) ou 5 µ l (S3) de todos os seis.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization de oligossacarídeos <ol><li>Prepare uma solução stock de formigas de 0,2 M (ácido 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonic) em H 2 O: ácido acético 17:3. Estoque quente a 60 ° C para dissolver completamente o sólido. Loja a-20 ° C, protegido da luz, por 2-3 meses.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 0,2 M de 2-picolina borano (2-PB) em DMSO. Isto é extremamente higroscópico, resuspenda então imediatamente todo o pó em cima do recibo em DMSO. Alíquota e loja a-20 ° C durante 1-2 anos. Descongelar as alíquotas como necessária (loja a 4 ° C, durante 2 semanas e em seguida descarte).</li>
	<li>Preparar o buffer de derivatização de H 2 O: ácido acético: DMSO às 17:03:20.</li>
	<li>Para cada amostra, adicionar 5 µ l de formigas, 5 µ l de 2-PB e 10 µ l de tampão de derivatização. Spin brevemente para coletar no fundo do tubo, vórtice completamente e em seguida girar rapidamente novamente. Veja a Figura 1 para descrição de reação.</li>
	<li>Amostras de incubar durante a noite a 37 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Seco em uma centrífuga a vácuo (ver Tabela de materiais) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Ressuspender amostras e padrão em ureia de 3M 100 µ l. Loja a-20 ° C, protegida da luz até necessária.</li>
</ol> 7. Gel de preparação do ritmo Nota: montagem do equipamento de fundição de gel vai depender da marca. Aqui, nós use um sistema de eletroforese vertical (ver Tabela de materiais), equipado com placas de vidro de 18 x 24 cm e 1,5 mm espaçadores.
<ol><li>Montar equipamento de fundição de gel pelo fabricante &#39; instruções de s.</li>
	Buffer de ritmo <li>make x 10 (1 M Tris-borato pH 8,2) como segue: Adicionar 121,14 g de Tris-Base a ~ 400 mL de H 2 O e misture para dissolver. Ajustar o pH a 8.2 por adição de ácido bórico sólido (cerca de 60 g) e em seguida fazem o volume até 1 L.</li>
	<li>Fazer um 10% (p/v) de amônio persulfato (APS) estoque em H 2 O. alíquota e armazenar em alíquotas de degelo-20 ° C. uma vez, armazenar a 4 ° C e descartar depois de 2 semanas.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de resolução. Para os equipamentos acima, 1 gel equivale a 50 mL. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, misture H 2 O (20,2 mL), 5 mL x 10 ritmo de tampão, 24,6 mL 40% acrilamida/Bis-acrilamida (29:1 acrylamide:Bis). (Atenção: tóxico).
	<ol><li>Adicionar 200 µ l de APS e 20 µ l de N, N, N, N´-tetrametil-etilenodiamina (TEMED). Inverta suavemente para misturar (para evitar a introdução de bolhas de ar). Despeje o gel usando um serológicos ou outra pipeta de grande volume, a ~ 4 cm abaixo do topo das placas de vidro. Preste atenção para a possibilidade de ficar preso no gel de bolhas de ar. Se eles fazer, parar de derramar e inclinação/torneira o gel para soltá-los.</li>
	</ol></li> <li>Sobrepor o gel com isopropanol (inflamável de precaução :) ou, cuidadosamente, com H 2 Allow O. gel para polimerizar (20-30 minutos) e, em seguida, despeje a camada superior. Se isopropanol foi usado, em seguida, lave 2 x com H 2 O. Dry qualquer excesso de líquido usando papel mata-borrão.</li>
	<li>Fazer e despeje o gel de empilhamento. Misture 6,8 mL H 2 O, 1 mL de tampão de ritmo x 10, 2,8 mL acrilamida/Bis-acrilamida (PRECAUÇÃO: tóxico), 80 µ l APS e 8 µ l de TEMED em um tubo de centrífuga de 15 mL. Inverter para misturar e sobrepor em cima do gel de resolução polimerizado. Introduza cuidadosamente os pentes, evitando armadilhas bolhas de ar sob os dentes do pente.</li>
	Gel de <li>permitir a polimerizar (20-30 min), embrulhe em tecido úmido e em seguida em filme plástico e armazenar a 4 ° C até necessária. Loja com os pentes no lugar. 
	Nota: Ritmo géis podem ser armazenados por um período máximo de 2 semanas (embora menos de 1 semana é o ideal), se eles são mantidos húmidos.</li>
</ol> 8. Executando um ritmo Gel <ol><li>usar um marcador permanente para rotular as posições bem no vidro, que ajudarão a manter o controle de ordem de carregamento, e na identificação de onde os poços são uma vez que o pente é removido.</li>
	<li>Remover o pente. Encher os poços com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Usar um 10 µ l micro-seringa carregar 2 µ l de padrões e amostras em poços. Evite usar as pistas mais externa, que tendem a executar amostras mal.</li>
	<li>Montar a câmara superior do aparato gel de execução e colocar o gel em um tanque de refrigeração (~ 10 ° C) execução (10 ° C), contendo 1 x ritmo buffer. Encha a câmara superior com buffer de ritmo 1 x.</li>
	<li>Ligue o poder e executar o gel a 200 V (constante V) por 30 minutos e depois aumento da tensão de 1000 V para 1 h 40 min. Proteger os geles de luz (por exemplo, envolvendo tanques em sacos de lixo preto). 
	Nota: Verificar os géis ~ 5 min depois de ligar a tensão e depois mais 5 min. depois de um aumento da tensão de 1.000 V. Se a bateria é incapaz de manter a tensão, então provavelmente existe um vazamento de reserva. Remova o gel do tanque. Volte a montar a câmara superior, cuidadosamente verificando o posicionamento de todas juntas. Um chip grande na borda superior da placa de vidro pode impedir a placa formando uma boa vedação com a junta. Isso geralmente pode ser temporariamente resolvido adicionando uma gota de agarose fundido de 5% (p/v) para a parte lascada do vidro, antes de adicionar a câmara superior.</li>
</ol> 9. Visualizando um gel de ritmo Nota: Use um gel sistema equipado com lâmpadas de UV de ondas longas no transiluminador e um filtro de emissão para a câmera que é apropriado para o fluoróforo, aqui 530 nm de imagem. Alternativamente, um scanner a laser também pode ser utilizado, conforme descrito em Goubet 2.
<ol><li>Certifique-se de gel sistema de imagem é livre de poeira, limpando-a com tecido úmido fiapos.</li>
	<li>Remover o gel do tanque de ritmo e ver os brevemente, enquanto que o gel é ainda nas placas de vidro (&#60; 80 ms) para determinar se a frente de tintura é ainda no gel.</li>
	<li>Abrir o gel usando uma ferramenta de cunha e enquanto o gel é ainda na placa de um vidro, use um cortador de pizza para remover tanto o gel de empilhamento e, se a frente de tintura é ainda no gel, parte inferior do gel.</li>
	<li>Coloque a superfície do transiluminador ~ 5 mL H 2 O e depois transferir o gel diretamente sobre o transiluminador. Definir o filtro de UV 605 e ative o transiluminador UV de ondas compridas (ver Tabela de materiais) usando o software. 
	Nota: O formigas fluoróforo usado aqui tem uma excitação/emissão de 353/520 nm.</li>
	<li>Tirar várias fotos em vários tempos de exposição (por exemplo, 100 ms a 10 s). Certifique-se de que a luz UV é desligada entre imagens clicando no botão de luz de UV (para desligá-lo) para evitar a degradação da fluorescência. Garantir que pelo menos 2 das imagens não saturadas bandas (o gel software de imagem irá indicar isto).</li>
	<li>Salve arquivos como imagens de alta-resolution.tif. 
	Nota: Imagens podem ser analisadas usando o software fornecido com o sistema de imagem de gel, ou usando o software de análise de imagem livremente disponíveis, tais como ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Consulte a seção de resultados para uma discussão de quantificação.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

