Name: Guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a ablação do córtex auditório guiada por estereotaxia em ratos usando mapas de coordenadas para localização precisa da lesão. Este método permite estudar o papel cortical na percepção sonora.

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Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do Ministério da economia e competitividade (MINECO) do governo de Espanha, SAF2016-78898-C2-2-r..

este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos espanholas (Real Decreto 53/2013 - lei 32/2007) e as orientações da União Europeia (Directiva 2010/63/UE) sobre os cuidados e utilização de animais na pesquisa biomédica.
 1. Preparação do rato Nota: as experiências foram realizadas em ratos machos, para evitar qualquer alteração hormonal.
<ol><li>Anesthetize o animal usando uma mistura de cloridrato de cetamina (30 mg/kg) e cloridrato de xilazina (5 mg/kg) injetada por via intramuscular; com esta dose, o rato deve ser profundamente anestesiado por cerca de 1 h.</li>
	<li>Beliscar o rato &#39; dedo s; ausência de uma retirada reflex indica que o animal é totalmente inconsciente. Se o rato responde para o aperto, dá anestesia suplementar em um terço da dose inicial.</li>
	<li>Raspar o couro cabeludo e desinfetar a área cirúrgica com iodo-povidona.</li>
	<li>Colocar o animal em uma almofada de aquecimento para manter uma temperatura de 38 ° C e estabilizar o animal &#39; cabeça de s em uma armação estereotáxica usando duas barras de orelha e um bar de mordida. Tome cuidado para evitar perfuração da membrana timpânica com as barras de orelha.</li>
	<li>Proteger os olhos, aplicando uma gota de gel oftalmológico ou soro fisiológico de soro para cada olho.</li>
</ol> 2. Localização do AC no osso Temporal do rato <ol><li>com um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha mediana para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre a superfície do crânio.</li>
	<li>Use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue cobrindo a superfície do crânio para visualizar bregma, lambda e 0 interaural de acordo com o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro 22.</li>
	<li>Fazer uma incisão no músculo temporal perto de sua inserção dorsal no crânio com um bisturi. Puxar o músculo para fora usando um material de sutura e a agulha e corrigir o material de sutura na armação estereotáxica; Isto irá expor o osso temporal. Se o sangramento ocorre, enxaguar com soro fisiológico frio.</li>
	<li>Colocar uma agulha reta estéril no micromanipulador estereotáxica, certificando-se de que ele é totalmente seguro.</li>
	<li>, Lentamente, abaixe a agulha até que é bem acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha é definida como 0 interaural. Definir este ponto como zero e determinar as coordenadas deste ponto.</li>
	<li>Dependendo da área do cérebro de interesse, variam as coordenadas estereotáxica. Determine as coordenadas utilizando o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro 22. Uma vez que as coordenadas são determinadas, mover a agulha para comparar essas coordenadas.</li>
	<li>-Alvo o AC usando as coordenadas dos pontos seguintes quatro: r: A / P =-5,80 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-8,67 mm. Abaixe a agulha para a direita acima do osso temporal para visualizar cada um destes quatro pontos. Usando uma caneta marcador, marcar os pontos no osso temporal e conectá-los para desenhar um retângulo; o retângulo irá servir como um guia para abrir uma janela no osso ( Figura 1).</li>
</ol> 3. Exposição cirúrgica do AC <ol><li>abrir a janela usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena bit (0,6 mm Ø). O perímetro do retângulo a 8.000 rpm da broca até o osso dá afastado. Esfrie a superfície da perfuração por lavagem com solução salina fria para evitar danos às estruturas subcorticais. Quando o osso dá jeito, pode ser detectada uma queda na resistência. Tenha cuidado para não perfurar o cérebro.</li>
	<li>Quando as fronteiras estão soltas, puxe o osso coberta com pinça fina e armazená-lo em soro fisiológico estéril frio.</li>
</ol> 4. Ablação do AC <ol><li>usando um microscópio cirúrgico (10x), gentilmente cortado as meninges com uma faca microcirúrgica e removê-los usando duas belas pontas fórceps. Se o sangramento ocorre, enxaguar com soro fisiológico frio.</li>
	<li>Aspire suavemente o AC usando um dispositivo de sucção cirúrgico (bar de pressão-0.24) acoplado a uma agulha estéril de ponta romba de 20 G. Este ponto é crítico e precisa ser executada com muito cuidado: Aspire somente as seis camadas corticais e não a substância branca subjacente.</li>
