Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do RNA, como qual é o significado biológico de RdRP ou TERT em células humanas? A principal vantagem desta técnica é que este ensaio é estabelecido como o primeiro método sensível para detectar a atividade de RdRP humana expressa em células. Comece este procedimento com a preparação de células HeLa conforme descrito no protocolo de texto.

Lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS. Em seguida, centrifugue a amostra a 1.450 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Use um mililitro de tampão de lise A gelado por 10 milhões de células para lisar as células por pipetagem suave.

Sonicar a amostra em um tubo de 1,5 mililitro a uma amplificação do sonicador de 25% por 10 segundos. Após a sonicação, centrifugue a amostra a 20.400 vezes a gravidade por 15 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e transfira um mililitro de cada sobrenadante para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Pré-limpe o lisado adicionando 40 microlitros de grânulos de proteína A-agarose pré-lavados por um mililitro do lisado. Misture bem invertendo o tubo várias vezes. Em seguida, gire a amostra por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugar a amostra a 13 000 vezes a gravidade durante um minuto a quatro graus Celsius e recuperar o sobrenadante. Em seguida, adicione 40 microlitros de esferas de proteína A-agarose pré-lavadas e 10 microgramas de anticorpo TERT anti-humano no lisado pré-limpo. Misture bem invertendo o tubo várias vezes e gire a amostra a quatro graus Celsius durante a noite.

Após a centrifugação a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Em seguida, lave as contas com o Wash Buffer One. Adicione um mililitro de Wash Buffer One às contas e misture bem invertendo o tubo.

Em seguida, gire a amostra por cinco minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue a amostra a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita esta etapa três vezes adicionais.

Após a lavagem da solução AGC conforme descrito no protocolo de texto, trate os grânulos com nuclease microcócica ressuspendendo-os em 60 microlitros da mistura de reação da nuclease microcócica por pipetagem suave. Em seguida, agite a amostra suavemente em uma plataforma giratória de um shaker colocado em uma incubadora do tipo Peltier por 15 minutos a 25 graus Celsius. Depois de centrifugar a amostra a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante.

Finalmente, lave os grânulos duas vezes com uma solução AGC contendo três milimolares EGTA e lave os grânulos uma vez com o tampão de lavagem dois, conforme descrito no protocolo de texto. Preparar a mistura de reacção RdRP num novo tubo, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione seis microlitros de trifosfato de uridina marcado no grupo alfa fosfato com P dash 32 à mistura de reação e misture bem pipetando.

Em seguida, adicione um microlitro de RNA molde à mistura e misture bem. Ressuspenda os grânulos com 20 microlitros da mistura de reação RdRP resultante. Em seguida, agite a amostra suavemente em uma plataforma giratória de um shaker colocado em uma incubadora do tipo Peltier por duas horas a 32 graus Celsius.

Após a incubação, adicione 5,4 microlitros de 20 miligramas por mililitro de Proteinase K e 45,4 microlitros de tampão 2X Proteinase K à mistura de reação. Misturar pipetando, e agitar a amostra numa incubadora do tipo Peltier durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de adicionar 109,2 microlitros de água livre de RNase à amostra, adicione 200 microlitros de fenol-clorofórmio ácido.

Misture bem por vórtice antes de centrifugar a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por cinco minutos à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Repita esta etapa uma vez.

Em seguida, adicione 20 microlitros de acetato de sódio de três molares, pH 5,2, quatro microlitros de transportador de precipitação e 250 microlitros de etanol à fase aquosa. Agite bem o tubo para misturar. Centrifugue a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por 20 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.

Em seguida, lave o pellet com 300 microlitros de etanol frio a 70% por volume armazenado a menos 20 graus Celsius. Centrifugue a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e seque o pellet ao ar.

Ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água livre de RNase. Preparar a mistura de reacção da RNase num novo tubo, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 180 microlitros da mistura de reação de RNase à amostra.

Em seguida, incube o tubo por duas horas a 37 graus Celsius. Adicione 2,3 microlitros de 10% de volume por volume SDS à amostra e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione dois microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K à amostra e incube por mais 15 minutos a 37 graus Celsius.

Agora, adicione 205 microlitros de ácido fenol-clorofórmio à amostra. Depois de misturar e centrifugar como antes, transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicione acetato de sódio de três molares, transportador de precipitação e etanol à fase aquosa, seguido de mistura, centrifugação e lavagem do pellet conforme realizado anteriormente.

Aqui são mostrados três resultados representativos do ensaio IP-RdRP em células HeLa tratadas com nocodazol ou DMSO para células não manipuladas. Um RNA de 34 nucleotídeos sintetizado quimicamente foi usado como modelo. Após a exposição durante a noite, os produtos RdRP podem ser vistos entre 20 a 30 nucleotídeos, especificamente em células HeLa dentro da fase mitótica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar a atividade RdRP do TERT humano.