RITMO é um método simples para caracterizar a estrutura de polissacarídeos. Pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem conhecidas GHs com atividade caracterizada, ver inúmeros exemplos na literatura1,6,9,11. TT também foi aplicado para a caracterização do romance GHs12,13,18 e glycosyltransferases9, fazendo uso de substratos de polissacarídeo definidos e aceitadores.
Resultados reprodutíveis, interpretáveis são dependentes em três etapas-chave. Primeiro, o GHs usado deve ser livre de contaminar as atividades. Isto é melhor alcançado usando apenas heterologously expressa, afinidade purified enzimas. Em segundo lugar, para a maioria dos experimentos, é importante que a hidrólise enzimática de substratos é na conclusão. Isso garantirá que a mesma biomassa hidrolisada com o GH mesmo dá a mesma impressão em cada experimento. Finalmente, deve haver um excesso de fluoróforo na reação de derivatização. Isso garante que as extremidades reduzindo disponíveis são rotuladas em perto de 100%. Isso resultará em alta reprodutibilidade dos resultados, bem como os dados quantitativos.
Gel e reagente de qualidade são essenciais para garantir os dados podem ser reproduzidos. Buffers de má qualidade, especialmente de pH incorreto, bolhas no gel de ar, e amostras com excesso de sal podem todos afetam fator resolução e retenção dos oligossacarídeos. No entanto, inclusão dos controles recomendados descritos na seção de protocolo e resultados permitirá solução de problemas.
RITMO é limitado pela sua capacidade de identificar oligossacarídeos. Para algumas experiências, uma impressão digital simples é tudo que é necessário. Contudo, para verdadeiramente dosar a quantidade de glucomannan em uma amostra de ar, por exemplo, a identidade de todos os oligossacarídeos lançados seja necessária, que é um processo demorado. Isto é mais simples para menos polissacarídeos complexos como xilana3. Uma vez que existem alguns padrões de oligossacarídeo comercialmente disponível, pode não ser sempre possível ou desejável para identificar todas as bandas. Neste caso, o ritmo pode fornecer dados muito elogioso para espectrometria de massa (ou seja, MALDI-CID9 ou ESI-MS7e NMR6). Para esses métodos, muitas vezes é útil fazer uma preparação em grande escala, separados por cromatografia de exclusão de tamanho e em seguida analisar cada fração por ambos ritmo antes da MS ou NMR. Enquanto tem sido relatado que bandas podem ser extirpadas e identificadas por MALDI-CID, na prática, constatámos que isso tem uma baixa taxa de sucesso (possivelmente devido a interações dos oligossacarídeos, etiquetados com o gel do acrilamido quando exposto à luz UV).
A outra limitação importante do ritmo é a taxa de transferência. Para ter boa qualidade, géis interpretáveis com os controles apropriados, cada gel terá somente ~ 10 amostras experimentais, e um pesquisador pode esperar para executar géis de ritmo ~ 4 por dia. Recentemente, uma versão do ritmo utilizando eletroforese capilar (CE) tem sido desenvolvido,19, que permite a preparação de amostras em placas de 96 poços. Ele tem sido usado com sucesso para caracterizar as atividades de enzima glycosyltransferase e polissacarídeo estruturas6,19, ainda requer acesso a uma máquina de CE, o que pode ser caro para comprar e manter.

