Name: LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a caracterizar e quantificar isoformas de desamidação de glutamina e asparagina usando LERLIC-MS/MS e shotgun proteomics. Este método avança o estudo de processos bioquímicos em proteomas complexos.

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Este trabalho foi em parte apoiado por subsídios do Ministério da Educação de Cingapura (Tier 2: Conceder ARC9 / 15), National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0003-2016) e NTU-NHG Aging Research Grant ( Grant ARG / 14017). Nós gostaríamos de expressar nossa gratidão e mais sinceros agradecimentos ao Dr. Andrew Alpert e equipe PolyLC para gentilmente nos cedeu os materiais de embalagem que tornaram possível este estudo.

1. Embalagem O ani-intercâmbio de longa-metragem Coluna (LAX) Capilar (Nota: Embora a coluna LAX pode estar em casa-embalados como descrevemos neste protocolo, LAX colunas estão também disponíveis comercialmente, ver Tabela de Materiais e Reagentes para mais detalhes). <ol><li> Suspender 50 mg de material de embalagem de permuta aniónica fraca em 3,5 mL de tampão de embalagem (Tabela 1) para preparar a suspensão. </li><li> Montar a extremidade da coluna capilar (50 cm de comprimento - 200 um de diâmetro interno (ID) tubo) utilizando uma fêmea-para-encaixe fêmea, um ferule e uma porca fêmea. Coloque um ecrã de 1/16&quot; OD de 1 micron de tamanho de poros no interior do encaixe fêmea-para-feminino (Nota:. O ecrã utilizado aqui deve ter tamanho de poro mais pequeno do que o tamanho de partícula do material de embalagem para evitar a fuga do material a partir da coluna). </li><li> Embalar o capilar com a pasta, usando uma bomba de pressão operado a 4500 psi. (Nota: Embale o column até que o material de embalagem é visível na entrada da coluna). </li><li> Montar a outra extremidade da coluna capilar como descrito no ponto 1.2. </li></ol> Preparação 2. Amostra Este protocolo descreve a aplicação de LERLIC-MS / MS para analisar tecidos cerebrais humanos como modelo proteoma. (Nota: Em caso de utilizar outros tecidos ou amostras proteomic, os procedimentos de preparação da amostra deve ser adaptado.) <ol><li> homogeneização do tecido: uma. tecidos cerebrais de lavagem (50 a 100 mg) com solução de tampão fosfato de 1x, durante cinco minutos, três vezes. b. Homogeneizar o tecido em 1: 1: 2,5 tecido / esferas metálicas / tampão de homogeneização SDC (Tabela 2) proporção (w / w / v) durante 5 min a 4 ° C em tubos de cofre-bloqueio com a máxima intensidade utilizando um homogeneizador de tecidos. (Nota: tampão de homogeneização SDC podem incluir inibidores de protease como anteriormente indicado em 3) c. Centrifugar o homogenado de tecido, obtida from o passo anterior, a 10000 x g, 4 ° C durante 10 minutos e recolher o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. d. Repetir os passos bc para os peletes remanescentes e combinar os sobrenadantes tantas vezes quanto necessário, até que nenhum sedimento é observada. (Nota: Se você tem de repetir os passos bc mais de duas vezes, mover a amostra e as contas para um novo tubo de seguro-lock para evitar a perda de amostra durante a etapa de centrifugação). e. Quantificar a concentração de proteína dos homogenatos obtidos por ensaio de ácido bicinconínico (BCA) 12. </li><li> O desoxicolato de sódio (SDC) -assisted em solução de digestão tríptica 13 de homogeneizados de cérebro. uma. Adicionar uma concentração final de ditiotreitol 10 mM (DTT) (utilizando a solução estoque indicado em Solução 5 da Tabela 3) para o homogenato obtido para iniciar a redução de ligações dissulfureto proteína. b. Incubar o homogeneizado durante 30 minutos num banhopré-programada para 60 ° C. c. Adicionar ao homogenato numa concentrao final de iodoacetamida 20 mM (IAA), utilizando a solução estoque indicado em Solução 7 da Tabela 4. d. Incubar o homogeneizado contendo IAA à temperatura ambiente no escuro durante 45 min. e. Dilui-se a homogenato de cérebro de dois-se dobra usando tampão de diluição (solução a 6 da Tabela 3). f. Incubar a amostra por um segundo passo de redução durante 30 min a 37 ° C. g. Adicionar tripsina de grau de sequenciação modificado dissolvido em Solução 2 da Tabela 2 a 1:50 proporção entre proteína e para a enzima (w / w). h. Digerir o homogeneizado com tripsina por incubação durante a noite a 30 ° C. Eu. Extingue-se a digestão enzimática no dia seguinte por adição de 0,5% de concentração final de ácido fórmico (FA). (Nota: A adição de FA irá provocar a precipitação dos sais SDC em condições ácidas). j. Suavemente vortex as amostras contendo SDC precipitates. k. Sedimentar para baixo os sais SDC por centrifugação das amostras a 12000 x g, 4 ° C durante 10 min. eu. Recolhe-se o sobrenadante e transferir o líquido para um novo tubo limpo. (Nota: Tome cuidado durante a pipetagem desta etapa para não re-suspender e / ou recolher sais do sedimento SDC). m. Re-dissolver o sedimento em SDC SDC tampão dissolvendo re-(Tabela 5) sob agitação em vórtice vigorosa durante 1 min. n. Repita os passos jl duas vezes para recuperar peptídeos precipitados e combinam-se os sobrenadantes. (Nota:. Ver Serra et al 2016 13 para mais detalhes sobre o SDC-assistida em solução protocolo digestão tríptica adaptado