Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

O objetivo geral desta metodologia de amostragem de ar e extração de DNA é obter DNA genômico fúngico que possa ser amplificado, sequenciado e colocado taxonomicamente para identificar riscos fúngicos potenciais em ambientes ocupacionais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de avaliação da exposição ocupacional, como a quais riscos fúngicos os trabalhadores estão expostos e que podem resultar em efeitos negativos à saúde. A principal vantagem dessa técnica é que as espécies de fungos que permanecem não detectadas usando métodos baseados em cultura ou microscopia podem ser elucidadas usando abordagens baseadas em sequenciamento.

Para montar o do filtro de amostragem de ar, coloque uma almofada de suporte de filtro de celulose na superfície quadriculada da peça de base e, em seguida, com a ajuda de uma pinça de filtro, coloque um filtro em cima da almofada de suporte do filtro com o lado de coleta voltado para cima. Após a montagem, vede o do filtro inserindo a tampa de extensão e pressionando-a firme e uniformemente com uma prensa manual ou pneumática. Em seguida, encaixe o montado em cima do amostrador de aerossol NIOSH e empurre para baixo o máximo possível.

Use um pedaço de fita adesiva de 19 milímetros para enrolar a parte externa do do filtro e do amostrador, segurando o do filtro no lugar e agindo como uma vedação de backup para evitar vazamentos. Aparafuse os tubos de coleta firme e totalmente no amostrador até que eles cheguem ao fundo e enrole a fita de vedação ao redor dos tubos atuando como vedação secundária contra vazamentos. Para realizar a amostragem pessoal de aerossol, coloque o amostrador dentro da zona de respiração da pessoa.

Prenda o amostrador na lapela, ombro ou peito e, em seguida, mantenha a bomba de amostragem na altura da cintura ou em uma mochila. Ligue as bombas e verifique após um minuto se a bomba está funcionando. Ao completar a amostragem de ar, colete o amostrador de ar do sujeito.

Remova a fita de vedação, desparafuse os tubos e coloque uma tampa sobre eles. Coloque o terceiro pedaço de de filtro sobre o filtro. Primeiro, limpe o de amostragem com etanol a 70% e, em seguida, use uma ferramenta de abertura de para abrir o de amostragem enquanto trabalha em uma cabine de segurança biológica Classe II.

Em seguida, use um elevador de filtro para levantar a almofada de suporte e o filtro para cima. Em seguida, use uma pinça de filtro para remover o filtro e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Corte o filtro em seis pedaços iguais com um bisturi esterilizado e coloque-os em um tubo reforçado de dois mililitros contendo 300 miligramas de contas de vidro de 200 a 500 micrômetros.

Mergulhe o tubo contendo filtro em nitrogênio líquido por 30 segundos e, em seguida, coloque-o rapidamente em um homogeneizador de moinho de esferas a uma velocidade de 4.5 metros por segundo por 30 segundos. Adicione 0,5 mililitros de tampão de lise aos tubos contendo os pequenos pedaços restantes de filtro intacto e, em seguida, adicione 0,3 mililitro de tampão de lise aos tubos de coleta do amostrador de ar de 15 e 1,5 mililitros e vórtice os tubos na posição vertical e invertida por 10 a 15 segundos, respectivamente. Transfira o tampão de lise de cada tubo de coleta para tubos reforçados com dois mililitros contendo 300 miligramas de contas de vidro.

Processe os tubos no homogeneizador do moinho de esferas por 30 segundos e, em seguida, centrifugue as amostras a 20.000 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros e centrifugar novamente o sobrenadante a 20 000 vezes a gravidade durante um minuto a 22 graus Celsius. Depois de adicionar 30 microlitros de reagente de lise, incube os tubos a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, adicione 0,2 mililitro de tampão de ligação e 100 microgramas por mililitro de proteinase K ao tubo e, em seguida, deixe os tubos para incubação em um aquecedor de bloco a 70 graus Celsius por 10 minutos. Por fim, adicione 100 microlitros de isopropanol a cada tubo. Em seguida, coloque tubos de filtro de fibra de vidro com capacidade de 700 microlitros em tubos de coleta de dois mililitros e transfira as soluções de extrato para ele.

