Name: Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a coletar amostras de ar ocupacional e extrair DNA fúngico para análise de diversidade microbiana. Este método identifica fungos não detectados por técnicas tradicionais, auxiliando na avaliação de riscos à saúde de trabalhadores.

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Este trabalho foi financiado em parte por um acordo interinstitucional entre o NIOSH e NIEHS (AES12007001-1-0-6).

1. preparar o sampler de aerossol NIOSH
Nota: O sampler de aerossol NIOSH é um sampler de aerossol de ciclones de dois estágios que recolhe Bioaerossóis usando dois tubos de amostragem e um filtro de politetrafluoretileno (PTFE).
<ol><li>Antes da montagem, verifique cuidadosamente o sampler. Verifique o sampler para garantir que ele não está danificado, todos os parafusos estão no lugar e confortável, e a fita de vedação em torno a costura formada por duas metades está intacta. Inspecione a amostra do-Ring para garantir que não tem quaisquer cortes, rachaduras ou lágrimas e que tem uma camada muito fina de graxa de silicone. Nota: O amostrador inclui um filtro PTFE de 3 µm de 37 mm em poliestireno ou fita de polipropileno filtro de três peças.<ol>
<li>Montar a fita de filtro colocando uma celulose ou a almofada de suporte plástico (incluído com os filtros) na superfície da peça base quadriculada (ver Figura 1). Use filtro pinça para colocar o filtro em cima da almofada de apoio com o lado da coleção voltada para cima.</li>
		<li>Sele as fitas de filtro usando uma prensa manual ou pneumática. Encerramento de mão permitirá o ar vazar em torno do filtro e reduzir a eficiência de coleta. Insira a peça em forma de anel (o capuz de extensão) e usar a imprensa para empurrar para baixo firmemente e uniformemente. Pressione para baixo o capuz de extensão para o filtro firmemente o suficiente para garantir o ar não vaza em torno do filtro. Nota: A parte superior da fita não é usada durante a amostragem, mas deve ser salvo para cobrir o filtro uma vez que a amostragem é completa.</li>
		<li>Encaixar a gaveta montada na parte superior do sampler e empurre para baixo tanto quanto possível. Enrole um pedaço de fita de 19 mm (3/4 de polegada) do lado de fora da gaveta do filtro e amostrador para prender a fita de filtro no lugar e para agir como um selo de backup para evitar vazamentos.</li>
		<li>Parafusar cada tubo firmemente e totalmente o sampler até que fundo e envoltório de fita em torno de cada tubo de vedação para atuar como um selo secundário contra vazamentos. Nota: O primeiro tubo, um tubo de polipropileno de 15 mL, coleta não-respirável partículas com diâmetro aerodinâmico de > 4 µm. O segundo tubo, um tubo de polipropileno microcentrifuga de 1,5 mL, coleta partículas respiráveis entre 1 e 4 µm. As restantes partículas menores, < 1 µm, são coletadas sobre o PTFE filtro (ver Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibre o fluxo de ar através do amostrador NIOSH com uma jarra de calibração antes de cada utilização, como diferenças de filtros e amostradores fará com que o fluxo de ar variar.<ol>
<li>Para usar um frasco de calibração, insira o encaixe de Luer do frasco na parte superior da gaveta do filtro, coloque a amostra no frasco e fechar o frasco.</li>
		<li>Conectar-se a jarra de calibração de um medidor de fluxo de calibração e a bomba de amostragem. Ligue o medidor de fluxo e deixe-a aquecer por alguns minutos. Observe que o medidor de fluxo sempre deve ter um filtro ligado a sua entrada para evitar a contaminação do medidor de fluxo e o amostrador.</li>
		<li>Ligue a bomba de amostragem e permitir que ele seja executado por alguns minutos aquecer e estabilizar.</li>