aqui.) </li><li> A dessalinização de triptico digerido amostras. uma. Realizar a dessalinização de amostras digeridas utilizando um cartucho de 1 g de C-18. (Nota: O uso de um cartucho de grande volume (5 mL), independentemente da quantidade de proteína obtida garantias de limpeza adequada dos restantes sais SDC nas amostras antesa injecção de LC-MS / MS). b. Realizar o condicionamento do cartucho C-18, 1 g com 5 mL de acetonitrilo (ACN). c. Passa 5 mL de tampão de limpeza (Tabela 6) por 1g do cartucho C-18 de ar para remover qualquer solvente orgânico remanescente. d. Carregar a amostra para o cartucho de 1 g de C-18. e. Realizar 3 - 5 etapas de limpeza para a amostra na coluna 1 g C-18 utilizando 5 mL de solução tampão de limpeza a cada passo. f. Eluir os péptidos dessalinizada a partir de 1 g a C-18 do cartucho, utilizando 5 mL de tampão de eluição (Quadro 7). g. Secam-se os péptidos eluidos em um concentrador de vácuo. c. Reconstituir a amostra seca em um volume final de 200 uL de tampão de eluição. (Nota:. Uso vigorosa e longa (&gt; 10 min), seguido por agitação em vórtex ultra-sons subsequente num banho de ultra-sons durante 30 minutos para re-suspender completamente os péptidos secos em tampão de injecção) d. Ajustar o volume de injecção da amostra para LERLIC-MS / MS para analisar entre 1 e 3 ug de proteína. </li></ol> 3. Uma dimensão LERLIC-MS / MS Separação <ol><li> condições de cromatografia líquida: fases móveis: A: FA a 0,1% em água (Tabela 8). B: 0,1% de FA em ACN (Tabela 9) Caudal: 0,4 mL / min Coluna: coluna capilar LAX (50 cm de comprimento - 200 um ID) uma. Utilizar o seguinte 1,200 min de gradiente: 95% de B durante 40 min, 95-85% de B durante 434 min, 85-70% de B durante 522 min, 70-35% de B durante 124 min, 35-3% de B durante 45 min , isocrática a 3% de B durante 5 min, 3-95% de B ao longo de 7 min e mantido isocrática a 95% de B durante 23 min. b. Realizar a separação de péptidos que utilizam o capilar LAX como indicado em Serra &amp; Gallart-Palau et al. 3, utilizando ultra-alta pressão de cromatografia líquida. </li><li> configuração do espectrômetro de massa: uma. Configurar os detalhes do evento de digitalização para executar aquisição de dados alternada between Fourier completo transformar-espectrometria de massa (FT-MS) e espectrometria de massa em tandem transformar-Fourier (FT-MS / MS) com os seguintes parâmetros: a.1. modo de aquisição de dados: positiva a.2 parâmetros FT-MS: Intervalo de massa: 350 - 2000 m / z Resolução: 60.000 Microscans: 1 por espectro Controle automático de ganho: 1 × 10 6 a.3 parâmetros FT-MS / MS: modo de fragmentação: de alta energia de dissociação colisão (HCD) Intervalo de massa a.4: 150 - 2000 m / z a.5 Resolução: 30.000 a.6 iões topo N: 10 Microscans: 1 por espectro Cobrança Estado:&gt; 2+ largura isolamento: 2 Da A.7 controle de ganho automático: 1 × 10 6 b. Realizar a detecção de espectrometria de massa dos péptidos, tal como indicado em 3 utilizando um espectrómetro de massa Orbitrap equipado com uma fonte de iões de nanoelectrospray trabalhando a 1,5 kV. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Execute proteem busca de base de dados para o LERLIC-MS / MS de dados usando os seguintes parâmetros utilizando um software de proteómica específico obtido: (Nota: Ver 3 para mais detalhes). uma. tolerância de iões: 10 ppm b. tolerância iões fragmento: 0,05 Da c. Taxa de falso Discovery (FDR): 1% d. Base de dados: banco de dados Humano UniProt e. modificações fixos: Carbamydomethylation em Cys f. modificações variáveis ​​(se exigido pelo software): oxidação (Met), Desamidação (Asn e Gln). </li><li> Caracterização confiante e quantificação de produtos desamidados isoméricas em dados LERLIC-MS / MS: uma. Exportação de resultados de pesquisa de banco de dados de LERLIC-MS / MS para um software spreedsheet para análise. b. Encontrar e extrair toda a lista de péptidos desamidados e os seus homólogos não desamidados. c. Utilizando a lista dos péptidos obtidos como referência, extrair os cromatogramas iónicos (XICS) destes péptidos utilizando um software apropriado a 5 ppm de tolerância massa. (Nota:Veja 3 para mais detalhes sobre o software usado para a extração de XICS.) d. Inspeccione visualmente os XICS obtidos para identificar a separados eluição dupla pico dos produtos isoméricos como indicado 3. (Nota: produtos isoméricos destes péptidos identificados a nível MS / MS pode ser facilmente encontrado orientada pela presença de dois tempos de retenção diferentes no resultado da pesquisa do banco de dados.) e. A quantificação relativa dos produtos isoméricos de cada local desamidada / péptido tem que ser executada com base na área do pico de cada isómero identificados nas XICS obtidos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste vídeo-artigo apresentamos um protocolo passo-a-passo de LERLIC-MS / MS 3, um método para realizar uma caracterização em profundidade e para determinar com precisão a extensão da desamidação da proteína e os processos enzimáticos envolvidos nesta modificação de proteínas. LERLIC-MS / MS baseia-se no uso de um longo comprimento (50 cm) LAX sob o princípio de cromatografia electrostática repulsão-hidrofílico interacção (ERLIC) 27. A utilização de uma coluna de longa dur...