	<li>Aspire até Parem o sangramento das artérias perfurantes.</li>
	<li>Quando a aspiração é terminada, cubra a área lesada com o osso extraído e aplicar uma gaze hemostático absorvível.</li>
	<li>Deixa o músculo temporal recuperar sua posição original e em seguida de sutura da pele usando clipes de ferida (9 mm). Aplique a pomada antibiótica (consulte a Tabela de materiais). Continuar a aplicar a pomada na ferida duas vezes ao dia por três dias. 
	Nota: Cada aplicativo consiste em uma fina camada aplicada na ferida.</li>
	<li>Buprenorfina injectar por via subcutânea na parte de trás do rato (0,05 mg/kg), como um analgésico 1 h após a cirurgia e depois a cada 8 h durante 72 h.</li>
	<li>Manter o animal sobre a almofada de aquecimento até ele acorda e devolvê-lo à sua gaiola de habitação para recuperar.</li>
	<li>Animais de casa individualmente para evitar que os companheiros de gaiola tocando a área suturada e fornecer alguns itens de enriquecimento. Alterar a serragem diariamente para prevenir a infecção e verificar cuidadosamente que o animal se recupera adequadamente e não mostra sinais de desconforto.</li>
</ol> 5. Coleção de tecido atenção: ao manusear paraformaldeído (PFA), sólido e aquoso, usar equipamentos de proteção individual (EPI) e usar um gabinete de segurança.
 Nota: preparar 750 mL de solução de formaldeído, dissolvendo a 4% (p/v) PFA em 1 x solução de tampão fosfato (PBS) usando o calor (55 ° C). Filtre a solução de formaldeído com papel de filtro. Preparar o Ringer &#39; s solução dissolvendo 8,5 g de NaCl, 0,25 g de KCl e 0,2 g NaHCO 3 em 1.000 mL de água (pH da solução = 6,9).
<ol><li>Deixa o animal sobreviver por enquanto é necessário para o estudo. Quando estiver concluída a pesquisa realizada com o rato ablated AC, terminal anestesiá-lo por injeção intra-peritoneal de 0,1 mL de pentobarbital de sódio (60 mg/kg). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada de dedo do pé e a ausência de reflexo de retirada.</li>
	<li>Quando o animal é anestesiado profundamente, executar uma perfusão intracardíaca 23 de 125 mL de Ringer &#39; s solução seguido de 750 mL de solução de formaldeído, usando um medidor de agulha de 1,8 mm de diâmetro interno.</li>
	<li>Quando a perfusão é terminado, decapitar o rato na primeira vértebra cervical.</li>
	<li>Tesoura uso para remover a pele e músculos da cabeça e expor o crânio. Use uma tesoura para cortar e abrir o buraco occipital e remover a parte de trás do crânio.</li>
	<li>Faça um transversal corte no osso orbital usando tesoura Spencer e use ruginas para cortar ao longo das bordas superiores do crânio para expor o cérebro. Tenha cuidado para não danificar o cérebro.</li>
	<li>, Uma vez que o cérebro é exposto, remova com cuidado a dura-máter usando pinça fina-apontou. Use um dedo suavemente colher sob e elevar o cérebro. Levantar o cérebro e cortar a nervos untIl é gratuito. Mergulhe o cérebro na solução de formaldeído e armazená-lo em 4 ° C por 24 h.</li>
</ol> 6. Localização das lesões AC <ol><li>após a pós-fixação, coloque cuidadosamente o cérebro em uma matriz de cérebro de rato sagital expondo a face lateral do cérebro.</li>
	<li>Coloque uma câmera 21 cm acima da superfície de córtex usando um suporte de câmera, selecionar o &#34; super macro tiroteio &#34; modo e tire uma foto da superfície do cérebro.</li>
	<li>Colocar o cérebro em uma matriz de cérebro de rato coronal expondo a superfície dorsal do cérebro e tirar outra foto.</li>
	<li>Usando um programa de editor de imagem, abra as imagens e dimensioná-los abaixo de 50% para tornar mais fácil trabalhar com eles. Identificar o bregma, lambda e interaural 0 referências sobre a imagem de acordo com Paxinos e Watson coordenadas 19 e marcar a sua posição nas fotos ( Figura 2). Desenhe o contorno da ablação sobre a imagem lateral do cérebro. Calcular o perímetro.</li>
	<li>Importação a coordenada mapa onde o principal (A1) e regiões secundárias (Dorsal e Ventral córtices) de AC estão localizado 18 para o arquivo do programa editor onde você está trabalhando com as fotos. Clique no mapa e arraste-o para sobrepô-lo à fotografia lateral do cérebro ablated.
	<ol><li>Fazer o bregma e referências de lambda do mapa coordenada coincidam com as referências de bregma e o lambda identificadas na imagem do cérebro lateral.</li>
		<li>Usar a fissura rhinal como referência para ajustar a imagem do cérebro para o mapa e fazê-los coincidir ( Figura 2B).</li>
	</ol></li> <li>Calcular a porcentagem da lesão em relação à área ocupada pela AC...</li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.