		<li>Ajuste a bomba para definir a taxa de fluxo correto a 3,5 L/min. Nota: A taxa de fluxo para o classificador de aerossóis NIOSH é geralmente definida como 3,5 L/min. A este ritmo de fluxo, o sampler conforma-se aos critérios de amostragem de partículas respiráveis16ACGIH/ISO. Outras taxas de fluxo podem ser usadas se o corte de diferentes tamanhos é desejadas ou para reduzir o nível de ruído, mas esteja ciente de que se uma vazão diferente é usada, então o sampler estarão já não em conformidade com os critérios de amostragem respirável.</li>
		<li>Quando a calibração for concluída, desligue a bomba e medidor de fluxo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. amostragem de aerossol estático e pessoal
<ol><li>Configure o sampler de aerossol NIOSH para amostragem de qualquer área pessoal ou estático. Nota: Amostragem estática refere-se a usar o sampler de aerossol enquanto está ligado a um tripé ou outro dispositivo de exploração (ver Figura 3), como contra o pessoal de amostragem quando o sampler e a bomba são montados sobre a pessoa que está sendo estudada (ver Figura 4).<ol>
<li>Para amostragem de área estática, mantém os amostradores tão perto como possível à área específica sendo estudados. Manter os amostradores longe de entradas de ar, quarto entradas e lugares que podem ser no caminho do fluxo de ar. Nota: Concentrações de aerossóis podem variar consideravelmente mesmo em distâncias curtas, especialmente se a fonte de aerossol na sala17.</li>
		<li>Para amostragem pessoal, configure o sampler na zona de respiração da pessoa. Anexar o sampler para a lapela, ombro ou no peito e coloque a bomba de amostragem na cintura ou em uma mochila. Nota: A zona de respiração é comumente considerada um hemisfério de 30cm cercam o nariz de uma pessoa da qual a maioria de ar durante a inalação17desenhada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Certifique-se que o tubo amostrador é bem claro das entradas amostrador e que nada está obstruindo as entradas ou interferir com o fluxo de ar para o sistema de punção. O tubo amostrador não deve ser preso ou torcido. Qualquer bloqueio fará com que a bomba parar.</li>
	<li>Ative as bombas. Após um minuto ou dois, verificar se as bombas ainda estão funcionando. Nota: Conduta de ar de amostragem por períodos de tempo, variando de menos de 10 min para um turno de trabalho completo 8 h, dependendo do ambiente10,18,19. Os resultados apresentados na Figura 6 são representativas de um período de amostragem de 60 min em um ambiente interno.</li>
	<li>Depois de amostragem de ar for concluída, colete os tubos de amostra e filtro. Remova a fita da selagem, desaparafuse os tubos e sem recursos. Coloque a terceira peça da gaveta filtro sobre o filtro. Armazenar as amostras em 4 ° C até que esteja pronto para processamento.</li>
</ol>3. extração de DNA genômico de amostras de ar
<ol><li>Extrai DNA genômico (gDNA) de cada fase de amostras do NIOSH BC251. Processar o tubos de colheita de amostragem de ar e filtro separadamente para permitir a determinação de aerossóis microbianas respiráveis e não-respirável na amostra. Nota: Como alternativa, os três estágios podem ser combinados e extraiu-se inóculo de amostra é muito pequeno.<ol>
<li>Em uma classe de segurança biológica II ou banco limpo de fluxo laminar, assepticamente, retire o filtro. Limpe a gaveta de recolha de amostras utilizando etanol a 70% e alavanca a gaveta de amostragem abrir usando uma ferramenta de abertura da gaveta. Use um levantador de filtro para empurrar o filtro e suporte almofada para cima. Segure o filtro usando fórceps de filtro e colocá-lo em uma placa de Petri estéril. O filtro de corte em 6 pedaços iguais e colocá-los em um tubo de 2 mL reforçado contendo grânulos de vidro de 300 mg (0,2 - 0,5 mm).</li>
