LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a proteômica em tiro ao alvo para caracterizar e quantificar produtos endógenos de desaminação de glutamina e asparagina em proteomas complexos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais em bioquímica, como a influência de processadores espontâneos e antimatéricos sobre o produto isométrico gluteo da desaminação de glutamina e asparagina. A principal vantagem desta técnica é que os isômeros de desaminação de glutamina são separados em uma coluna capilar de troca iônica de grande comprimento, maximizando a capacidade de separar peptídeos pelos seus pontos iselétricos.

Para iniciar a construção da coluna, suspenda 50 miligramas de material de empacotamento de troca aniônica fraca em 3,5 mililitros de isopropanol 90% em água. Fixe uma conexão fêmea a fêmea, um microferal e uma porca fêmea em uma extremidade de um comprimento de 50 centímetros de tubo peak com diâmetro interno de 200 micrômetros. Coloque uma tela de 1/16 de polegada com poros de um micrômetro na extremidade do tubo dentro do microferal.

Usando uma bomba de pressão ajustada para 4.500 psi, empacote a troca aniônica no interior do capilar até que o material seja visível na extremidade superior. Acople outro conector fêmea-fêmea, microferal e porca fêmea na extremidade superior do capilar empacotado, na ponta oposta, para finalizar a montagem da coluna. Lave 50 a 100 miligramas de tecido com solução salina tamponada com fosfato durante cinco minutos.

Repita esta lavagem duas vezes e, em seguida, coloque o tecido lavado em tubos com tampas de segurança. Adicione a cada tubo uma quantidade equivalente em peso de esferas de aço inoxidável e 2,5 volumes equivalentes de uma solução aquosa de acetato de amônio 100 milimolar com 1% de desoxicolato de sódio. Homogeneíze o tecido na intensidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, centrifugue o homogenato por dez minutos a 10.000 x g e 4 graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Continue homogeneizando e centrifugando o pellet tecidual, combinando os sobrenadantes a cada vez até que nenhum pellet seja observado.

Quantifique a concentração de proteína nos sobrenadantes combinados utilizando um ensaio de ácido bicinconínico. Em seguida, adicione ao homogenato uma solução um molar de ditiotreitol em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma concentração de ditiotreitol de dez milimolar na amostra. Incube o homogenato em banho-maria a 60 graus Celsius por trinta minutos.

Adicione ao homogeneizado uma solução um molar de iodoacetamida em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma concentração de iodoacetamida de 20 milimolar na amostra. Incube o homogeneizado à temperatura ambiente na ausência de luz por 45 minutos. Em seguida, dilua o homogeneizado com dois volumes equivalentes de uma solução dez milimolar de dithiotreitol em acetato de amônio 100 milimolar.

Incube o homogenato a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione ao homogenato um volume suficiente de tripsina modificada de grau de sequenciamento em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma proporção proteína-enzima de 1 para 50 em peso na amostra. Incube a amostra a 30 graus Celsius durante a noite para digerir o homogenato.

Quenche a digestão com 0,5% do peso da amostra de ácido fórmico, precipitando os sais de desoxicolanato de sódio. Vortexe suavemente as amostras contendo sais de SDC e, em seguida, centrifugue as amostras por dez minutos a 12.000 × g e quatro graus Celsius. Decante o sobrenadante para um novo tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de sais de SDC.

Redissolva os sais em uma solução aquosa de hidróxido de amônio a 0,5% em volume, agitando vigorosamente em vórtex. Condicione uma cartela de sorvente C-18 de um grama com 5 mililitros de acetonitrila, seguidos por cinco mililitros de ácido trifluoroacético a 0,1% em água. Em seguida, aplique a amostra digerida na cartela.

Lave as amostras de três a cinco vezes com porções de cinco mililitros de TFA 0,1%. Em seguida, dilua os peptídeos com cinco mililitros de uma solução aquosa contendo 75% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico. Seque o fluido em um concentrador a vácuo.

Adicione 200 microlitros de acetonitrila 75%, com 0,1% de ácido fórmico, ao resíduo. Agite a mistura em vórtex por pelo menos dez minutos e, em seguida, sonique a mistura por pelo menos 30 minutos para reconstituir os peptídeos secos. Dilua a amostra conforme necessário, de modo que a amostra injetada contenha de um a três microgramas de proteína.

Conecte a coluna capilar LAX a um instrumento de cromatografia líquida de ultra alta pressão. Prepare soluções de ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila. Ajuste a vazão para 0,4 microlitros por minuto e configure uma corrida em gradiente de 1.200 minutos.

Configure os eventos de varredura do espectrômetro de massas para alternar a aquisição de dados entre espectrometria de massa por transformada de Fourier completa e espectrometria de massas tandem por transformada de Fourier. Realize a MS/MS LERLIC para separar e caracterizar os peptídeos. Utilize os dados resultantes e um software proteômico para realizar uma busca em banco de dados de proteínas.

Exporte os resultados da busca no banco de dados para um software de planilha eletrônica. Identifique e extraia a lista de peptídeos desamidados e os peptídeos correspondentes não desamidados. Extraia os cromatogramas de íons de cada um desses peptídeos com tolerância de massa de cinco partes por milhão.

Inspecione os cromatogramas de íons extraídos para detectar a ilusão de pico duplo separado de produtos isoméricos. Utilizando a espectrometria de massas LERLIC em tandem, isoformas desamidadas de glutamina e asparagina foram separadas e identificadas a partir de uma amostra proteica em dois tempos de retenção diferentes. Resíduos intermediários de glutamina modificados enzimaticamente na transamidação, apresentando uma razão gama alfa glutamila invertida, foram identificados.

O intermediário succinimida em resíduos de asparagina também foi identificado com este método. Como as condições levemente ácidas de processamento da amostra estabilizam o intermediário succinimida. Isso sugere que a técnica LERLIC MS/MS pode ser aplicada ao estudo em proteoma inteiro de intermediários succinimida.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em bioquímica caracterizarem a desamidação de proteínas em contextos que vão da arqueologia à pesquisa biomédica.