Uma cirurgia bem sucedida depende em cima de dois fatores: manter o animal vivo durante e após o procedimento e localizar com precisão a área de interesse. Garantindo que o rato é profundamente anestesiado durante a cirurgia (teste do reflexo de retirada) e recebe adequados analgésicos e antibióticos ototóxicos-não devem ajudar a sobrevivência. Além disso, o rato deve ser mantido em uma almofada de aquecimento até acorda da anestesia para evitar a hipotermia. Sutura irá diminuir a susceptibilidade à infecção, e uma técnica adequada é vital: animais vão pegar em seus clipes de ferida, então eles devem ser implantados firme o suficiente para impedir a remoção sem colocar muita tensão na ferida.
Para localizar com precisão o AC (ou qualquer outra área cortical), é importante determinar a posição de bregma, lambda e 0 interaural para usá-los como referências para calcular os limites da região alvo. Qualquer erro no cálculo as coordenadas resultará na ablação parcial de AC ou a aspiração indesejada de outras áreas circundantes. Assim, a ponta da agulha deve apenas tocar o osso em interaural 0 e em seguida traduzir as coordenadas antero-posterior e medio-lateral, de acordo com o que está descrito neste protocolo.
Neste manuscrito, também descrevemos como cirurgicamente expor e ablate o AC. Há três etapas essenciais: o processo de perfuração, a abertura e remoção das meninges e a ablação por aspiração. De perfuração deve ser realizada a baixa velocidade com pressão mínima, como uma perfuração de alta velocidade gera calor que pode afetar nas proximidades de estruturas subcorticais. No entanto, manter uma velocidade baixa e resfriamento da área de perfuração com soro fisiológico frio devem impedir qualquer dano. Além disso, a pressão mínima é essencial para evitar uma ruptura repentina do crânio e lesões subsequentes ao córtex subjacente. A abertura e remoção das meninges que cobrem o AC devem ser realizadas com cuidado para evitar a interrupção dos vasos sanguíneos. Se o sangramento ocorre, o diagnóstico precoce e tardia é geralmente desfavorável e é questionável se um animal satisfaz os critérios de inclusão para um estudo confiável. Neste caso recomendamos a eutanásia. Finalmente, a aspiração (provavelmente o aspecto mais difícil na realização de uma efetiva lesão), deve ser restrito a matéria cinzenta. Há dois indicadores que podem ajudar a detectar a presença de matéria branca: (1) uma mudança no contraste de cor, como a substância branca é mais brilhante do que a matéria cinzenta; e (2) a cessação do sangramento das artérias perfurantes.
Após qualquer manipulação realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão do procedimento feito no córtex para posterior análise e validação de dados provenientes do animal. Neste manuscrito, detalhamos como localizar a ablação realizada no córtex, usando um mapa de coordenadas descrito anteriormente pelo nosso grupo de18. Este mapa foi construído usando referências anatómicas obtidas reconstruções serial seção de cortes histológicos, correlacionados com o atlas Paxinos e Watson do rato cérebro22. Nesse sentido, o mapa diferencia-se entre o primário (A1) e córtices secundários (Dorsal e Ventral) do AC. A principal vantagem deste mapa coordenadas é que permite a rápida localização da lesão sobrepondo uma foto tirada da superfície lateral do cérebro colocado numa matriz sagital do cérebro. Outra vantagem é que laboratórios com menos experiência em anatomia podem usar o mapa pela adaptação ao seus modelos animais. Só é necessário definir as distâncias entre bregma, lambda e interaural 0 referências em um cérebro de controle perfundido e escala o mapa para cima ou para baixo em conformidade. Use a fissura Rhinal como referência para ajustar as imagens do cérebro para o mapa. A profundidade da ablação não pode ser determinada neste mapa coordenadas, então deve ser determinado em secções histológicas de cérebro.
A combinação de métodos estereotáxica com a exposição cirúrgica do AC são métodos básicos que poderiam facilmente ser adaptados por qualquer pesquisador que deseja direcionar o AC no rato. Isto pode ser para um experimento agudo ou que requer a implantação de dispositivos permanentes. Além disso, a ablação cirúrgica do AC anteriormente serviu como modelo para estudar os efeitos da privação crônica de cortical em audiência. Ablações AC também poderiam ser usadas para estudar os efeitos que unilateral ablações AC exercem em outras áreas corticais, ou servem como um modelo de acidente vascular cerebral. Assim, os projetos experimentais descritos aqui são métodos úteis que podem ser aplicados individualmente ou em combinação para uma ampla gama de projetos experimentais.