		<li>Colocar o tubo contendo o filtro em nitrogênio líquido por 30 s e imediatamente colocá-lo em um homogeneizador de moinho do grânulo situado a 4,5 m/s para 30 s.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.2 uma ou duas vezes até que o filtro é desfiado. Pequenos pedaços de filtro intacto podem permanecer. Adicione 0,5 mL de tampão de lise (ureia 4 M, 200 mM Tris, 20 mM de NaCl, ácido de 200mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 7,4).</li>
		<li>Adicione 0,3 mL de tampão de Lise aos tubos de amostrador de ar de 1,5 mL e 15 mL. Vórtice do tubo para 10-15 s enquanto ereto e depois mais 10-15 s invertido. Transferi o conteúdo de cada tubo para tubos de 2 mL reforçado contendo grânulos de vidro de 300 mg. Nota: A maioria do material coletado em cada tubo amostrador irá acumular perto do topo do tubo.</li>
		<li>Processar todos os tubos em homogeneizador de moinho o talão a 4,5 m/s para 30 s e centrífuga-los em 20.000 x g por 1 min a 22 ° C. Sobrenadantes de transferência para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL e centrifugar os tubos a 20.000 x g por 1 min a 22 ° C. Repita este passo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar 30 µ l de reagente de lise (consulte a Tabela de materiais) para cada tubo e incubar os tubos a 37 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicionar 0,2 mL de tampão de ligação (ureia 10 M, 6 M guanidina-HCl, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100, pH 4,4) e proteinase K (100 µ g/mL) para cada tubo e incubar os tubos a 70 ° C por 10 min. Adicione 100 µ l de isopropanol para cada tubo.</li>
	<li>Transferir as extrato soluções em tubos de filtro de fibra vidro (capacidade de 700 µ l) colocados em tubos de colheita de 2ml e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de tampão de remoção de inibidor (5m guanidina-HCl, 20 mM Tris-HCl, pH 6.6, 38% de etanol) para cada tubo e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL.</li>
	<li>Adicionar 0,5 mL de tampão de lavagem (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) para cada tubo e centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro em novos tubos de colheita de 2 mL. Repita este processo.</li>
	<li>Centrifuga os tubos de coleta a 20.000 x g durante um adicional 1 min a 22 ° C, para remover qualquer tampão de lavagem residual. Descartar os tubos de coleção e coloque os tubos de filtro para novos tubos de coleção.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l tampão de eluição (≥70 ° C) (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) para cada tubo de aquecer e incube-los em temperatura ambiente por 1-2 min.. centrifugar os tubos de coleta a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Transferir os tubos do filtro vazio para um tubo de microcentrifugadora estéril 1,5 mL e re-aplicar eluídos da etapa 3.8. Incubar a temperatura ambiente por 1-2 min. centrifugar a 20.000 x g por 30 s a 22 ° C. Nota: Eluídos podem ser usados imediatamente para a etapa 4 ou armazenada a-20 ° C até que esteja pronto para usar. DNA genômico pode ser armazenado por até um ano a-20 ° C. É recomendável que o DNA ser armazenado a-80 ° C se o armazenamento a longo prazo é necessário.</li>
</ol>4. amplificação de ADN ribossómico de fungo
<ol><li>Use primers fúngicas universais para amplificar suas regiões 1 e 2 do gDNA extraído. Nota: Para este protocolo, o primer par Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') são usados para fornecer a maior cobertura do ITS regiões4,5. Outros conjuntos de cartilha, tais como aquelas que amplificar regiões ITS1 ou ITS2 sozinhos, podem ser usados.<ol>
<li>Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para cada amostra em triplicado 50 µ l reacções da polimerase estéril 0,5 mL ou placas PCR de 96 poços da seguinte forma: 5 µ l de modelo extraído DNA (da etapa 3), 33,3 µ l de água de grau PCR, 5 µ l de tampão de x PCR 10 , 1,5 µ l de 50mm MgCl2, 1 µ l de 10 mM STNPCR 2'-5'-trifosfatos, 0,5 µ l de 20 µM Fun18Sf para a frente da primeira demão, 0,5 µ l de 20 µM ITS4R inversa da primeira demão e 0,2 µ l de Taq DNA polimerase.</li>