Polissacarídeo análise por eletroforese em gel (PACE) é um método para a caracterização detalhada dos polissacarídeos1,2,3. Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros.
Estrutura de polissacarídeos da parede celular de plantas compreensão é necessária que os pesquisadores explorando a biossíntese da parede celular de planta ou o papel de parede da célula vegetal no desenvolvimento da planta. Recentemente, no entanto, composição de parede celular planta tornou-se interessante para um grupo maior de pesquisadores devido o foco sobre o uso de biomassa vegetal (essencialmente a parede celular) como uma matéria-prima para produzir biocombustíveis e bioquímicos4. Como exemplo, sacarificação enzimática eficiente deste material requer um entendimento detalhado das estruturas polissacarídeo, para que otimizado coquetéis enzimáticos podem ser selecionados5.
RITMO tem várias vantagens sobre métodos alternativos que o tornam ideal para a análise rápida de estruturas complexas glicano. Em primeiro lugar, não requer purificação do polissacarídeo em questão, como é necessário para a solução de ressonância magnética nuclear (NMR) estado6. Em segundo lugar, o ritmo pode resolver isómeros estruturais, ao contrário de espectrometria de massa (MS, por exemplo, assistida por matriz laser dessorção/ionização (MALDI) e ionização electrospray (ESI)), que também pode ser um desafio para executar por cromatografia líquida (LC) 7. em terceiro lugar, o ritmo é muito sensível, com resolução baixa-picomole, ao contrário da cromatografia de camada fina (TLC) ou a cromatografia em papel. Finalmente, não exige conhecimento caro de equipamento ou especialista, como é o caso de MS, NMR e LC.
O método de ritmo depende da especificidade da glycosyl hydrolase (GH) enzimas, que têm como alvo certas ligações glicosídicas em uma mistura de polissacarídeos. Quando a enzima GH atua na cadeia de polissacarídeo, revela um redução final que pode então ser quimicamente derivatizado, neste caso com uma etiqueta fluorescente. A mesmo porção da amostra é processada portanto indetectável por esse método. Oligossacarídeos etiquetados são então separados em um gel do acrilamido do grande-formato por eletroforese. Isso dá excelente resolução de moléculas muito semelhantes, por exemplo, os trissacarídeos Glc-homem-homem e homem-Glc-Glc terá um diferente Rf.
RITMO tem sido amplamente utilizado para caracterizar estruturas de xilana diferentes em toda a espécie de planta8, para identificar os mutantes glycosyltransferase em Arabidopsis6,9,10,11 , para realizar ensaios de glycosyltransferase9e para caracterizar o romance GH atividades12,13. Recentemente, também usamos isso para caracterizar Medeiros de parede celular de levedura (Mahboubi e Mortimer, em preparação). Aqui nós descrevemos um método para caracterizar a estrutura de glucomannan da parede celular vegetal, com base em anteriores relatórios11,14.

