LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

O objetivo geral deste procedimento é usar proteômica shotgun para caracterizar e quantificar produtos endógenos de desamidação de glutamina e asparagina em proteomas complexos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em bioquímica, como a influência de processadores espontâneos e antimáticos no produto isométrico glúteo de glutamina e desaminação de asparagima. A principal vantagem desta técnica é que os isômeros de desaminação da glutamina são separados em uma coluna capilar de mudança iônica de longo comprimento, maximizando a capacidade de separar peptídeos pelos pontos isomáticos.

Para iniciar a construção da coluna, suspenda 50 miligramas de material de embalagem de troca aniônica fraca em 3,5 mililitros de isopropanol a 90%, em água. Prenda a fêmea para a fêmea, um microferal e uma porca fêmea em uma extremidade de um tubo de pico de 50 centímetros de comprimento com um diâmetro interno de 200 micrômetros. Encaixe uma tela de 1/16 de polegada com poros de um micrômetro na extremidade do tubo dentro do microferal.

Usando a bomba de pressão ajustada para 4.500 psi, embale a troca aniônica no capilar até que o material fique visível na parte superior. Anexe outra conexão fêmea para fêmea, microferal e porca fêmea no topo do capilar embalado na extremidade oposta para terminar a montagem da coluna. Lave 50 a 100 miligramas de tecido com solução salina tamponada com fosfato por cinco minutos.

Repita essa lavagem duas vezes e, em seguida, coloque o tecido lavado em tubos com tampas de segurança. Adicione a cada tubo um peso equivalente de esferas de aço inoxidável e 2,5 equivalentes em volume de uma solução aquosa de acetato de amônio a 100 milimolares com desoxicolato de sódio a 1%. Homogeneizar o tecido em intensidade máxima por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, centrifugar o homogeneizado durante dez minutos a 10 000 x g e a quatro graus Celsius. Transferir o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitros. Continuar a homogeneizar e centrifugar o sedimento de tecido, combinando os sobrenadantes de cada vez até que não se observe nenhum sedimento.

Quantificar a concentração de proteínas nos sobrenadantes combinados com um ensaio de ácido bicinconínico. Em seguida, adicione ao homogeneizado uma solução molar de ditiotreitol em acetato de amônio 100 milimolar para atingir uma concentração de ditiotreitol de dez milimolares na amostra. Incubar o homogeneizado em banho-maria a 60 graus Celsius por trinta minutos.

Adicionar ao homogeneizado uma solução molar de iodoacetamida em acetato de amónio a 100 milimolares para obter uma concentração de iodoacetamida de 20 milimolares na amostra. Incubar o homogeneizado à temperatura ambiente na ausência de luz durante 45 minutos. Em seguida, diluir o homogeneizado com dois equivalentes volumétricos de uma solução de dez milimolares de ditiotreitol em acetato de amónio a 100 milimolares.

Incubar o homogeneizado a 37 graus Celsius durante 30 minutos. Adicionar ao homogeneizado um volume suficiente de tripsina modificada de grau de sequenciação em acetato de amónio a 100 milimolares para atingir uma proporção de 1 para 50 enzimas proteicas em peso na amostra. Incubar a amostra a 30 graus Celsius durante a noite para digerir o homogeneizado.

Tempere a digestão com 0,5% do peso da amostra de ácido fórmico, precipitando os sais de desoxicolato de sódio. Vortex suave das amostras contendo sais SDC e, em seguida, centrifugue as amostras durante dez minutos a 12 000 x g e quatro graus Celsius. Transvase o sobrenadante para um novo tubo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de sais de SDC.

Dissolva novamente os sais em uma solução aquosa de hidróxido de amônio a 0,5% por volume, agitando vigorosamente. Condicione um cartucho adsorvente C-18 de um grama com 5 mililitros de acetonitrila, seguido por cinco mililitros de ácido trifluoroacético a 0,1% em água. Em seguida, carregue a amostra digerida no cartucho.

Lave as amostras três a cinco vezes com porções de cinco mililitros de 0,1% de TFA. Em seguida, dilua os peptídeos com cinco mililitros de uma solução aquosa de acetonitrila a 75% e ácido fórmico a 0,1%. Seque o fluido em um concentrador a vácuo.

Adicione 200 microlitros de acetonitrila a 75%, com ácido fórmico a 0,1% ao resíduo. Vortex a mistura por pelo menos dez minutos e, em seguida, sonicar a mistura por pelo menos 30 minutos para reconstituir os peptídeos secos. Diluir a amostra conforme necessário, de modo a que a amostra injectada contenha um a três microgramas de proteína.

Conecte a coluna capilar LAX a um instrumento de cromatografia líquida de ultra-alta pressão. Prepare soluções de ácido fórmico a 0,1% em água e acetonitrila. Defina a taxa de fluxo para 0,4 microlitros por minuto e configure uma corrida de gradiente de 1.200 minutos.

Configure os eventos de varredura do espectrômetro de massa para alternar a aquisição de dados, entre a espectrometria de massa com transformada de Fourier completa e a espectrometria de massa em tandem com transformada de Fourier. Execute LERLIC MS / MS para separar e caracterizar os peptídeos. Use os dados resultantes e o software proteômico para realizar uma pesquisa no banco de dados de proteínas.

Exporte os resultados da pesquisa do banco de dados para o software de planilha. Identificar e extrair a lista de péptidos desameados e os péptidos não desameados correspondentes. Extraia os cromatatos iônicos de cada um desses peptídeos com cinco partes por milhão de tolerância de massa.

Inspecionar os cromatgramas de íons extraídos para ver se há ilusão de pico duplo separada de produtos isoméricos. Usando LERLIC MS / MS, isoformas desaminadas de glutamina e asparagina foram separadas e identificadas a partir de uma amostra de proteína em dois tempos de retenção diferentes. Foram identificados resíduos de glutamina intermediária modificados enzimaticamente de transamidação mostrando uma razão gama alfa glutamil invertida.

O intermediário succinimida em resíduos de asparagina também foi identificado com este método. Como as condições de processamento de amostras levemente ácidas estabilizam o intermediário succinimida. Isso sugere que a técnica LERLIC MS / MS pode ser aplicada ao estudo amplo do proteoma de intermediários de succinimida.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em bioquímica caracterizarem a desamidação de proteínas em contextos que vão da arqueologia à pesquisa biomédica.