		<li>Realizar reações em um termociclador: desnaturação a 95 ° C por 3 min; 6 ciclos de desnaturação (96 ° C, 30 s) recozimento (50 ° C, 45 s) e a extensão da primeira demão (72 ° C, 3 min); 20 ciclos de desnaturação (96 ° C, 30 s), recozimento (50 ° C, 45 s) e a extensão da primeira demão (72 ° C, 1 min); e a extensão da primeira demão a 72 ° C durante 10 min. manter as misturas de reação a 4 ° C até o próximo passo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinar que as reações de PCR triplicadas purificam usando um kit de purificação baseados em membrana de sílica. Nota: Este procedimento permite a remoção de componentes PCR (primeiras demão, dNTPs, enzimas, sais, etc.) e outros contaminantes das preparações de DNA amplificadas.<ol>
<li>Combine as três reações para cada amostra (150 µ l total) em tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL. Adicionar tampão de ligação (5m guanidina-HCl, 30% de isopropanol) em um volume de 5 x (750 µ l) e misturar a solução pipetando acima e para baixo 10 vezes.</li>
		<li>Adicione 450 µ l da mistura para girar colunas colocadas em tubos de coleção e centrifugar os tubos a 17.900 x g durante 30 s. Descarte os filtrados. Adicione o restante µ l 450 para as colunas e centrifugar a 17.900 x g por 30 s a 22 ° C. Nota: As colunas de rotação contêm uma membrana de silicone que permite a adsorção do DNA para as colunas.</li>
		<li>Descartar os filtrados e adicionar o tampão de lavagem 750 µ l (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 80% de etanol) para as colunas de rotação. Centrifugar as colunas a 17.900 x g por 30 s a 22 ° C. Nota: Este processo remove os contaminantes a reação de PCR acima mencionada.</li>
		<li>Descartar o filtrado e centrifugar as colunas vazias a 17.900 x g por 1 min a 22 ° C. Nota: Este passo é para remover qualquer resíduo de buffer que pode interferir com aplicações a jusante de lavagem.</li>
		<li>Transferi as colunas de rotação para tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL. Adicionar 45 µ l de tampão de eluição (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) e incubar os tubos à temperatura ambiente por 5 min. Centrifugar as colunas de rotação a 17.900 x g por 1 min a 22 ° C.</li>
		<li>Usar o DNA eluted imediatamente para as etapas 4 e 5 ou armazenar a-20 ° C até que esteja pronto para uso. Nota: Os amplicons podem ser armazenadas por até um ano a-20 ° C. É recomendável que o DNA ser armazenado a-80 ° C se o armazenamento a longo prazo é necessário.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. verificação de fungos ITS amplificação utilizando eletroforese em gel de agarose
<ol><li>Elenco um agarose 1% gel contendo 1 µ g/mL brometo de etídio. Dissolva a agarose em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE) 1x a ferver. Uma vez que a solução esfriar a aproximadamente 50 ° C, adicionar o brometo de etídio e despeje gel de conversão.</li>
	<li>Depois que o gel de agarose solidificou-se, imergir o gel em 1 x TAE e preparar os amplicons para ser carregado no gel. A 8 µ l de DNA amplificado, adicione 2 µ l de 5 x tampão de carregamento. Nota: Estes volumes podem ser ajustados dependendo da concentração do buffer desejado de carregamento.</li>
	<li>Carrega as amostras, todas 10 µ l, para o gel junto com uma escada de DNA para a referência de tamanho. Funcione o gel em 75 V (6 V/cm) para cerca de 90 min e Visualizar bandas, normalmente vistas entre 750 e 1.000 pares de bases, utilizando ultravioleta luz (ver Figura 5).</li>
</ol>6. sequenciamento e análise de fungos ITS regiões
<ol><li>Sequenciar o gDNA extraído ou fúngicas amplificado ITS regiões e analisar as sequências usando métodos atuais e adequados.</li>
</ol>