<table><tbody><tr><td>Oligosaccaharide Standards</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomanano (Konjac; Baixa viscosidade)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Outras especialidades químicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaftaleno-1,3,6-ácido trissulfônico</td> <td>(sondas moleculares) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picolina borano</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilamida / Bis-acrilamida (29: 1 acrilamida: Bis)</td> <td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr> <tr><td> Nome</td> <td> Empresa </td> <td> Número de catálogo</td> <td> Comentários < / strong</td></tr> <tr><td>> Specialty Equipment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de fundição em gel</td><td>Kit Hoefer</td><td>SE660</td><td>18x24 cm placas de vidro, espaçadores de 0,75 mm</td></tr><tr><td>Resfriamento de banho de água recirculante&nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Precisa ser capaz de manter a temperatura em ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Peça com filtros apropriados para fluorforo, e o transiluminador deve ser equipado com lâmpadas UV de onda longa</td></tr> Pacote <tr><td>de Energia de Alta Tensão</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga a vácuo(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Sistema vertical de eletroforese em gel</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>Glicosyl hydrolases</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podem ser obtidos de empresas, por exemplo, Megazyme (https://www.megazyme.com/) ou Prozomix (http://www.prozomix.com/), ou podem ser expressos internamente solicitando o plasmídeo da pesquisa relevante grupo.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Suprimentos de laboratório</td>Tubo de centrífuga de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml (tubos de centrífuga Falcon, polipropileno, estéril, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 ml (Tubos de centrífuga Falcon, polipropileno, estéril, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td>Software de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagem em gel (Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular medeiros em plantas usando a ritmo

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Polissacarídeos de parede celular de plantas são notoriamente difíceis de analisar, e a maioria dos métodos requerem equipamento caro, operadores qualificados e grandes quantidades de material purificado. Aqui, descrevemos um simples método para obter um polissacarídeo estrutural informações detalhadas, incluindo resolução de isômeros. Para análise de polissacarídeo por eletroforese em gel (PACE), material de parede celular vegetal é hidrolisado com glycosyl hidrolases específicas para o polissacarídeo de interesse (por exemplo, mannanases de Medeiros). Géis de poliacrilamida de grande formato são usados para separar lançados oligossacarídeos, que tem sido rotulados fluorescente. Géis podem ser visualizados com um gel modificado sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais). Digitais de oligossacarídeo resultante também podem ser comparadas qualitativamente ou, com replicação, quantitativamente. Enlace e ramificação de informações podem ser estabelecidas usando hidrolases glycosyl adicionais (por exemplo, mannosidases e galactosidases). Enquanto este protocolo descreve um método para analisar a estrutura de glucomannan, pode ser aplicado a qualquer polissacarídeo para os quais existem glycosyl caracterizadas hidrolases. Alternativamente, pode ser usada para caracterizar o romance glycosyl hidrolases utilizando substratos de polissacarídeo definidos.