A desamidação é uma modificação pós-tradução da proteína (PTM), que introduz uma carga negativa para o esqueleto da proteína através da modificação de asparagina (Asn) e / ou resíduos de glutamina (Gln) 1. Esta modificação, enquanto que afectam os resíduos Asn gera a produtos isoméricos ácido isoaspartic (isoAsp) e n ácido aspártico (Asp) a um comum proporção de 3: 1 2. Não obstante, esta proporção pode ser alterada pela intervenção da enzima de reparação de L-isoaspartyl metiltransferase (PIMT) 3, 4. Da mesma forma, a desamidação de resíduos Gln gera o ácido isomérica gama-glutâmico (γ-Glu) e isoformas de ácido alfa-glutâmico (α-Glu) a uma esperada razão de 1: 7 3, 5, mas esta proporção pode ser deslocado por acção de a transglutaminase ubíqua enzima 2 e outras transglutaminases, incluindo uma transglutaminase, uma mensagemnzyme recentemente identificada como associada com vesículas extracelulares no cérebro 6. A origem de desamidação pode ser espontânea ou enzimática, o primeiro é especialmente comum em resíduos de Gln em que as transglutaminases e outras enzimas medeiam reticulação / intra-molecular entre através de transamidação (ver 3 para mais detalhes sobre Gln transamidação e suas implicações em várias crónica e doenças humanas fatais). Portanto, desamidação é um PTM que tem uma repercussão crucial sobre a estrutura e função das moléculas afectadas 4, 7, 8 e requer uma caracterização química em profundidade 3 em função das suas diversas consequências bioquímicas incluindo o seu serviço de relógio como molecular de envelhecimento 9 . Embora desamidação de resíduos Asn tem sido<html> relativamente bem caracterizados por proteómica espingarda de baixo para cima 1, 10, desamidação de resíduos Gln ainda não tem um método de caracterização adequada para além da análise de um desafio por compostos modelo à base de electrões fragmentação radical 11. Nós desenvolvemos recentemente um novo uma dimensão proteómica espingarda estratégia (LERLIC-MS / MS) 3 que permite a separação de Gln e Asn isoformas de desamidação em amostras biológicas complexas e compostos modelo em uma única análise. LERLIC-MS / MS baseia-se na separação de péptidos trípticos digerido usando um longo comprimento (50 cm) de coluna de permuta iónica (LAX) que trabalha no modo de cromatografia de interacção electrostática repulsão-hidrofílico (ERLIC) e acoplada a espectrometria de massa em tandem (LC- MS / MS). Esta nova estratégia de análise foi usado para caracterizar e quantificar relativamente a extensão de cada resíduo desamidada nos tecidos cerebrais humanosf &quot;&gt; 3. No entanto, o protocolo delineado aqui vai fornecer imagens de vídeo de LERLIC-MS / MS visa estudar as peculiaridades de desamidação proteína no contexto bioquímica de interesse. DECLARAÇÃO DE ÉTICA Todos os procedimentos deste protocolo ter sido aprovado pelo conselho de revisão institucional da Universidade Tecnológica de Nanyang, em Cingapura e foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 e micro; m 100-&Aring; (material a granel)</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Coluna</td><td></td></tr><tr><td>capilar de troca iônica de comprimento longo 50 cm - 200 &micro; m ID</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Pedido</td><td></td>especial</tr><tr><td>de tubulação PEEKsil 1/16" OD x 200 e micro; m ID x 50 cm de comprimento</td><td>SGE Analytical Science sob Trajan Scientific Australia&nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>Conexão fêmea para fêmea para tubulação de 1/16" OD</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Porca fêmea para microférula</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Microférula</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Pressão NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Proeminência UFLC sistema</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de trava segura</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável. 0,9 - 2,0 mm. 1 lb. Não estéril.</td><td>Próximo Centrífugo</td> de mesa <td>Advance SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R</td><td></td></tr><tr><td>Banho de Circulação Aquecido Digital Padrão, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Sep-pack c18 cartucho de dessalinização 50 mg</td><td>Concentrador</td><td>de água WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Vacumm</td><td>Eppendorf&nbsp;</td>Sistema <td></td><td>Concentrator Plus</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray&nbsp;</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>Incubadora TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>INCUCELL&nbsp;</td><td>MMM Grupo</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificada de grau de sequenciamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de coquetel inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão fosfato 10x (diluído para 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila HPLC grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>HPLC de isopropanol grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>água HPLC grau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