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<li>Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+and+rrn+gene+copy+number+on+PCR+amplification+of+16S+rRNA+genes+from+a+mixture+of+bacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species.</a> Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).</li>
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Os resultados e conclusões deste relatório são as dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional para a segurança ocupacional e saúde, centros de controle e prevenção de doenças.

Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente ocupacional, usando abordagens baseadas em sequenciamento melhorou a avaliação identificação e exposição de risco de fungos. Usando essa abordagem tem permitido a detecção de muitas espécies de fungos adicionais que muitas vezes não são detectados usando métodos baseados em microscopia de avaliação ou cultura. Um método de amostragem Bioaerossóis de ambientes interiores e ocupacionais e a extração de DNA genômico de amostras de ar para sua amplificação e sequenciamen...

Exposições de fungosas em ambientes interiores e ocupacionais podem resultar em morbidades respiratórias, incluindo a sensibilização alérgica e asma1. Identificação de perigos fúngicas é importante para avaliar o risco e evitar a exposição do trabalhador. Estes perigos fúngicos podem ser resultado de contaminação interna, intrusão de ar exterior ou perturbações ambientais que resultam no transporte de materiais fúngicos em áreas onde os trabalhadores estejam presentes2. Métodos para avaliar a exposição fúngica incluem amostragem cultura viável, bem como a identificação microscópica de esporos fúngicos. Estas abordagens têm várias limitações e muitas vezes ignoram muitas espécies de fungos que poderiam estar contribuindo para a carga geral fúngica3. Abordagens baseadas em cultura só podem diferenciar esses organismos fúngicos viáveis que podem ser cultivados em meios nutritivos. Identificação de esporos de fungos, a nível da espécie através de microscopia pode ser confundido por esporos partilha morfologias semelhantes. Ambos os métodos são altamente dependentes de micologistas para analisar e identificar as espécies de fungos, com muitos remanescentes não identificado.
Para aperfeiçoar metodologias existentes usadas em avaliações de exposição e identificação de risco ocupacional, muitos pesquisadores se voltaram para tecnologias baseadas em molecular. Abordagens de sequenciamento para avaliar a diversidade microbiana em ambientes interiores e ocupacionais revelou um amplo espectro de espécies de fungos encontrados em comparação com métodos tais como a microscopia e cultura viável3,4 ,5. O método aqui apresentado descreve a amostragem do ar de ambientes ocupacionais e extração de DNA genômico para a identificação de potenciais riscos de fungos. Identificação de perigo é realizada por sequenciamento nuclear ribosomal espaçador transcrito interno, o ITS, regiões que são altamente variáveis entre fungos e tem sido comumente usadas para diferenciar espécies de fungos6,7, 8,9. Muitas espécies encontraram em ambientes ocupacionais, tais como algumas espécies do filo Basidiomycota, não são identificáveis na cultura viável e são difíceis de diferenciar ao microscópio. Estes fungos têm sido observados em abundância relativa alta dentro de ambientes interiores e profissionais avaliados pelo sequenciamento fúngicas ITS regiões3,4,10. SEU sequenciamento proporcionou maior conhecimento para a diversidade de fungos encontrados nos ambientes de interiores e ocupacionais.
O protocolo descrito aqui detalhes os métodos usados para coletar, extrair e amplificar fúngicas ITS regiões de Bioaerossóis para análise de sequências. Esta abordagem utiliza o Instituto Nacional de segurança ocupacional e saúde (NIOSH) amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios coletar partículas no ar. Este amostrador foi desenvolvido para coletar Bioaerossóis e separado respirável (≤ 4 µm de diâmetro aerodinâmico) e não-respirável (> 4 µm de diâmetro aerodinâmico) partículas, que permite a identificação de organismos fúngicos dentro de ambientes internos que são mais provável ser inaladas por um trabalhador11. Outros amostradores de ar, incluindo samplers de ciclone, estão disponíveis no mercado que têm a capacidade de coletar partículas dentro da faixa respirável (< 4 µm) usando filtros de12,13. Em contraste, o amostrador de aerossol de ciclones de dois estágios NIOSH separa com base em seu diâmetro aerodinâmico em descartáveis, polipropileno tubos que podem ser processados imediatamente para aplicações a jusante14espécies de fungos.
Os processos de extração de DNA genômico e amplificando as regiões ITS fúngicas são detalhados no presente protocolo. As metodologias de extração apresentadas foram desenvolvidas especificamente para a extração de DNA genômico de fungos e bactérias, como muitos jogos comerciais como alvo de leveduras especificamente15, bactérias ou células de mamíferos. Os primers utilizados neste estudo são selecionados com base em sua cobertura global de ambos os fungos 1 ITS e ITS 2 regiões4,5. Sequenciamento destas regiões permite a comparação de muitas sequências ITS bancadas, incluindo aqueles essa sequência região ITS 1, a 2 de sua região ou regiões o ITS 1 e 2 ITS. A diversidade de fungosa de amostras de ar coletadas em uma configuração interior usando que esses métodos são mostrados, revelando um número substancial de sequências colocadas nos filos Ascomycota e Basidiomycota, bem como outras sequências pertencentes a menos dominantes filos de fungos, tais como Zygomycota. A ampla diversidade de sequências fungosas identificados usando esta abordagem não desejaria ser capturada utilizando metodologias de identificação de risco tradicionais como cultivo ou microscopia. Sequenciamento de regiões ITS fúngicas fornece um método aprimorado para identificar riscos de fungos e permitir uma melhor compreensão das exposições fúngicas indoor e ocupacionais.

