Medindo a forma e o tamanho das partículas de lodo ativado imobilizada em ágar com um Pipeline de Software de código aberto

O tamanho e a forma das partículas de lodo ativadas são fundamentais para a eficiência do tratamento de águas residuais. No entanto, sua medição é muitas vezes ad hoc. Este protocolo fornece uma medida repetível, bem definida e semi-automatizada para sua medição.

A principal vantagem deste protocolo é que ele pode medir uma grande população de partículas sobre uma ampla gama de morfologias, reduzindo o viés subjetivo e sistemático. Embora esta técnica esteja focada na lama ativada, tecnicamente qualquer coisa que tenha a mesma morfologia de partículas como microplásticos pode ser medida com este método. Ao tentar essa técnica pela primeira vez, tente fazer uma placa de cada vez e pratique os movimentos físicos de fazer aquela placa.

Além disso, tome seu tempo com a microscopia. A versão em vídeo deste artigo é importante porque a amostragem e a preparação da placa requerem muitas pequenas técnicas que são melhor comunicadas visualmente. Além disso, mostrar e ver boas fotos de placas são importantes para garantir a reprodutibilidade.

Demonstrando este protocolo hoje é Joseph Weaver, um candidato ao PHD no meu laboratório. Para começar, adquira uma amostra representativa de uma porção bem mista do reator. Misture suavemente a amostra e, em seguida, despeje imediatamente o volume de amostra determinado em um tubo centrífuga de 15 mililitros.

Em seguida, adicione cinco microliters de um por cento de azul de metileno a cada amostra. Cape e misture a amostra invertendo suavemente o tubo pelo menos três vezes. Deixe as amostras manchar por pelo menos cinco, mas não mais do que 30 minutos em temperatura ambiente.

Uma vez manchado, transfira um volume suficiente de ágar derretido de 7,5% e água deionizada para o tubo centrífuga, a fim de levar o volume total do tubo para entre 6,5 e 9 mililitros. Em seguida, recapitulando os tubos de centrífugas e inverter-os suavemente pelo menos três vezes para misturar a amostra no ágar. Enquanto aponta a tampa para longe de si mesmo, abra a tampa.

Despeje o conteúdo do tubo de cada tubo em sua própria placa de petri de plástico de 100 mililitros enquanto balança suavemente a placa para obter um revestimento completo e suave e uma distribuição visualmente uniforme de partículas. Deixe as placas esfriarem à temperatura ambiente por pelo menos 5 minutos, até que o ágar se solidifique. Coloque a placa descoberta de frente para cima no estágio do microscópio de um microscópio estéreo que é capaz de 10 a 20 vezes a ampliação.

Ilumine a amostra de baixo com luz ainda difusa, utilizando equipamentos como suporte de iluminador led ou placa de luz. Abra o software de captura de imagens e certifique-se de que o caminho da luz do microscópio seja definido como foto. Em seguida, selecione a câmera apropriada da lista de câmeras.

Ajuste o microscópio para que várias partículas apareçam no plano focal com bordas grandes e bem definidas. Use uma ampliação de 10 a 20 vezes para medir partículas enquanto mantém um plano focal relativamente profundo. Remova temporariamente a placa de ágar e coloque o micrômetro no palco.

Ajuste o foco fino até que as graduações no micrometro pareçam fortemente focadas no software de captura de imagem. E calibrar a relação pixel para micron. Em seguida, defina o zoom para 100%, clicando na exibição e selecionando o tamanho real.

Em seguida, selecione opções e vá para calibrar. Aqui, alinhe a barra de calibração vermelha no principal viewport ao longo do eixo longo do micrômetro. Com as barras verticais centradas nas graduações zero e 200 míces.

Na caixa de diálogo calibrada, digite o nível de ampliação atual e o comprimento real de 200 mícrons. Se já calibrado, selecione a ampliação na barra de menu e selecione o nível de ampliação atual para confirmar a calibração. No menu de medidas, vá para a linha e selecione linha arbitrária.

Clique na intersecção da graduação zero e eixo longo do micrômetro. Em seguida, clique novamente no cruzamento em 200 mícrons e no eixo longo. Uma calibração correta deve ser exibida em aproximadamente 200 mícrons.