Aqui, nós mostramos um gel de ritmo de exemplo executado por protocolo, juntamente com descrições para ajudar com a interpretação de dados e solução de problemas, e este é seguido por um guia geral para sucesso ritmo gel de interpretação13,16. Um gel representativo de um ritmo padrão ensaio do conteúdo de parede celular Medeiros é mostrado na Figura 2e é descrito a faixa por faixa.
Normas Faixas 1, 2 e 3 mostram uma escada de oligossacarídeos adquiridos comercialmente (homem1- homem6) em 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentração. Ao receber um lote novo de um oligossacarídeo comercial, é importante verificar a pureza em um gel. Muitos oligossacarídeos, particularmente tetrasacccharides e mais, pode ter uma contaminação significativa com oligossacarídeos de outros graus de polimerização (DPs), como mostrado aqui para homem6 (marcados com *). Enquanto dosar um gel, é importante ter pelo menos 3 concentrações dos padrões, uma vez que é necessário para calcular a curva padrão. Cálculo da curva padrão também pode ser útil para garantir que a reação de derivatização é essencialmente na conclusão. Padrões de concentrações conhecidas permitem comparações entre géis e são um controle útil para separação de qualidade e qualidade de derivatização.
Controlo positivo Lane 4 mostra uma digestão mananase de glucomannan konjac. Glucomannan konjac é disponível comercialmente, e enquanto não tem a mesma estrutura que, por exemplo, encontrados em Arabidopsis, serve dois propósitos. Em primeiro lugar, é um controle importante para a digestão enzimática. O pesquisador deve estabelecer como um substrato comercial digerido com seus GHs de escolha parece quando digerido a conclusão (ou seja, um grande excesso de GH é adicionado para a reação). Se no futuro as experiências altera o padrão, isso pode indicar uma perda de atividade ou contaminação da unidade populacional de GH. Em segundo lugar, ele serve como um controle para a reação de derivatização na presença de sais de enzima e o tampão. Se as normas de boas aspecto, mas o controle positivo é pobre, então isso pode indicar que um componente da reação de hidrólise é inibitório para a derivatização.
Haste de Arabidopsis tipo selvagem (WT) ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 5 Lane mostra a impressão digital de ritmo de um tronco de Arabidopsis WT (compare com referências11,14).
csla9 Haste de Arabidopsis ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) 6 Lane mostra mostra a impressão digital de ritmo da haste de um Arabidopsis plantar falta o major Medeiros sintase11-tronco. Compare o WT e controlo negativo impressões digitais. Enquanto a maioria do Medici está ausente nesta fábrica, permanece uma quantidade pequena, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzida para todos os derivados de mananase oligossacarídeos isto é sintetizado pelas sintases Medeiros adicionais (CSLA2, 3)11.
Controle negativo - enzima apenas 8 Lane mostra bandas no gel que não são específicas de que derivam dos contaminantes o mananase cocktail e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo - WT somente AIR 9 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Controle negativo- csla9 Somente AIR 10 Lane mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Pinho de madeira ar + mananase cocktail (GH5 + GH26) Lane 7 mostra a impressão digital de ritmo de madeira de pinho, que contém galactoglucomannan. Isto claramente tem um padrão diferente de oligossacarídeos liberados de Arabidopsis, devido à sua estrutura diferente.
Controle negativo - pinho somente AIR Lane 11 mostra bandas no gel que não são específicos e devem ser excluídas da análise (marcados com *).
Interpretar um gel de ritmo é relativamente simples, mas requer a conscientização dos pontos seguintes. De dados robusto, é recomendável efectuar ritmo pelo menos 3 independentemente crescido biológica Replica, e recomenda-se realizar pelo menos 2 repetições de técnicas em cada replicar biológica. Os controles descritos são essenciais para a interpretação, como faixas não específicas devam ser excluídos. Também recomendamos carregar amostras em uma ordem diferente em replicar geles, para excluir os efeitos que resultam de iluminação desigual pelo transiluminador. Exata interpretação requer análise das bandas que não estão saturados. Como algumas impressões de oligossacarídeo podem conter ambos os polissacarídeos abundância muito alta e baixa, recomendamos analisar várias exposições do gel mesmo. Os padrões podem ser usados para normalizar entre diferentes imagens.
Para alguns tipos de experimentos, pode ser desejável para quantificar a quantidade de polissacarídeo em preparação o ar. Enquanto é possível quantificar de um gel de ritmo, exige o conhecimento da identidade molecular exata de cada oligossacarídeo lançado pelo GHs e onde ele está localizado no gel o ritmo. Isso atualmente não é totalmente conhecido por Medeiros, mas foi determinado para outros polissacarídeos , por exemplo, xilana3. Os padrões fornecem uma maneira de normalizar entre géis, mesmo quando a quantificação não está sendo executada e assim ajudará em qualquer análise qualitativa ou semi-quantitativa.