<table><tbody><tr><td>Amostrador de ciclone de bioaerossol NIOSH BC251</td><td>NIOSH</td><td>BC251</td><td>O amostrador NIOSH ainda não está disponível comercialmente. Entre em contato com William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) para obter informações sobre como obter o amostrador NIOSH</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga estéreis Fisherbrand com tampas de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-373</td><td>Tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL para amostragem de ar; rosqueamento da tampa do parafuso deve corresponder ao rosqueamento do amostrador NIOSH</td></tr><tr><td>Falcon Tubos de centrífuga cônicos Falcon 15 mL</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>tubos de polipropileno de 15 mL para amostragem de ar</td></tr><tr><td>Fita de Vinil para Sala Limpa, Fácil de Remover, 1/4" de Largura</td><td>Fita de vedação</td><td>McMaster-Carr</td><td>76505A1</td></tr><tr><td>de Filtro, Estireno Transparente, 37 mm</td><td>SKC Inc.</td>de amostragem de 3 peças <td>225-3LF</td><td>(sem filtro). Contém: base de, capuz de extensão, tampa de e plugues de entrada/saída</td></tr><tr><td>Filtros de membrana de fluoroporo hidrofóbico de PTFE, 3.0 &micro; m, 37 mm</td><td>EMD Millipore</td><td>FSLW03700</td><td>Contém: 37 mm, 3.0 &micro; m Filtros PTFE e almofadas de suporte</td></tr><tr><td>Pinça de filtro Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>09-753-50</td><td>pinça de filtro</td></tr><tr><td>Modelo 502 Precision PanaPress</td><td>PanaVise</td><td>502</td> prensa <td>de pneumática é construída a partir desta prensa de mandril de precisão</td></tr><tr><td>Fita isolante de vinil Scotch Super 33+ Fita</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>Jarra</td></tr><tr><td>de calibração multiuso, grande</td><td>SKC Inc.</td><td>225-112</td><td>frasco de calibração</td></tr><tr><td>Universal PCXR4 Sample Pump</td><td>SKC Inc.</td><td>Bomba de amostragem 224-PCXR4</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vazão mássica 4140</td><td>TSI Inc.</td><td>Medidor de vazão</td> <td>4140</td></tr><tr><td>Roche High Pure PCR Template Kit</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11796828001</td><td>usado para extração de DNA genômico. Contém: Tampão de lise, Tampão de ligação, Proteinase K, Tampão de remoção de inibidor, Tampão de lavagem, Tampão de eluição, Tubos de filtro de fibra de vidro e tubos de coleta de 2 ml</td></tr><tr><td>Tubos de Polipropileno Reforçado com Tampa de Rosca Fisherbrand 2 mL com Tampas</td><td>Fisher Scientific</td><td>15340162</td><td>Tubos reforçados de 2 mL para homogeneização de esferas</td></tr><tr><td>Contas de vidro, lavadas com ácido, 212-300 &micro; m</td><td>Contas de vidro Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogeneizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>homogeneizador de contas</td></tr><tr><td>Reagente de lise de células B CelLytic, 10X</td><td>Reagente de lise Sigma-Aldrich</td><td>C8740</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase Taq de platina</td><td>Invitrogen</td><td>10966-018</td><td>Contém: Polimerase Taq de platina, tampão PCR 10X (sem MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extensor</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>18427-088</td><td>10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificação</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Kit usado para purificar amplicons fúngicos. Contém: Tampão PB (tampão de ligação), Tampão PE (tampão de lavagem), Tampão EB (tampão de eluição), corante indicador de pH (opcional) e corante de carregamento GelPilot</td></tr><tr><td>Coruja EasyCast Mini Sistema de Eletroforese em Gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>B1 ou B2</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 KB Plus Escada de DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>10488-085</td><td></td></tr></tbody></table>

coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de dna fúngico

Collection and Extraction of Occupational Air Samples for Analysis of Fungal DNA

Métodos tradicionais de identificação fúngicas exposições em ambientes ocupacionais, tais como cultura e abordagens baseadas em microscopia, tem várias limitações que resultaram na exclusão de muitas espécies. Avanços no campo nas últimas duas décadas têm levado pesquisadores saúde ocupacional recorrer a abordagens baseadas em molecular para a identificação de riscos de fungos. Esses métodos resultaram na detecção de muitas espécies dentro de ambientes interiores e profissionais que não foram detectados usando métodos tradicionais. Este detalhes de protocolo amostras de uma abordagem para determinação de diversidade de fungosa no ar através de extração de DNA genômica, amplificação, sequenciamento e identificação taxonômica de fungos interna transcritos regiões espaçador (ITS). SEUS resultados de sequenciamento na detecção de muitas espécies de fungos que são não detectados ou difíceis de identificar ao nível de espécie, usando a cultura ou a microscopia. Enquanto esses métodos não fornecer medidas quantitativas da carga fúngica, eles oferecem uma nova abordagem para identificação de perigo e podem ser usados para determinar a riqueza global de espécies e diversidade dentro de um ambiente ocupacional.