Exclua a linha clicando no botão selecionar objeto, clicando na linha, pressionando a exclusão e pressionando sim na caixa de confirmação. Em seguida, substitua a placa de ágar e ajuste o foco fino para obter o máximo de detalhes no software de imagem. Para isso, primeiro aumente a profundidade do bit do valor máximo permitido selecionando o botão de rádio no painel de profundidade de bits da barra lateral da câmera.

Além disso, defina o software para adquirir imagens em escala de cinza selecionando o botão de rádio apropriado no painel de grau de cor da barra lateral da câmera. Agora, destrua todos os painéis de barras laterais abertas entre exposição e histograma. Reduza o ganho para um e aumente a exposição até que uma imagem clara apareça na viewport e até que o histograma apareça como uma distribuição que não é cortada por nenhuma das extremidades da caixa de histograma.

Ajuste o histograma para evitar mais e sob exposição. No painel histograma da barra lateral da câmera, deslize o limite esquerdo do histograma para fora dos valores mais baixos e o limite direito para apenas fora dos valores mais altos. Salve a imagem como um arquivo TIF não comprimido.

Inclua informações de ampliação nos metadados de imagem verificando a caixa de informações de salvamento com calibração ao salvar. Selecione outra área que não se sobreponha às imagens anteriores seguindo um caminho que alterna entre a esquerda e a direita para a esquerda enquanto se move para baixo da placa. Capture pelo menos 500 partículas visualmente estimadas para análise.

Adquira o código de análise de partículas clonando o repositório GIT. Na linha de comando, recupere a versão mais recente do código digitando no comando mostrado aqui. Instale o código de análise seguindo as instruções no arquivo de texto read me encontrado no diretório de nível superior do repositório clonado.

Em seguida, edite um arquivo de texto listando os diretórios a serem processados juntamente com parâmetros opcionais. Consulte os exemplos e subdiretório de análise para uma lista de parâmetros e exemplos. Agora, execute a análise na linha de comando digitando o comando mostrado aqui.

O caminho de Fiji é o diretório em que imagemJ-win64. exe está localizado. E paramsfilar a localização do arquivo de texto descrevendo a configuração de análise.

O nome do executável pode diferir dependendo do sistema operacional em que Fiji está instalado. A análise será executada automaticamente e levará alguns minutos a algumas horas, dependendo do tamanho e número de imagens. Em seguida, examine os arquivos de controle de qualidade localizados no subdiretório de sobreposição do diretório de saída especificado.

Observe imagens com névoa espúria ou partículas mal capturadas, todas aparentes como contornos sombreados que não correspondem ao fundo. É isso, é isso. Os dados estão agora prontos para análise específica do experimento e geração de figuras.

Embora nenhum método de limiar de partículas seja perfeito, aqui está um exemplo de resultados aceitáveis. Ao avaliar imagens QC, há três erros comuns encontrados. Falha em se adequar com precisão aos limites das partículas, falha na identificação de partículas e inclusão de artefatos.

Aqui, as distribuições de partículas entre dois reatores experimentais ao longo do tempo são exibidas e combinadas com metadados qualitativos observados pelo pesquisador. Este gráfico mostra que, neste caso, os reatores tinham geralmente distribuições de tamanho de partículas semelhantes que tendiam a uma média maior e maior disseminação à medida que o tempo progredia. Ao realizar este procedimento, é fundamental revestir uniformemente a placa com uma fina camada de ágar contendo partículas uniformemente distribuídas.

Certifique-se de praticar e tomar o seu tempo. Além desse procedimento, partículas interessantes poderiam ser extirpadas do ágar e estudadas. Em termos de dados, os arquivos resultantes deste protocolo são bem definidos e o céu é o limite analiticamente.

Esta técnica abriu caminho para fornecer novas percepções sobre lodo granular aeróbico. Sua morfologia é muito importante e nos permitiu medi-la de uma forma padrão. O esgoto é biologicamente ativo.

As práticas de nível 1 de bio segurança são incentivadas. Além disso, como o ágar pode borbulhar quando micro-ondas e pode pulverizar gotículas quentes ao abrir o tubo centrífuga.