Name: Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a detectar atividade de RNA polimerase dependente de RNA da TERT humana em células HeLa usando imunoprecipitação e reações enzimáticas. Este ensaio sensível permite estudar a função biológica da RdRP na biologia do RNA.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo projeto para desenvolvimento de pesquisas inovadoras sobre câncer Therapeutics (P-DIRECT) (15cm0106102h0002, K.M.) e o projeto para pesquisa do câncer e evolução terapêutica (P-criar) (16cm 01061150001, K.M.) da agência do Japão para a pesquisa médica e desenvolvimento, AMED; a Fundação de ciência Takeda (Y.M.); Concessão do fundo de pesquisa do câncer de princesa Takamatsu (13-24520, Y.M.); e JSPS KAKENHI Grant número JP16K07133 (Y.M.).

1. reagente Setup
<ol><li>
Reagentes utilizados para sincronização do celular
	<ol>
<li>Para gerar médio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) contendo timidina 2,5 mM, dissolva 30,28 mg de timidina por 1 mL de água de grau de cultura de tecidos para preparar timidina 125 mM. Filtra a solução com uma unidade de filtro de seringa 0,22 do μm. Adicione 1 mL do thymidine 125mm recentemente preparada por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal bovino (FBS).</li>
		<li>Para gerar DMEM contendo 0,1 μg/mL de nocodazole, dissolva nocodazole em dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar 5 μg/μL nocodazole. Adicionar 1 µ l de 5 µ g / µ l nocodazole por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.</li>
		<li>Para gerar DMEM contendo 0,002% (vol/vol) de DMSO, adicione 1 µ l de DMSO por 50 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagentes utilizados para o ensaio do IP-RdRP
	<ol>
<li>Prepare-se do lysis buffer r: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) e 0,5% (vol/vol) Nonidet P-40 (NP-40). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 5 x tampão de acetato: ácido 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic de 50mm (HEPES)-KOH (pH 7,8), acetato de potássio de 500 mM e 20 mM MgCl2. Armazene os reagentes à temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar o tampão de acetato de 1: 1 x de tampão de lavagem, glicerol 10% (vol/vol), 0,1% (vol/vol) Triton x X-100 e 0.06 inibidor da protease cocktail, ácido ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-gratuito. Prepare o tampão de lavagem 1 dia útil ou no dia antes do uso. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar a solução AGC: 1x tampão de acetato, glicerol 10% (vol/vol) e 0,02% (wt/vol) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonat (CAPS). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Para gerar solução AGC contendo 2 mM CaCl2, adicione 100 µ l de 1 M CaCl2 por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Para gerar AGC solução contendo bis de etileno glicol de 3mm (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA), adicione 375 µ l de 0,4 M EGTA (pH 7,5) por 50 mL da solução AGC. Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare o tampão de acetato de 2: 1 x de tampão de lavagem e rachaduras de 0,02% (wt/vol). Armazenar o reagente a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar a solução HMD: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 e 2 mM ditiotreitol (DTT). Armazenar o reagente a-20 ° C. Nota: Solução HMD deve ser renovada pelo menos em três meses.</li>
		<li>Prepare 2 x buffer de Proteinase K: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) Dodecil sulfato de sódio (SDS). Armazenar o reagente a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare 2 x tampão de carregamento: 95% (vol/vol) formamida, 20 mM de EDTA e 1% (wt/vol) laranja G. armazenam o reagente a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de células HeLa
Nota: Preparar células HeLa sincronizada na fase mitótica (manipulado) ou dividir de forma assíncrona (unmanipulated). Cultura de células na presença de 5% de CO2 a 37 ° C.