A distribuição das espécies dentro de um ambiente pode ser avaliada usando abundância relativa, determinando o número de clones de cada OTU identificados nas amostras de ar. Figura 6 é um gráfico Krona representando as espécies taxonomicamente colocadas dentro de um ambiente interior após 60 min de amostragem de ar. Pode-se observar que o ambiente contém uma variedade de espécies dentro de dois grandes filos de fungos, Ascomycota e Basidiomycota, bem como esp...

Determinar a diversidade fúngica dentro de um ambiente é um método utilizado em estudos de saúde ocupacional para identificar riscos para a saúde. Este protocolo descreve a extração de DNA de amostras de ar ocupacional para amplificação e sequenciamento de regiões ITS fúngicas. Esta abordagem detecta muitas espécies de fungos que podem ser negligenciados pelos métodos tradicionais de avaliação.

Coleta e extração de ar ocupacional amostras para análise de DNA fúngico

Traditional methods of identifying fungal exposures in occupational environments, such as culture and microscopy-based approaches, have several ...

O objetivo geral desta metodologia de amostragem de ar e extração de DNA é obter DNA genômico fúngico que possa ser amplificado, sequenciado e colocado taxonomicamente para identificar riscos fúngicos potenciais em ambientes ocupacionais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de avaliação da exposição ocupacional, como a quais riscos fúngicos os trabalhadores estão expostos e que podem resultar em efeitos negativos à saúde. A principal vantagem dessa técnica é que as espécies de fungos que permanecem não detectadas usando métodos baseados em cultura ou microscopia podem ser elucidadas usando abordagens baseadas em sequenciamento.Para montar o do filtro de amostragem de ar, coloque uma almofada de suporte de filtro de celulose na superfície quadriculada da peça de base e, em seguida, com a ajuda de uma pinça de filtro, coloque um filtro em cima da almofada de suporte do filtro com o lado de coleta voltado para cima. Após a montagem, vede o do filtro inserindo a tampa de extensão e pressionando-a firme e uniformemente com uma prensa manual ou pneumática. Em seguida, encaixe o montado em cima do amostrador de aerossol NIOSH e empurre para baixo o máximo possível.Use um pedaço de fita adesiva de 19 milímetros para enrolar a parte externa do do filtro e do amostrador, segurando o do filtro no lugar e agindo como uma vedação de backup para evitar vazamentos. Aparafuse os tubos de coleta firme e totalmente no amostrador até que eles cheguem ao fundo e enrole a fita de vedação ao redor dos tubos atuando como vedação secundária contra vazamentos. Para realizar a amostragem pessoal de aerossol, coloque o amostrador dentro da zona de respiração da pessoa.Prenda o amostrador na lapela, ombro ou peito e, em seguida, mantenha a bomba de amostragem na altura da cintura ou em uma mochila. Ligue as bombas e verifique após um minuto se a bomba está funcionando. Ao completar a amostragem de ar, colete o amostrador de ar do sujeito.Remova a fita de vedação, desparafuse os tubos e coloque uma tampa sobre eles. Coloque o terceiro pedaço de de filtro sobre o filtro. Primeiro, limpe o de amostragem com etanol a 70% e, em seguida, use uma ferramenta de abertura de para abrir o de amostragem enquanto trabalha em uma cabine de segurança biológica Classe II.Em seguida, use um elevador de filtro para levantar a almofada de suporte e o filtro para cima. Em seguida, use uma pinça de filtro para remover o filtro e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Corte o filtro em seis pedaços iguais com um bisturi esterilizado e coloque-os em um tubo reforçado de dois mililitros contendo 300 miligramas de contas de vidro de 200 a 500 micrômetros.Mergulhe o tubo contendo filtro em nitrogênio líquido por 30 segundos e, em seguida, coloque-o rapidamente em um homogeneizador de moinho de esferas a uma velocidade de 4.5 metros por segundo por 30 segundos. Adicione 0,5 mililitros de tampão de lise aos tubos contendo os pequenos pedaços restantes de filtro intacto e, em seguida, adicione 0,3 mililitro de tampão de lise aos tubos de coleta do amostrador de ar de 15 e 1,5 mililitros e vórtice os tubos na posição vertical e invertida por 10 a 15 segundos, respectivamente. Transfira o tampão de lise de cada tubo de coleta para tubos reforçados com dois mililitros contendo 300 miligramas de contas de vidro.Processe os tubos no homogeneizador do moinho de esferas por 30 segundos e, em seguida, centrifugue as amostras a 20.000 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros e centrifugar novamente o sobrenadante a 20 000 vezes a gravidade durante um minuto a 22 graus Celsius. Depois de adicionar 30 microlitros de reagente de lise, incube os tubos a 37 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, adicione 0,2 mililitro de tampão de ligação e 100 microgramas