lerlic-ms / ms para caracterização em profundidade e quantificação de glutamina e asparagina em desamidação da espingarda proteomics

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Caracterização de desamidação proteína é imperativo para decifrar o papel (s) e as potencialidades desta modificação pós-tradução da proteína (PTM) em patologia humana e outros contextos bioquímicos. A fim de realizar uma caracterização da desamidação proteína, nós desenvolvemos recentemente um longo comprimento electrostática interacção espectrometria de cromatografia em tandem romance repulsão-hidrofílico massa (LERLIC-MS / MS) que pode separar a glutamina (Gln) e asparagina isoforma (Asn) produtos de desamidao de compostos modelo para amostras biológicas altamente complexas. LERLIC-MS / MS é, portanto, a primeira estratégia de proteómica espingarda para a separação e quantificação de isoformas de desamidação Gln. Nós também demonstram, como uma novidade, que o protocolo de processamento da amostra descrito aqui estabiliza o intermediário succinimida permitindo a sua caracterização por LERLIC-MS / MS. Aplicação de LERLIC-MS / MS como mostrado neste artigo de vídeo pode ajudar a elucidar a actualmente desconhecidamatrizes n moleculares de desamidação proteína. Além disso, LERLIC-MS / MS fornece uma maior compreensão das reacções enzimáticas que envolvem desamidação em contextos biológicos distintos.

A desamidação de resíduos Gln e Asn é considerada uma modificação da proteína degenerativa (DPM) implicados em várias doenças crónicas e fatais 14. Tem sido demonstrado que esta PTM pode prever a meia-vida e degradativas estados de anticorpos e outras moléculas no corpo humano e origens biológicas semelhantes 1, 15. O significado de desamidação proteína, na verdade, ultrapassa o contexto biomédico, portant...

Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo do método (LERLIC-MS / MS) de longa duração electrostática espectrometria de massa repulsão-hidrofílico interacção cromatografia em tandem. Esta é uma nova metodologia que permite pela primeira vez a quantificação e caracterização dos glutamina e asparagina isoformas de desamidação por proteómica espingarda.

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a proteômica em tiro ao alvo para caracterizar e quantificar produtos endógenos de desaminação de glutamina e asparagina em proteomas complexos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais em bioquímica, como a influência de processadores espontâneos e antimatéricos sobre o produto isométrico gluteo da desaminação de glutamina e asparagina. A principal vantagem desta técnica é que os isômeros de desaminação de glutamina são separados em uma coluna capilar de troca iônica de grande comprimento, maximizando a capacidade de separar peptídeos pelos seus pontos iselétricos.Para iniciar a construção da coluna, suspenda 50 miligramas de material de empacotamento de troca aniônica fraca em 3,5 mililitros de isopropanol 90% em água. Fixe uma conexão fêmea a fêmea, um microferal e uma porca fêmea em uma extremidade de um comprimento de 50 centímetros de tubo peak com diâmetro interno de 200 micrômetros. Coloque uma tela de 1/16 de polegada com poros de um micrômetro na extremidade do tubo dentro do microferal.Usando uma bomba de pressão ajustada para 4.500 psi, empacote a troca aniônica no interior do capilar até que o material seja visível na extremidade superior. Acople outro conector fêmea-fêmea, microferal e porca fêmea na extremidade superior do capilar empacotado, na ponta oposta, para finalizar a montagem da coluna. Lave 50 a 100 miligramas de tecido com solução salina tamponada com fosfato durante cinco minutos.Repita esta lavagem duas vezes e, em seguida, coloque o tecido lavado em tubos com tampas de segurança. Adicione a cada tubo uma quantidade equivalente em peso de esferas de aço inoxidável e 2,5 volumes equivalentes de uma solução aquosa de acetato de amônio 100 milimolar com 1% de desoxicolato de sódio. Homogeneíze o tecido na intensidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, centrifugue o homogenato por dez minutos a 10.000 x g e 4 graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Continue homogeneizando e centrifugando o pellet tecidual, combinando os sobrenadantes a cada vez até que nenhum pellet seja observado.Quantifique a concentração de proteína nos sobrenadantes combinados utilizando um ensaio de ácido bicinconínico. Em seguida, adicione ao homogenato uma solução um molar de ditiotreitol em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma concentração de ditiotreitol de dez milimolar na amostra. Incube o homogenato em banho-maria a 60 graus Celsius por trinta minutos.Adicione ao homogeneizado uma solução um molar de iodoacetamida em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma concentração de iodoacetamida de 20 milimolar na amostra. Incube o homogeneizado à temperatura ambiente na ausência de luz por 45 minutos. Em seguida, dilua o homogeneizado com dois volumes equivalentes de uma solução dez milimolar de dithiotreitol em acetato de amônio 100 milimolar.Incube o homogenato a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione ao homogenato um volume suficiente de tripsina modificada de grau de sequenciamento em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma proporção proteína-enzima de 1 para 50 em peso na amostra. Incube a amostra a 30 graus Celsius durante a noite para digerir o homogenato.Quenche a digestão com 0,5% do peso da amostra de ácido fórmico, precipitando os sais de desoxicolanato de sódio. Vortexe suavemente as amostras contendo sais de SDC e, em seguida, centrifugue as amostras por dez minutos a 12.000 × g e quatro graus Celsius. Decante o sobrenadante para um novo tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de sais de SDC.Redissolva os sais em uma solução aquosa de hidróxido de amônio a 0,5% em volume, agitando vigorosamente em vórtex. Condicione uma cartela de sorvente C-18 de um grama com 5 mililitros de acetonitrila, seguidos por cinco mililitros de ácido trifluoroacético a 0,1% em água. Em seguida, aplique a amostra digerida na cartela.Lave as amostras de três a cinco vezes com porções de cinco mililitros de TFA 0,1%. Em seguida, dilua os peptídeos com cinco mililitros de uma solução aquosa contendo 75% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico. Seque o fluido em um concentrador a vácuo.Adicione 200 microlitros de acetonitrila 75%, com 0,1% de ácido fórmico, ao resíduo. Agite a mistura em vórtex por pelo menos dez minutos e, em seguida, sonique a mistura por pelo menos 30 minutos para reconstituir os peptídeos secos. Dilua a amostra conforme necessário, de modo que a amostra injetada contenha de um a três microgramas de proteína.Conecte a coluna capilar LAX a um instrumento de cromatografia líquida de ultra alta pressão. Prepare soluções de ácido fórmico 0,1% em água e acetonitrila. Ajuste a vazão para 0,4 microlitros por minuto e configure uma corrida em gradiente de 1.200 minutos.Configure os eventos de varredura do espectrômetro de massas para alternar a aquisição de dados entre espectrometria de massa por transformada de Fourier completa e espectrometria de massas tandem por transformada de Fourier. Realize a MS/MS LERLIC para separar e caracterizar os peptídeos. Utilize os dados resultantes e um software proteômico para realizar uma busca em banco de dados de proteínas.Exporte os resultados da busca no banco de dados para um software de planilha eletrônica. Identifique e extraia a lista de peptídeos desamidados e os peptídeos correspondentes não desamidados. Extraia os cromatogramas de íons de cada um desses peptídeos com tolerância de massa de cinco partes por milhão.Inspecione os cromatogramas de íons extraídos para detectar a ilusão de pico duplo separado de produtos isoméricos. Utilizando a espectrometria de massas LERLIC em tandem, isoformas desamidadas de glutamina e asparagina foram separadas e identificadas a partir de uma amostra proteica em dois tempos de retenção diferentes. Resíduos intermediários de glutamina modificados enzimaticamente na transamidação, apresentando uma razão gama alfa glutamila invertida, foram identificados.O intermediário succinimida em resíduos de asparagina também foi identificado com este método. Como as condições levemente ácidas de processamento da amostra estabilizam o intermediário succinimida. Isso sugere que a técnica LERLIC MS/MS pode ser aplicada ao estudo em proteoma inteiro de intermediários succinimida.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores em bioquímica caracterizarem a desamidação de proteínas em contextos que vão da arqueologia à pesquisa biomédica.