<ol><li>
Sincronização de células HeLa em mitose
	<ol>
<li>Placa 1 x 106 células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM contendo timidina 2,5 mM e 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 24h.</li>
		<li>Lavar as células três vezes com 10ml de soro de tampão fosfato (PBS) (-) e cultura de células com 10 mL de DMEM contendo 10% (vol/vol) FBS para 6 h.</li>
		<li>Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,1 µ g/mL de nocodazole e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.</li>
		<li>Agite o prato de cultura e recuperar o sobrenadante contendo as células mitóticas desanexadas. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de unmanipulated células HeLa
	<ol>
<li>Placa 1 x 106 células HeLa com 10 mL de DMEM suplementado com 10% (vol/vol) FBS em um prato de cultura de 10 cm.</li>
		<li>Dois dias depois de chapeamento, substitua o médio com 10 mL de DMEM com 10% (vol/vol) FBS. Cultura de células para 30 h.</li>
		<li>Substituir o médio com 10 mL de DMEM contendo 0,002% (vol/vol) DMSO e 10% (vol/vol) FBS e cultura de células para 14 h.</li>
		<li>Colete as células por tripsinização usando 0,7 mL de tripsina (2,5 g/L), contendo 1 mM EDTA. Conte o número de celular para o ensaio de IP-RdRP.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 490 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Nota: O centrifugado pode ser armazenado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-RdRP ensaio
<ol><li>Preparação de grânulo proteína A-agarose
	<ol>
<li>Transferi 1 mL (cama volume 500 µ l) de resina de afinidade para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 800 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Centrifugar a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes (totais três lavagens).</li>
		<li>Adicione a 800 µ l de tampão de Lise aos talões, misture bem o tubo várias vezes por inversão. Gire o tubo durante a noite (ou pelo menos 4 h) a 4 ° C em um agitador rotativo.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 800 x g durante 3 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de tampão de Lise aos talões e misture bem o tubo várias vezes por inversão. Armazenar os grânulos a 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de lisado celular
	<ol>
<li>(Opcional) Se as células são congeladas no passo 2, coloque e descongelar as células congeladas no gelo até as células tornam-se solto.</li>
		<li>Lave as células uma vez com 10 mL de PBS (-). Centrifugar a amostra a 1.450 x g por 5 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante.</li>
		<li>Lise as células com tampão de Lise gelada um (1 mL de tampão de Lise A por 1 x 107 das células) pipetando suave.</li>
		<li>Proceda à sonicação a amostra em um tubo de 1,5 mL com as seguintes condições; conjunto de amplificação do sonicador em 25% e proceda à sonicação durante 10 s.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 20.400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Recolha o sobrenadante. Transferi 1 mL do sobrenadante para tubos de microcentrifuga de 1,5 mL. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Imunoprecipitação
	<ol>
<li>Pre-Limpe o lisado de passo 3.2.6 adicionando 40 µ l (grânulo volume 20 µ l) de grânulos de agarose-A proteína lavada por 1 mL do lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra por 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 13.000 x g por 1 min a 4 ° C e recuperar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicionar 40 µ l (cama volume 20 µ l) de grânulos de proteína lavada A-agarose e 10 µ g de anticorpo TERT anti-humano (clone: 10E9-2)8 para o pre-apuradas lisado. Misture bem o tubo várias vezes por inversão e girar a amostra a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Lave os grânulos com tampão de lavagem 1: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 1 aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita mais três vezes.</li>
		<li>Lave os grânulos de uma vez com solução AGC contendo 2 mM CaCl2: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 2 mM CaCl2 aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Tratar os grânulos com nuclease Micrococcal (MNase): prepare a mistura de reação MNase descrita na tabela 1. Resuspenda as contas em 60 µ l da mistura de reação MNase pipetando suave. Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de Peltier-tipo para min 15 a 25 ° C. Nota: É muito importante usar um agitador ondulante e seguir rigorosamente o limite de velocidade nesta etapa. Outro tipo de abanadores, tais como misturadores rotativos, não são recomendados.</li>
		<li>Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Lave os grânulos duas vezes com a solução de AGC 3mm EGTA: adicionar 1 mL de solução AGC contendo 3 mM EGTA aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.</li>
		<li>Lave os grânulos uma vez com o tampão de lavagem 2: adicionar 1 mL de tampão de lavagem 2aos talões, misture bem por inversão do tubo e girar a amostra por 5 min a 4 ° C. Centrifugar a amostra a 3.300 x g durante 0,5 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. Manter os grânulos no gelo durante a criação de reação RdRP. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase.</li>
	</ol></li>
	<li>Reação de RdRP
	<ol>
<li>Prepare uma mistura de reação de RdRP em um novo tubo conforme descrito na tabela 2.</li>