por mililitro de proteinase K ao tubo e, em seguida, deixe os tubos para incubação em um aquecedor de bloco a 70 graus Celsius por 10 minutos. Por fim, adicione 100 microlitros de isopropanol a cada tubo. Em seguida, coloque tubos de filtro de fibra de vidro com capacidade de 700 microlitros em tubos de coleta de dois mililitros e transfira as soluções de extrato para ele.Após a transferência, centrifugue os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Após a centrifugação, insira a fibra filtrante de vidro em tubos de coleta novos e descarte o tubo de coleta. Para cada tubo, adicione 0,5 mililitro de tampão de remoção do inibidor e conduza a centrifugação a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.Descarte o tubo de coleta após a centrifugação e coloque os tubos de filtro em novos tubos de coleta. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de tampão de lavagem a cada tubo e novamente sujeito à centrifugação a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Descarte o tubo de coleta e substitua por novos após a centrifugação.Novamente, adicione 0,5 mililitro de tampão de lavagem a cada tubo e centrifugue a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius. Para remover qualquer tampão de lavagem residual, centrifugue finalmente os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius e descarte os tubos de coleta e substitua-os por novos. Depois de adicionar 100 microlitros de tampão de eluição quente, incube os tubos na bancada do laboratório à temperatura ambiente por um a dois minutos e centrifugue os tubos de coleta a 20.000 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.Coloque os tubos filtrantes em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro e reaplique os eluatos para outra centrifugação redonda. Use tubos de PCR de 0,5 mililitro para configurar reações de 50 microlitros em triplicado com cinco microlitros de DNA já extraído para cada reação, depois programe o termociclador e inicie o ciclo. Misture todas as três reações de PCR em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro.Adicione 750 microlitros de tampão de ligação e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione 450 microlitros da mistura total às colunas de centrifugação inseridas nos tubos de coleta e comece a centrifugar a 17.900 vezes a gravidade por 30 segundos, depois descarte o filtrado e adicione os 450 microlitros restantes da mistura para uma segunda rodada de centrifugação. Novamente, descarte o filtrado e adicione 750 microlitros de tampão de lavagem às colunas de centrifugação e centrifugue a 17.900 vezes a gravidade por 30 segundos a 22 graus Celsius.Finalmente, descarte o filtrado e gire novamente as colunas vazias a 17.900 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius. Depois de transferir as colunas de centrifugação para tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mililitro, pipetar 45 microlitros de tampão de eluição e incubar os tubos na bancada do laboratório em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, centrifugue as colunas a 17.900 vezes a gravidade por um minuto a 22 graus Celsius.Mergulhe um gel de agarose a 1% em tampão TAE duplo em uma câmara de eletroforese e, em seguida, misture dois microlitros de tampão de carga quíntuplo com oito microlitros de DNA amplificado. Por fim, carregue todos os 10 microlitros da amostra no gel junto com a escada de DNA. Execute o gel a 75 volts por aproximadamente 90 minutos.Um gel de agarose representativo demonstra a amplificação de regiões espaçadoras transcritas internas do DNA genômico fúngico derivado de amostras de ar ocupacional. A faixa no extremo esquerdo representa a faixa do marcador de DNA. As bandas à direita representam as regiões espaçadoras internas transcritas amplificadas a partir de diferentes amostras de ar ocupacional com tamanhos que variam de 750 a 1.000 pares de bases.Um gráfico Krona representativo mostra a presença de diversas espécies taxonômicas de fungos em um ambiente interno. O amostrador de ciclone bio-aerossol do NIOSH foi usado em residências para coletar bio-aerossóis por uma hora para determinar as espécies de fungos presentes. Os dados tabulares representam os índices de diversidade e riqueza de espécies fúngicas em ambientes internos.Os dados mostram índices mais altos de riqueza de Chao-1, índices de diversidade de Shannon e coeficientes de dissimilaridade de Bray-Curtis em ambientes com ar condicionado e resfriadores evaporativos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como coletar amostras de ar interno e ocupacional e extrair DNA genômico para a análise de populações microbianas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de utilizar os melhores métodos assépticos para evitar a contaminação microbiológica das amostras.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

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