Guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro

O objetivo geral deste procedimento é descrever a ablação guiada estereotáticamente do córtex auditivo e o uso de um mapa de coordenadas para localizar a lesão sobre uma imagem da superfície do cérebro. Este método pode ajudar os investigadores de neurociência auditiva a abordar o papel dos corticais na via da percepção do som. Bem como os mecanismos e a plasticidade posicional da linha.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a exposição cirúrgica e a ablação do córtex auditivo por meio de métodos básicos que podem ser adaptados por qualquer investigador. Portanto, este método pode ser útil no campo da neurociência auditiva, também pode ser aplicado em outros sistemas, como o visual e o somatossensorial. Este método também pode ser usado para estudar defeitos que a ablação unilateral do córtex auditivo exerce em outras áreas corticais.

A demonstração visual desse método é fundamental, pois a identificação e tradução adequadas das coordenadas estereotáxicas para o osso temporal são essenciais para localizar com precisão o córtex auditivo. Para iniciar este procedimento, coloque o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Em seguida, estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica usando duas barras auriculares e uma barra de mordida.

Raspe o couro cabeludo e desinfete a área cirúrgica com iodopovidona. Usando um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre a superfície do crânio. Depois disso, use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue que cubra a superfície do crânio.

Para visualizar Bregma, Lambda e a linha interaural, faça uma incisão no músculo temporal próximo à sua inserção dorsal no crânio com um bisturi. Em seguida, puxe o músculo para fora usando uma agulha e material de sutura e fixe o material de sutura na estrutura estereotáxica para expor o osso temporal. Abaixe lentamente uma agulha reta estéril até que esteja logo acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha fique em zero interaural.

Defina este ponto como zero. Depois disso, mire no AC usando quatro pontos. Em seguida, abaixe a agulha logo acima do osso temporal para visualizar cada um desses quatro pontos.

Marque os pontos com um marcador no osso temporal e conecte-os para desenhar um retângulo. O retângulo servirá como guia para abrir uma janela no osso. Neste procedimento, abra a janela usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena.

Perfure o perímetro do retângulo a 8.000 rpm até que o osso ceda. Resfrie a superfície de perfuração enxaguando-a com solução salina estéril fria para evitar danos às estruturas subcorticais. Quando o osso ceder, tome cuidado para não perfurar o cérebro.

Quando as bordas estiverem soltas, puxe o osso de cobertura com uma pinça fina e guarde-o em solução salina estéril fria. Usando um microscópio cirúrgico, corte suavemente as meninges com uma faca microcirúrgica e remova-as usando duas pinças de ponta fina. Se ocorrer sangramento, lave o local da cirurgia com solução salina estéril fria.

Em seguida, aspire suavemente o AC usando um dispositivo de sucção cirúrgica acoplado a uma agulha estéril de ponta romba de calibre 20. Aspire apenas as seis camadas corticais e não a substância branca subjacente. Este ponto é crítico e precisa ser realizado com muito cuidado.

Quando a aspiração estiver concluída, cubra o local da cirurgia com o osso extraído e aplique uma gaze hemostática absorvível. Deixe o músculo temporal recuperar sua posição original e, em seguida, suture a pele usando clipes de ferida. Depois disso, aplique pomada antibiótica na ferida.

Em seguida, injetar buprenorfina por via subcutânea no dorso do rato como analgésico, uma hora e oito horas após o término da cirurgia. Mantenha o animal na almofada de aquecimento até que ele acorde e devolva-o à gaiola para recuperação. Quando a pesquisa realizada com o rato com ablação AC estiver concluída, anestesiar-se terminalmente por injeção intraperitoneal de 0,1 mililitros de pentobarbital sódico.

Depois de realizar uma profusão intracardíaca de solução de Ringer e formaldeído, remova a pele e o músculo da cabeça para expor o crânio. Usando uma tesoura Spencer, faça um corte transversal no osso orbital. Depois disso, remova a parte de trás do crânio e use rongeurs para cortar ao longo das bordas superiores do crânio para expor o cérebro.

Tenha cuidado para não danificar o cérebro. Uma vez que o cérebro esteja exposto, remova cuidadosamente a dura-máter usando uma pinça de ponta fina. Use um dedo para escavar suavemente e elevar o cérebro.

Em seguida, levante o cérebro e corte os nervos até que esteja livre. Em seguida, mergulhe o cérebro em solução de formaldeído e armazene-o a quatro graus Celsius por 24 horas. Após a pós-fixação, coloque cuidadosamente o cérebro em uma matriz cerebral sagital de rato, expondo a superfície lateral do cérebro.

Coloque uma câmera 21 centímetros acima da superfície do córtex usando um suporte de câmera. Em seguida, selecione o modo de disparo supermacro e tire uma foto da superfície do cérebro. Em seguida, usando um programa editor de imagens, abra as imagens e dimensione-as 50%Identifique as referências Bregma, Lambda e zero interaural e marque sua posição nas imagens.

Desenhe o contorno da ablação sobre a imagem lateral do cérebro. Importe o mapa de coordenadas onde as regiões primária e secundária do córtex auditivo estão localizadas para o arquivo do programa editor. Em seguida, clique no mapa e arraste-o para sobrepor à fotografia lateral do cérebro ablacionado.

Faça com que as referências Bregma e Lambda do mapa de coordenadas coincidam com as referências Bregma e IA identificadas na imagem do cérebro lateral. Posteriormente, use a fissura renal como referência para ajustar a imagem do cérebro ao mapa e fazê-los coincidir. É importante confirmar que a substância branca está intacta.

Isso pode ser feito inicialmente imunomarcando a seção seriada do cérebro. Para demonstrar a eficácia do nosso protocolo, mantivemos os três ratos com ablação AC sobreviventes por uma semana e, em seguida, coletamos as cócleas para estudar as alterações na expressão das subunidades AMPA mais relevantes presentes na cóclea adulta, GluA2 e GluA3 por qPCR. A comparação entre os transcritos de ratos com ablação AC e animais de controle simulado mostrou uma regulação negativa para GluA2 e uma regulação positiva para GluA3 em ambas as cócleas, o que está de acordo com nosso estudo anterior.

Ao tentar a cirurgia, é importante lembrar três coisas: perfurar o osso temporal na velocidade mais baixa com pressão mínima, remover cuidadosamente as meninges para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos e restringir a aspiração à substância cinzenta. Uma vez dominada, a exposição cirúrgica e a ablação do córtex auditivo podem ser feitas em 45 minutos se forem realizadas corretamente. Após esse procedimento, métodos fisiológicos, comportamentais e/ou imunocitoquímicos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a falta do córtex auditivo afeta a função de outros sistemas sensoriais.