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

Fonte: Wulf, M., et.al. Protocolo baseado em microdissecção a laser para a análise LC-MS/MS do perfil proteômico de grânulos de neuromelanina. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a análise de amostras de peptídeos de grânulos de neuromelanina (NMGs) isolados de tecido cerebral humano post-mortem. Os peptídeos são primeiro separados usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e depois analisados por espectrometria de massa para determinar suas razões massa-carga (m/z). Os...

Análise LC-MS/MS do perfil proteômico de grânulos de neuromelanina isolados de tecido cerebral humano

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

A proteína arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional generalizada que regula múltiplas vias biológicas. A espectrometria de massas é a melhor tecnologia para traçar globalmente o perfil do R-metil-proteoma, quando acoplada a abordagens bioquímicas para enriquecimento peptídico modificado. O fluxo de trabalho projetado para a identificação de alta confiança da R-metilação global em células humanas é descrito aqui.

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

Um protocolo robusto é apresentado aqui para isolar grânulos de neuromelanina de tecido humano post-mortem substantia nigra pars compacta via microdissecção a laser. Este protocolo revisado e otimizado minimiza massivamente o tempo necessário para a coleta de amostras, reduz a quantidade de amostra necessária e melhora a identificação e quantificação de proteínas pela análise LC-MS/MS.

Protocolo Baseado em Microdissecção a Laser para a Análise LC-MS/MS do Perfil Proteômico de Grânulos de Neuromelanina

Um protocolo proteômico de marcação de proximidade de lisossomos neuronais é descrito aqui para caracterizar o microambiente lisossômico dinâmico em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Proteínas de membrana lisossômica e proteínas que interagem com lisossomos (estável ou transitoriamente) podem ser quantificadas com precisão neste método com excelente resolução espacial intracelular em neurônios humanos vivos.

Caracterização do Interactome do Lisossomo Neuronal com Proteômica de Marcação de Proximidade

Aprenda a caracterizar e quantificar isoformas de desamidação de glutamina e asparagina usando LERLIC-MS/MS e shotgun proteomics. Este método avança o estudo de processos bioquímicos em proteomas complexos.

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics (Vídeo) | JoVE Journal

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

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