		<li>Adicione 6 µ l de [α -32P] UTP (3.000 Ci/mmol) para a mistura e misture bem por pipetagem. Nota: ATP [α -32P], [α -32P] CTP ou GTP [α -32P] pode ser usado para a reação ao invés de [α -32P] UTP.</li>
		<li>Adicionar 1 µ l do modelo de RNA (1 µ g / µ l) para a mistura e misture bem por pipetagem. Nota: Para estabelecer o RdRP ensaio, o seguinte modelo de RNA é recomendado: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Resuspenda as contas com 20 µ l da mistura de reação de RdRP da etapa 3.4.3 pipetando.</li>
		<li>Agite a amostra (20 a 25 rpm) em uma plataforma giratória de um agitador definido em uma incubadora de peltier-tipo para h 2 a 32 ° C.</li>
		<li>Adicione 5,4 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) e 45,4 µ l de tampão de Proteinase K x 2 a mistura de reacção. Misture por pipetagem e shake (rpm de 20 a 25) a amostra em uma plataforma giratória definida em uma incubadora de Peltier-tipo por 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione 109,2 µ l de água livre de RNase para a amostra.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Misture bem por vórtice e centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo. Repita este passo uma vez.</li>
		<li>Adicionar 20 μL de acetato de sódio 3M (pH = 5,2), 4 µ l de transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota. Atenção: Execute todos os procedimentos em condições de livre de RNase. Nota: A pelota da etapa 3.4.11 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamento de RNase
	<ol>
<li>Resuspenda o pellet de passo 3.4.11 em 20 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Prepare uma mistura de reação de RNase em um novo tubo conforme descrito na tabela 3.</li>
		<li>Adicionar 180 µ l da mistura de reação de RNase para a amostra e incubar o tubo para 2 h a 37 ° C.</li>
		<li>Adicionar 2,3 µ l de SDS 10% (vol/vol) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicionar 2 µ l de Proteinase K (20 mg/mL) para a amostra e incube por 15 min a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione 205 µ l de ácido fenol-clorofórmio para a amostra. Mistura bem pelo vórtice, centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a fase aquosa para um novo tubo.</li>
		<li>Adicione 20 μL de acetato de sódio 3M (pH 5.2), 4 µ l da transportadora de precipitação e 250 µ l de etanol na fase aquosa. Agitar o tubo bem para misturar e, em seguida, centrifugar a amostra a 21.100 x g por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Lave o pellet com 300 µ l de álcool etílico (vol/vol) 70% frio armazenado a-20 ° C. Centrifugar a amostra a 21.100 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Desprezar o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota. Nota: A pelota da etapa 3.5.9 pode ser armazenada a-20 ° C durante pelo menos 2 dias.</li>
	</ol></li>
	<li>Autoradiografia e eletroforese em gel
	<ol>
<li>Resuspenda a amostra com 20 µ l de água livre de RNase.</li>
		<li>Adicione 20 µ l de 2 x tampão de carregamento.</li>
		<li>Ferva a amostra durante 10 minutos a 95 ° C. Esmaga a amostra no gelo.</li>
		<li>Funcione o gel. No caso o tamanho do modelo 34 nts (ver também passo 3.4.3), gel de poliacrilamida 7 M ureia - 10% é usado na electroforese do gel de desnaturação.</li>
		<li>Seca o gel com um secador de gel.</li>
		<li>Expor o filme com o gel seco dentro de uma gaveta de raio-x com uma intensificação da tela a-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
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<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ensaio de RdRP-IP é um método sensível para detectar atividade RdRP de TERT humana. Proteína TERT é altamente expressa em células mitóticas HeLa, no qual TERT constitui a RdRP complexo8,9,10. Isto sugere que células mitóticas HeLa são um material ideal para detectar atividade RdRP. O protocolo descrito acima, as células HeLa mitóticas e não-sincronizadas estão incluídas como um positivo e um exemplo negativo, respectivamente. Como mostrado na figura 1A, produtos de ensaio RdRP desde o modelo recomendado de RNA em células mitóticas HeLa mostram sinais radioativos amplos entre 20 a 30 nt. Além de células HeLa, temos realizado o ensaio com diferentes tipos de linhagens celulares e encontrado que o padrão do sinal pode ser alterado na célula diferentes tipos9: algumas mostram um sinal forte apenas cerca de 30 nt, alguns mostram um padrão similar com as células HeLa. Nós também ter realizado o ensaio com modelos de RNA que não sejam o 34 nt modelo8, curta e longa (~ 300 nt) RNAs com várias sequências e com êxito obtido RdRP produtos desses modelos apesar de haver alguma preferência. Para o primeiro julgamento, no entanto, nós recomendamos usar as células HeLa na fase mitótica e a modelo nt RNA 34. RdRPs pode gerar RNA double-stranded em um primeira demão-dependente e em uma maneira independente da primeira demão de11. Informamos que a TERT preserva esta propriedade como humano RdRP97,; TERT sintetiza dsRNA de um modelo de RNA com 3'-foldback estrutura através de um mecanismo de costas-ferragem7. Para o modelo nt RNA 34, TERT sintetiza costas complementares sem usar primers9. Para detectar especificamente a RdRP produtos sintetizados em uma forma independente de cartilha, ou seja, de novo sintetizada RNA produtos, [α -32P] NTP pode ser substituído com [γ -32P] NTP na reação RdRP9.