Identificar a estrutura de oligossacarídeos individuais pode ser conseguido usando coquetéis de GHs. Sequential adição de mais GHs pode revelar detalhes sobre o estabelecimento de vínculos e substituições dos oligossacarídeos liberados (por exemplo, adição de β - 1,4 - glicosidase que age na extremidade não redutora irá revelar quais oligossacarídeos na mistura contenham esse recurso). As enzimas disponíveis incluem galactosidases, glucuronidases e glucosidases (consulte o banco de dados CAZy16 para obter informações adicionais); Ver Hogg, d. et al . 17 como exemplo.
O protocolo acima pode ser usado para caracterizar a atividade do GHs desconhecidos. Neste caso, uma biomassa definida, tais como Arabidopsis haste ou konjac glucomanano, deve ser usada para a tela o GHs desconhecido13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Isto mostra o esquema para o fluorescente derivatização de oligossacarídeos com formigas. Modificado da Goubet2.<a href="//ecsource.jov%20href="></a>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel de ritmo representativo mostrando a impressão digital Medeiros de Arabidopsis, pinheiros e um mutante de Arabidopsis (csla9) que tem comprometido a biossíntese de Medeiros. AlR foi hidrolisada com um cocktail de mananase e oligossacarídeos liberados foram derivatizados com um fluoróforo. Os oligossacarídeos foram separados por eletroforese em gel com base no tamanho, forma e carga. Uma escada de manno-oligossacarídeos (Man1-6) é mostrada para ajudar a identificar mobilidades relativas dos oligossacarídeos, lançados, e uma hidrólise de Medeiros purificado (derivado de konjac) é mostrada como um controle positivo. * = faixas não específicas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Um protocolo para a análise estrutural de polissacarídeos por eletroforese em gel (PACE), usando Medeiros como um exemplo, é descrito.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar polissacarídeos da parede celular vegetal. Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia da parede celular vegetal, incluindo estrutura e quantidade de glucomanano. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer treinamento especializado ou equipamentos caros.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a interpretação dos géis, portanto, a inclusão e a compreensão de todos os controles descritos são críticas. O resíduo alcoólico e solúvel, ou AIR, é previamente preparado a partir de material vegetal colhido, conforme descrito no protocolo de texto. Pesar seis miligramas de AR em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicionar água até uma concentração final de dois miligramas por mililitro.Vórtice para obter uma suspensão uniforme. Alíquota de 500 microgramas em tubos de microcentrífugas. Seque as alíquotas usando uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius durante a noite.Pré-trate o AIR incluindo uma alíquota para um controle de AIR sem enzima com um hidróxido de sódio molar por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, adicione 200 microlitros de água e 20 microlitros de ácido clorídrico molar a cada tubo para neutralizar o hidróxido de sódio. Teste se o pH é de cerca de seis a sete, removendo um microlitro e manchando-o nas tiras indicadoras de pH de papel.Adicione 50 microlitros de tampão de acetato de amônio molar pH 6,0 e adicione água a um volume total de 500 microlitros a cada tubo. Para iniciar este procedimento, adicione uma quantidade predeterminada de mananas às alíquotas e ao tampão do AIR. Incluir controlos negativos adequados, bem como um controlo positivo.Vortex e depois gire brevemente para coletar a mistura de reação no fundo do tubo. Incube a 37 graus Celsius com agitação suave durante a noite. No dia seguinte, pare a reação incubando a 95 graus Celsius por 20 minutos.Centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos. Guarde o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 250 microlitros de água. Centrifugue novamente e retenha o sobrenadante.Combine os dois sobrenadantes e seque em uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius por cerca de três horas. Antes do procedimento de derivatização, preparar os reagentes necessários conforme descrito no protocolo de texto. Aqueça a solução estoque de ANTS 0,2 molar a 60 graus Celsius para dissolver completamente o sólido.A cada amostra, adicione cinco microlitros de ANTS, cinco microlitros de dois-picolina-borano e 10 microlitros de tampão de derivatização. Gire brevemente para coletar no fundo do tubo, bata completamente e depois gire brevemente novamente. Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius protegidas da luz.No dia seguinte, secar as amostras em uma centrífuga a vácuo a 30 graus Celsius por cerca de duas horas. Ressuspenda cada amostra em oligossacarídeo padrão e 100 microlitros de uréia de três molares. Armazene a menos 20 graus Celsius protegido da luz até que seja necessário.A montagem do equipamento de fundição em gel dependerá da marca. Para o equipamento usado nesta demonstração, um gel equivale a 50 mililitros. Em um tubo de centrífuga de 50 mililitros, misture 20,2 mililitros de água, cinco mililitros de tampão PACE 10x, 24,6 mililitros de acrilamida 40% / Bis-acrilamida, 200 microlitros de APS e 20 microlitros de TEMED.Inverta suavemente para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Use uma pipeta sorológica ou outra pipeta de grande volume para derramar o gel de resolução aproximadamente quatro centímetros abaixo do topo das placas de vidro. Cubra cuidadosamente o gel com álcool isopropílico.Deixe o gel polimerizar por 20 a 30 minutos. Despeje a camada superior. Seque o excesso de líquido com papel mata-borrão.Em seguida, faça o gel de empilhamento. Em um tubo de centrífuga de 15 mililitros, misture 6,8 mililitros de água, um mililitro de tampão PACE 10x, 2,8 mililitros de acrilamida/Bis-acrilamida, 80 microlitros de APS e oito microlitros de TEMED. Inverta para misturar e sobreponha o gel de resolução polimerizado.Insira suavemente o pente evitando prender bolhas de ar sob os dentes do pente. Depois que o gel polimerizar, embrulhe-o em tecido úmido e depois em filme plástico e guarde a quatro graus Celsius até que seja necessário. Para ajudar a acompanhar a ordem de carregamento e identificar onde estão os poços depois que o pente é removido, use um marcador permanente para rotular as posições dos poços no vidro.Retire o pente. Encha os poços com tampão PACE de um X. Use uma microsseringa de 10 microlitros para carregar dois microlitros de padrões e amostras nos poços.Evite usar as pistas mais externas, que tendem a executar mal as amostras e deixar uma pista vazia entre as amostras. Monte a câmara superior do aparelho de funcionamento em gel e coloque o gel em um tanque de funcionamento resfriado contendo um tampão PACE em um X. Encha a câmara superior com um amortecedor PACE de um X.Ligue a energia e ligue o gel a 200 volts por 30 minutos. Após 30 minutos, aumente a tensão para 1.000 volts por uma hora e 40 minutos. Proteja o gel da luz.Comece limpando o sistema de imagem em gel com um tecido úmido sem fiapos para garantir que esteja livre de poeira. Remova o gel do tanque PACE e veja brevemente enquanto o gel ainda está nas placas de vidro para determinar se a frente do corante ainda está no gel. Use uma ferramenta de cunha para abrir o gel e, enquanto o gel ainda estiver em uma placa de vidro, use um cortador de pizza para remover o gel de empilhamento e o fundo do gel se a frente do corante ainda estiver no gel.Dispense cerca de cinco mililitros de água na superfície do transiluminador e, em seguida, transfira o gel diretamente para o transiluminador. Usando o software, defina o filtro para UV 605 e ligue o transiluminador UV de ondas longas. Tire várias imagens em vários tempos de exposição, certificando-se de desligar a luz UV entre as imagens para evitar a degradação da fluorescência.Certifique-se de que pelo menos duas das imagens não tenham bandas saturadas. Salve os arquivos como imagens TIFF de alta resolução. Um gel representativo de um ensaio PACE padrão do conteúdo de manano da parede celular é mostrado.As pistas um, dois e três mostram uma escada de oligossacarídeos comprados comercialmente na concentração de cinco, 10 e 50 picomoles, respectivamente. A pista quatro mostra uma digestão de mananase de glucomanano konjac que serve como um controle positivo tanto para a digestão enzimática quanto para a reação de derivatização na presença da enzima e dos sais tampão. A pista cinco mostra a impressão digital PACE de um caule de Arabidopsis do tipo selvagem.A pista seis mostra a impressão digital PACE do caule de uma planta Arabidopsis sem a manano sintase do caule principal. Em comparação com o tipo selvagem, apenas uma pequena quantidade de manano está presente, como evidenciado pelas intensidades de banda reduzidas para todos os oligossacarídeos derivados da mananase. A pista 10 mostra a impressão digital PACE da madeira de pinho que contém galactoglucomanano e tem um padrão de oligossacarídeos liberados claramente diferente do da Arabidopsis.As raias sete, oito, nove e 11 são vários controles negativos que revelam faixas inespecíficas marcadas por asteriscos que devem ser excluídas da análise. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a estrutura do manano usando o PACE. Uma vez dominada, essa técnica pode ser aplicada a outros polissacarídeos de interesse usando diferentes glicosil hidrolases.Tivemos sucesso na aplicação dessa técnica a muitas outras espécies de plantas, além de Arabidopsis, bem como a outras espécies não vegetais, como o manano de levedura.