O rato é um dos mais utilizados modelos animais em Neurociências auditiva. A robustez do seu comportamento torna-o capaz de trabalhar por centenas de ensaios por dia. Sua sensibilidade e acuidade espectral para audição1,2e a organização anatômica e funcional do seu sistema central, comparável de outros mamíferos3, fazem o rato um modelo animal adequado para analisar uma ampla gama de Tópicos de pesquisa em neurociência auditivo. O córtex auditivo de ratos (AC), em particular, tem sido objecto de vários estudos anatômicos e fisiológicos que tentaram compreender sua estrutura, organização e papel no processamento de som3. Hoje em dia, o AC tornou-se popular entre os neurocientistas interessados na plasticidade de experiência-dependência, percepção auditiva, a base sináptica da organização do campo receptivo e o controle cortical do processamento de som no subcortical auditivo núcleos4,5,6,7,8,9. Para enfrentar os desafios que representam estas novas abordagens, procedimentos que podem localizar com precisão e expor cirurgicamente o AC vão acelerar os esforços de investigação. Técnicas estereotáxica facilitam a localizar regiões específicas dentro do cérebro sem testes de fisiologia. Embora o tamanho do cérebro varia ligeiramente entre os animais, a localização de qualquer área do cérebro pode ser determinada usando coordenadas estereotáxica conjunto de marcos históricos no crânio de cérebro de ratos.
A ablação restrita do AC é a remoção cirúrgica da região sensorial do córtex mais directamente relacionado com a audição. Em contraste com outros métodos usados para bloquear a atividade do AC, como refrigeração ou locais lidocaína injeções10,11,12, a ablação cirúrgica dos resultados AC na perda crônica de função. Assim, ablações de AC são mais adequadas para estudar os efeitos a longo prazo da privação cortical, bem como os fenômenos subsequentes da plasticidade da lesão. A combinação de métodos estereotáxica com ablações cirúrgicas do AC tem sido usado com sucesso para estudar os efeitos fisiológicos, comportamentais e moleculares de controle cortical privação13,14,15 ,16,17,18,19. Por exemplo, um modelo do rato com bilaterais ablações AC serviu para estudar os efeitos da ablação cortical no reflexo de alarme auditivo e tronco cerebral auditivo respostas (ABR)16. Recentemente, comparamos os efeitos tão unilaterais contra ablações bilaterais da produção rato AC em limiares ABR, amplitudes e latências em pontos diferentes de tempo após a lesão de18. Além disso, o modelo do rato de ablação de AC restritiva também tem sido usado para estudar o efeito de degeneração de caminho corticofugal no collicus inferior13,14,15 e o ouvido interno17 ,19. Depois que tal uma manipulação é realizada no cérebro, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Embora muito útil, a principal limitação dos mapas de tonotopic com base em respostas neuronal20,21 são as técnicas eletrofisiológicas necessárias para localizar os campos auditivos no cérebro de ratos. Uma vez que nem todos os laboratórios têm o equipamento necessário e/ou experiência para fazer essas gravações, nós construímos o mapa coordenado com base na transferência dos limites cytoarchitectural do AC para uma imagem do cérebro de superfície18. Este mapa pode ser muito útil para localizar o AC sem testes de fisiologia.
O presente protocolo descreve um método para a localização de Estereotaxia guiada, exposição cirúrgica e ablação do AC em ratos. Ele também descreve como usar o nosso mapa coordenadas18 para localizar facilmente a extensão da lesão sobre uma foto da superfície dos cérebros ablated.