MNase tratamento de complexos imunes TERT em grânulos é um passo fundamental para alcançar os resultados desejados. Se o tratamento MNase é executado muito tempo ou com intensa agitação, os produtos RdRP seria reduzidos notavelmente. Para evitar tais problemas, recomendamos fortemente a seguir rigorosamente o protocolo cuidadosamente. Solução HMD é outro fator crítico para o sucesso. Se você encontrar que os sinais são muito fracos, substitua a solução HMD para um recém preparada.
Em todo o protocolo, um deve tomar muito cuidado para evitar a contaminação de RNase. Tratamento de ribonuclease deve ser realizado com equipamento dedicado. Após manipular a Ribonuclease, um deve descartar dicas e tubos com RNase imediatamente, eliminam RNase com solução especializada (por exemplo, RNase quieto) e alterar groves.
TERT interage não só com TERC mas também de muitos tipos de RNAs endógenos, e registramos parte deles7. Modificação no ensaio de IP-RdRP, tais como o ensaio de IP-RdRP sem tratamento MNase, irá fornecer uma lista completa de modelos de RNA endógenas para o guia de atividade e bioinformatic RdRP TERT-associado em suas características de sequência. Nós tem aplicado com sucesso este protocolo ao tecido lisado. Porque TERT é expresso em uma variedade de tecidos normais e tumor, este ensaio pode ser útil para investigar a função enzimática não-canônicos de TERT em humanos.

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é conhecido como a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero usando o componente de RNA telomerase (TERC), o RNA específico do modelo1. Embora TERT polimeriza DNA oligospermia como um componente da telomerase, as análises filogenéticas e estruturais indicam que TERT está intimamente relacionado com a polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs), bem como viral transcriptase reversa e compartilha os domínios com Estes polymerases2,3,4. RdRP é a enzima que gera a cadeia de RNA complementar para um modelo de RNA. A enzima é codificada não só em vírus, mas também em organismos-modelo, tais como a planta, o fermento e o worm, e síntese de RNA double-stranded por RdRP contribui para transcricional e pós-transcricional silenciamento nestes organismos5,6 . Embora RdRP humano tinha desaparecido há muito tempo, encontramos a RdRP atividade em TERT humana em 20097.