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Biomassa vegetal é um recurso de carbono neutro principais renováveis, que poderiam ser usados ​​para a produção de biocombustíveis. Biomassa vegetal consiste principalmente das paredes das células, um material estruturalmente complexo composto chamado lignocelulose. Aqui nós descrevemos um protocolo para uma análise abrangente do conteúdo e composição dos carboidratos da parede derivadas.

Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

A celulose cristalina é um constituinte importante da parede celular da planta. No entanto, sua quantificação em uma resolução celular é tecnicamente desafiadora.  Aqui, relatamos o uso de tecnologia de luz polarizada e seções de choque radicular para obter informações da composição da parede celular em uma resolução espaço-temporal.

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Este protocolo descreve as técnicas específicas usadas para a caracterização estrutural da(s) sequência(s) glicosila(s) final(is) e da região interna redutora(s) de heteroxilanas, marcando o ER com 2 aminobenzamida antes da hidrólise enzimática (endoxilanase) e, em seguida, análise dos oligossacarídeos resultantes usando espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

Este protocolo visa apresentar um método geral para visualizar lignina, celulose e hemicelulose em paredes celulares de plantas usando imagem de Raman e análise multivariada.

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

Um protocolo para a preparação de 13C,15amostras de fungos e plantas N-etiquetados para investigações de polarização nuclear dinâmica (DNP) e espectroscopia NMR Solid-State multidimensional é apresentado.

Preparação de fungos e materiais vegetais para a elucidação estrutural usando polarização Nuclear dinâmica NMR Solid-State

Este protocolo descreve em detalhes como o material vegetal para imunolocalização de proteínas e pectinas arabinogalactanas é fixado, embutido em uma resina acrílica hidrofílica, seccionada e montada em lâminas de vidro. Mostramos que epítopos relacionados à parede celular serão detectados com anticorpos específicos.

Imunolocalização fluorescente de proteínas árabes e pectinas na parede celular de tecidos vegetais

Este protocolo descreve um método microscopical para detectar pectina na interação café-fungo.

Método de coloração dupla para detectar pectina na interação planta-fungo

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Aprenda a caracterizar polissacarídeos de parede celular em plantas usando eletroforese em gel PACE. Este método acessível permite analisar estrutura e quantidade de manana sem equipamentos especializados.

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

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