<table><tbody><tr><td>Quadro estereotáxico</td><td>David Kopf Ins.</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>microscópio cirúrgico</td><td>WILD M650 Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento</td><td>DAGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromotor dental</td><td>W& H elco</td><td>5118</td><td></td></tr><tr><td>Diamond burr</td><td>B Braun</td><td>GD021R</td><td>0,6 mm</td></tr><tr><td>Dispositivo de sucção cirúrgica</td><td>Atmos</td><td>Atmoforte E2</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Merial</td><td></td><td>30 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td></td><td>5 mg/kg</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-11</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidona</td><td>iodo Meda</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>soro salino estéril</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G agulha estéril</td><td>Terumo Neolus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas</td><td></td><td></td><td></td>de algodão</tr><tr><td>Material de sutura</td><td>B.Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada Antibiótica</td><td>Quadriderme (Betametasona, Gentamicina, Clotrimazol) - Schering-Plough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>dimeda</td><td>10.331.12</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas cirúrgicas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501940</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Indivior UK</td><td>Buprex</td><td>0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>dimeda</td><td>08.120.15</td><td></td></tr><tr><td>Spencer scissor</td><td>dimeda</td><td>08.804.14</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Lawton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faca microcirúrgica</td><td>MSP</td><td>7503</td><td></td></tr><tr><td>Gaze hemostática absorvível</td><td>Surgicel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saggital rato Matriz cerebral</td><td>Sistemas de ativação Inc.</td><td>RBM-1000DV / RBM 4000C</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital de sódio</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td>60 mg/kg</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Olympus 5.1 MP</td><td>C-5060 lente zoom ampla</td><td>F2.8-4.8</td></tr><tr><td>Clipes de ferida</td><td>Reflex 9</td><td></td><td>9 mm</td></tr><tr><td>Canvas 12</td><td>ACD Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>diâmetro do calibre</td><td></td><td></td> da agulha <td>1,8 mm</td></tr><tr><td>Funil separatório</td><td>labbox</td><td>11409</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GluA2 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>CGGCAGCTCAGCTAAAAACT</td></tr><tr><td>GluA2 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_017261</td><td>TTGTAGCTGGTGGCTGTTGA</td></tr><tr><td>GluA3 primer Forward</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>ATTGCTGATGGTGCAATGAC</td></tr><tr><td>GluA3 primer Reverse</td><td>GeneBank</td><td>NM_032990</td><td>TTTGCATTGTCGCAAGTCTC</td></tr></tbody></table>

guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro

Stereotactically-guided Ablation of the Rat Auditory Cortex, and Localization of the Lesion in the Brain