Após a transferência, centrifugue os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Após a centrifugação, insira a fibra filtrante de vidro em tubos de coleta novos e descarte o tubo de coleta. Para cada tubo, adicione 0,5 mililitro de tampão de remoção do inibidor e conduza a centrifugação a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.

Descarte o tubo de coleta após a centrifugação e coloque os tubos de filtro em novos tubos de coleta. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de tampão de lavagem a cada tubo e novamente sujeito à centrifugação a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Descarte o tubo de coleta e substitua por novos após a centrifugação.

Novamente, adicione 0,5 mililitro de tampão de lavagem a cada tubo e centrifugue a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Para remover qualquer tampão de lavagem residual, centrifugue finalmente os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius e descarte os tubos de coleta e substitua-os por novos. Depois de adicionar 100 microlitros de tampão de eluição quente, incube os tubos na bancada do laboratório à temperatura ambiente por um a dois minutos e centrifugue os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.

Coloque os tubos filtrantes em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e reaplique os eluatos para outra centrifugação redonda. Use tubos de PCR de 0,5 mililitro para configurar reações de 50 microlitros em triplicado com cinco microlitros de DNA já extraído para cada reação, depois programe o termociclador e inicie o ciclo. Misture todas as três reações de PCR em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro.

Adicione 750 microlitros de tampão de ligação e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione 450 microlitros da mistura total às colunas de centrifugação inseridas nos tubos de coleta e comece a centrifugar a 17.900 vezes a gravidade por 30 segundos, depois descarte o filtrado e adicione os 450 microlitros restantes da mistura para uma segunda rodada de centrifugação. Novamente, descarte o filtrado e adicione 750 microlitros de tampão de lavagem às colunas de centrifugação e centrifugue a 17.900 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.

Finalmente, descarte o filtrado e gire novamente as colunas vazias a 17.900 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius. Depois de transferir as colunas de centrifugação para tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro, pipetar 45 microlitros de tampão de eluição e incubar os tubos na bancada do laboratório em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugue as colunas a 17.900 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius.

Mergulhe um gel de agarose a 1% em tampão TAE duplo em uma câmara de eletroforese e, em seguida, misture dois microlitros de tampão de carga quíntuplo com oito microlitros de DNA amplificado. Por fim, carregue todos os 10 microlitros da amostra no gel junto com a escada de DNA. Execute o gel a 75 volts por aproximadamente 90 minutos.

Um gel de agarose representativo demonstra a amplificação de regiões espaçadoras transcritas internas do DNA genômico fúngico derivado de amostras de ar ocupacional. A faixa no extremo esquerdo representa a faixa do marcador de DNA. As bandas à direita representam as regiões espaçadoras internas transcritas amplificadas a partir de diferentes amostras de ar ocupacional com tamanhos que variam de 750 a 1.000 pares de bases.

Um gráfico Krona representativo mostra a presença de diversas espécies taxonômicas de fungos em um ambiente interno. O amostrador de ciclone bio-aerossol do NIOSH foi usado em residências para coletar bio-aerossóis por uma hora para determinar as espécies de fungos presentes. Os dados tabulares representam os índices de diversidade e riqueza de espécies fúngicas em ambientes internos.

Os dados mostram índices mais altos de riqueza de Chao-1, índices de diversidade de Shannon e coeficientes de dissimilaridade de Bray-Curtis em ambientes com ar condicionado e resfriadores evaporativos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar amostras de ar interno e ocupacional e extrair DNA genômico para a análise de populações microbianas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de utilizar os melhores métodos assépticos para evitar a contaminação microbiológica das amostras.