O córtex auditivo de ratos (AC) está se tornando popular entre investigadores de neurociência auditivo que estão interessados na plasticidade de experiência-dependência, processos de percepção auditivos e controle cortical de processamento nos núcleos auditivos subcorticais de som. Para enfrentar novos desafios, um procedimento para localizar com precisão e cirurgicamente expor o córtex auditivo aceleraria esse esforço de investigação. Neurocirurgia estereotáxica é usada rotineiramente na investigação pré-clínicos em modelos animais para engraft uma agulha ou um eletrodo em um local pré-definido dentro do córtex auditivo. O seguinte protocolo, usamos métodos estereotáxico em uma forma nova. Podemos identificar quatro pontos de coordenadas sobre a superfície da temporal bone do rato para definir uma janela que, uma vez aberto, expõe com precisão tanto o primário (A1) e secundário (Dorsal e Ventral) córtices do AC, usando esse método, em seguida, executamos um cirúrgico ablação do AC. Depois de uma manipulação tão é executada, é necessário avaliar a localização, tamanho e extensão das lesões feitas no córtex. Assim, podemos também descrever um método para localizar facilmente a autópsia de ablação AC usando um mapa de coordenadas construído transferindo os limites de cytoarchitectural do AC para a superfície do cérebro. A combinação da localização guiada por estereotaxia e ablação do AC com a localização da área lesada em uma autópsia mapa coordenadas facilita a validação das informações provenientes do animal e leva a uma melhor análise e compreensão dos dados.

Realizamos uma localização guiada estereotaxia, exposição cirúrgica e ablação unilateral do AC em três ratos Wistar. A localização da lesão confirmou que ablações realizadas nas três ratos invadiu as principais subdivisões do AC (córtices primários, dorsais e ventrais) e era composta por uma gama de 80 a 100% da área total de AC (Figura 2B).
O protocolo descrito aqui para executar ablações de AC restritivas anteriormente foi usado em nosso laboratório para estudar os efeitos a longo prazo da privação de controle cortical nos núcleos auditivos subcorticais, bem como os fenômenos subsequentes da plasticidade. Nestes estudos, o protocolo de ablações AC foi validado aplicando fisiológico (ABR), comportamentais (assustar respostas, prepulse inibição; PPI) e moleculares (DNA microarrays, qPCR e Western Blot) métodos13,14,15,16,17,18,19. Aqui, para demonstrar a eficácia do nosso protocolo, deixamos os três ratos AC ablated sobreviver durante uma semana, e recolhidos os cochleae durante a coleta de tecido para estudar as alterações na expressão das subunidades Leandro mais relevantes presentes na cóclea adulta , GluA2 e GluA3, por qPCR. A comparação entre as transcrições de AC retirado de ratos e animais controle de Souza onde foi realizado todo o processo de cirurgia, mas não a ablação cortical mostraram um para baixo-regulamento para GluA2 e uma regulação para GluA3 em ambos os cochleae (Figura 3) , que é de acordo com nosso anterior estudo19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig1.jpg"> 
Figura 1: imagens do rato osso temporal em três diferentes etapas cirúrgicas. (A) transferência das coordenadas estereotáxicos do AC no osso temporal. As coordenadas dos quatro pontos são: r: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-6,4 mm; B: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-6,4 mm; C: A/P =-2.7 mm, M/L = + /-8,67 mm; D: A/P =-5.8 mm, M/L = + /-8,67 mm. (B) as coordenadas são utilizadas como referência para desenhar um retângulo na superfície do osso temporal que guiarão a abertura de uma janela. (C) mostra a janela aberta no osso após a perfuração. As meninges com vasos sanguíneos podem ser observadas na superfície do cérebro. R: rostral, d: dorsal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig2.jpg"> 
Figura 2: procedimento para a localização de lesões no cérebro de ratos. (A) fotografia da superfície dorsal de um cérebro AC ablated com agulhas Estereotaxia implantados em Lambda e Bregma (de acordo com Paxinos e Watson coordenadas19). Linhas pontilhadas marcar a posição de Bregma e Interaural 0 na grade 9 x 9 cm, bem como na superfície dorsal do cérebro. (B) fotografia da superfície lateral do cérebro ablated sobreposta ao mapa coordenado do AC. O perímetro da lesão é marcado em vermelho na foto. O perímetro da área de AC é rotulado de preto no mapa. Neste exemplo, a percentagem de ablação de AC em relação a área total ocupada pelo AC é 84.79%. AC: o córtex auditivo, IA: inter aural, FR: fissura Rhinal. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56429/56429fig3.jpg"> 
Figura 3: alterações nos níveis de RNAm de subunidades do receptor GABA GluA2 e GluA3 depois unilateral pós-lesão ablações AC de 7 dias. Os resultados são apresentados como o média ± desvio-padrão da mudança dobra. Alterações para transcrições de GluA2 são representadas em azul. Mudanças para GluA3 transcrições são apresentadas em vermelho. Uma diminuição significativa no GluA2 e um aumento na GluA3 são observadas em ambos os cochleae (ipsi - e contralateral para a ablação) em relação a controles de farsa com nenhum ablações corticais em 7 dias após a cirurgia; Isto está de acordo com nossos anteriores resultados19. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56429/56429fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Nós descrevemos um método para a localização de guiada por estereotaxia, exposição e ablação do córtex auditivo em ratos. A localização da ablação é avaliada utilizando uma autópsia de coordenadas de mapa.

Guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro

The rat auditory cortex (AC) is becoming popular among auditory neuroscience investigators who are interested in experience-dependence plasticity, ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever a ablação guiada estereotáticamente do córtex auditivo e o uso de um mapa de coordenadas para localizar a lesão sobre uma imagem da superfície do cérebro. Este método pode ajudar os investigadores de neurociência auditiva a abordar o papel dos corticais na via da percepção do som. Bem como os mecanismos e a plasticidade posicional da linha.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a exposição cirúrgica e a ablação do córtex auditivo por meio de métodos básicos que podem ser adaptados por qualquer investigador. Portanto, este método pode ser útil no campo da neurociência auditiva, também pode ser aplicado em outros sistemas, como o visual e o somatossensorial. Este método também pode ser usado para estudar defeitos que a ablação unilateral do córtex auditivo exerce em outras áreas corticais.A demonstração visual desse método é fundamental, pois a identificação e tradução adequadas das coordenadas estereotáxicas para o osso temporal são essenciais para localizar com precisão o córtex auditivo. Para iniciar este procedimento, coloque o rato anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal. Em seguida, estabilize a cabeça do animal em uma estrutura estereotáxica usando duas barras auriculares e uma barra de mordida.Raspe o couro cabeludo e desinfete a área cirúrgica com iodopovidona. Usando um bisturi, faça uma incisão ao longo da linha média para expor o crânio e retrair o periósteo que cobre a superfície do crânio. Depois disso, use uma ponta de algodão estéril para remover suavemente qualquer sangue que cubra a superfície do crânio.Para visualizar Bregma, Lambda e a linha interaural, faça uma incisão no músculo temporal próximo à sua inserção dorsal no crânio com um bisturi. Em seguida, puxe o músculo para fora usando uma agulha e material de sutura e fixe o material de sutura na estrutura estereotáxica para expor o osso temporal. Abaixe lentamente uma agulha reta estéril até que esteja logo acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha fique em zero interaural.Defina este ponto como zero. Depois disso, mire no AC usando quatro pontos. Em seguida, abaixe a agulha logo acima do osso temporal para visualizar cada um desses quatro pontos.Marque os pontos com um marcador no osso temporal e conecte-os para desenhar um retângulo. O retângulo servirá como guia para abrir uma janela no osso. Neste procedimento, abra a janela usando uma furadeira elétrica e uma broca pequena.Perfure o perímetro do retângulo a 8.000 rpm até que o osso ceda. Resfrie a superfície de perfuração enxaguando-a com solução salina estéril fria para evitar danos às estruturas subcorticais. Quando o osso ceder, tome cuidado para não perfurar o cérebro.Quando as bordas estiverem soltas, puxe o osso de cobertura com uma pinça fina e guarde-o em solução salina estéril fria. Usando um microscópio cirúrgico, corte suavemente as meninges com uma faca microcirúrgica e remova-as usando duas pinças de ponta fina. Se ocorrer sangramento, lave o local da cirurgia com solução salina estéril fria.Em seguida, aspire suavemente o AC usando um dispositivo de sucção cirúrgica acoplado a uma agulha estéril de ponta romba de calibre 20. Aspire apenas as seis camadas corticais e não a substância branca subjacente. Este ponto é crítico e precisa ser realizado com muito cuidado.Quando a aspiração estiver concluída, cubra o local da cirurgia com o osso extraído e aplique uma gaze hemostática absorvível. Deixe o músculo temporal recuperar sua posição original e, em seguida, suture a pele usando clipes de ferida. Depois disso, aplique pomada antibiótica na ferida.Em seguida, injetar buprenorfina por via subcutânea no dorso do rato como analgésico, uma hora e oito horas após o término da cirurgia. Mantenha o animal na almofada de aquecimento até que ele acorde e devolva-o à gaiola para recuperação. Quando a pesquisa realizada com o rato com ablação AC estiver concluída, anestesiar-se terminalmente por injeção intraperitoneal de 0,1 mililitros de pentobarbital sódico.Depois de realizar uma profusão intracardíaca de solução de Ringer e formaldeído, remova a pele e o músculo da cabeça para expor o crânio. Usando uma tesoura Spencer, faça um corte transversal no osso orbital. Depois disso, remova a parte de trás do crânio e use rongeurs para cortar ao longo das bordas superiores do crânio para expor o cérebro.Tenha cuidado para não danificar o cérebro. Uma vez que o cérebro esteja exposto, remova cuidadosamente a dura-máter usando uma pinça de ponta fina. Use um dedo para escavar suavemente e elevar o cérebro.Em seguida, levante o cérebro e corte os nervos até que esteja livre. Em seguida, mergulhe o cérebro em solução de formaldeído e armazene-o a quatro graus Celsius por 24 horas. Após a pós-fixação, coloque cuidadosamente o cérebro em uma matriz cerebral sagital de rato, expondo a superfície lateral do cérebro.Coloque uma câmera 21 centímetros acima da superfície do córtex usando um suporte de câmera. Em seguida, selecione o modo de disparo supermacro e tire uma foto da superfície do cérebro. Em seguida, usando um programa editor de imagens, abra as imagens e dimensione-as 50%Identifique as referências Bregma, Lambda e zero interaural e marque sua posição nas imagens.Desenhe o contorno da ablação sobre a imagem lateral do cérebro. Importe o mapa de coordenadas onde as regiões primária e secundária do córtex auditivo estão localizadas para o arquivo do programa editor. Em seguida, clique no mapa e arraste-o para sobrepor à fotografia lateral do cérebro ablacionado.Faça com que as referências Bregma e Lambda do mapa de coordenadas coincidam com as referências Bregma e IA identificadas na imagem do cérebro lateral. Posteriormente, use a fissura renal como referência para ajustar a imagem do cérebro ao mapa e fazê-los coincidir. É importante confirmar que a substância branca está intacta.Isso pode ser feito inicialmente imunomarcando a seção seriada do cérebro. Para demonstrar a eficácia do nosso protocolo, mantivemos os três ratos com ablação AC sobreviventes por uma semana e, em seguida, coletamos as cócleas para estudar as alterações na expressão das subunidades AMPA mais relevantes presentes na cóclea adulta, GluA2 e GluA3 por qPCR. A comparação entre os transcritos de ratos com ablação AC e animais de controle simulado mostrou uma regulação negativa para GluA2 e uma regulação positiva para GluA3 em ambas as cócleas, o que está de acordo com nosso estudo anterior.Ao tentar a cirurgia, é importante lembrar três coisas: perfurar o osso temporal na velocidade mais baixa com pressão mínima, remover cuidadosamente as meninges para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos e restringir a aspiração à substância cinzenta. Uma vez dominada, a exposição cirúrgica e a ablação do córtex auditivo podem ser feitas em 45 minutos se forem realizadas corretamente. Após esse procedimento, métodos fisiológicos, comportamentais e/ou imunocitoquímicos podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a falta do córtex auditivo afeta a função de outros sistemas sensoriais.

stereotactically-guided-ablation-rat-auditory-cortex-localization

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

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FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

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Guiada por estereotaxia ablação do córtex auditivo de ratos e localização da lesão no cérebro

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