Nós primeiro confirmou a RdRP atividade de TERT com proteína recombinante7, em seguida, estabeleceu um ensaio sensível em vitro para detectar atividade RdRP de endógena TERT8. Aqui, demonstramos o em vitro RdRP ensaio (ensaio de IP-RdRP) para TERT endógena. Este método começa com imunoprecipitação (IP) de TERT endógena e é seguido por em vitro RdRP reação, na qual ribonucleotídeos radioactivos são incorporados em vertentes de RNA nascentes.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solução mista de penicilina-estreptomicina</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS(-))Wako</td><td></td> <td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Timidina</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>clorídriconacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2- [4- (2-hidroxietil) -1-piperazinil] ácido etanossulfônico (HEPES)</td> <td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potássio acetato</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2&bull; 6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polioxietileno(10) éter octilfenílico (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, isento de EDTA</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2&bull; 2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease microcócica (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol bis (b-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Colomimidopropil)dimetilamônio]-1-propanossulfonato (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM cada</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-32P]UTP (3.000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use RI fresco para o ensaio</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Ácido-Fenol:Clorofórmio, pH 4,5 ( com IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Acetato de sódio</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Transportador de precipitação</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase Uma ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamida, nacalai desionizado</td><td>tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético Sal dissódico di-hidratado (EDTA)</td> <td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>, por exemplo, ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>, por exemplo, TOMY</td><td>EX-135</td><td>Para a etapa B)</td></tr> <tr><td>Centrífuga micro refrigerada</td><td>, por exemplo, KUBOTA</td><td>3740</td><td>Para a etapa 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Coloque uma microponta (# 4422) no sonicador, para a etapa 6.4</td></tr><tr><td>Centrífuga micro refrigerada</td><td>, por exemplo, TOMY</td><td>MX-305</td><td>Para a etapa 6.5</td></tr><tr><td>Incubadora resfriada</td><td>, por exemplo, Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Coloque um agitador rotativo dentro</td></tr><tr><td>Agitador rotativo</td><td>, por exemplo, TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora resfriada&nbsp;</td><td>por exemplo, TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Defina um shaker " MINI ONDA" dentro, para a etapa 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>Um agitador para as etapas 7.7, 8.5 e 8.6</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>, por exemplo, TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Defina um agitador " MINI ONDA" interno, para as etapas 8.5 e 8.6</td></tr><tr><td>Incubadora de blocos</td><td>, por exemplo, ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

detecção semi-quantitativa de atividade rna-dependente do rna polimerase humana telomerase transcriptase reversa proteína

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) é a subunidade catalítica da telomerase, e se alonga o telômero através da atividade da DNA polimerase RNA-dependente. Embora TERT é nomeado como um transcriptase reversa, análises estruturais e filogenéticas de TERT demonstram que TERT é um membro dos polymerases destros e refere-se à polimerase de RNA-dependente do RNA viral (RdRPs) bem como viral transcriptase reversa. Em primeiro lugar identificamos RdRP atividade de TERT humana que gera o RNA complementar suporta um modelo de RNA não-codificante e contribui para RNA silenciar em células cancerosas. Para analisar essa atividade enzimática não-canônicos, nós desenvolvido RdRP ensaio com terc recombinante em 2009, posteriormente, estabelecido em vitro RdRP ensaio para TERT endógena. Este manuscrito, descrevemos o último método. Brevemente, imunocomplexos TERT são isolados de células e incubados com modelo de RNA e rNTPs incluindo rNTP radioativo para reação RdRP. Para eliminar o single-stranded do RNA, produtos de reacção são tratados com RNase I e os produtos finais são analisados com eletroforese em gel de poliacrilamida. Radiolabeled RdRP produtos podem ser detectados por autoradiografia após exposição durante a noite.

Com o modelo recomendado de RNA, radioativo RdRP produtos são observados entre 20 a 30 nucleotídeos (nt), especificamente em células HeLa na fase mitótica após a exposição durante a noite (figura 1A). Normalmente, a intensidade do sinal dos produtos RdRP demonstra dois picos que são posicionados em torno de 25 nt e 30 nt em consonância com a distribuição de tamanho dos produtos confirmado pela próxima geração de sequenciamento9. Em contraste com células mitóticas, células HeLa sem sincronização demonstram quase ausência dos produtos radioactivos nt 20 – 30. Oval de sinais, que são colocados abaixo de 20 nt em todas as amostras, são inespecíficas trações.
No caso de que há apenas um produto nt ~ 30 com sinal fraco em células mitóticas HeLa, indica que a reação de RdRP não correu bem. Por exemplo, se MNase tratamento é realizado aproximadamente e inadequadamente, a intensidade de sinal em HeLa mitótica células diminui significativamente (figura 1B). RdRP reação realizada com solução antiga HMD também reduz os produtos (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Figura 1 : Representante RdRP produtos de TERT endógena em células mitóticas HeLa. (A) três resultados representativos do IP-RdRP ensaio em células HeLa tratadocom com nocodazole (manipulado) ou DMSO (unmanipulated). O 34 quimicamente sintetizado nt RNA foi usado como um modelo. (B) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizadas com tratamento inadequado de MNase. (C) IP-RdRP ensaio em células HeLa mitóticas realizada com solução HMD fresca ou velha. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U / µ l</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nuclease micrococcal Buffer, 10 x</td>
			<td>8 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>Μ L 51</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: MNase componente de mistura de reação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>CAMARADAS, 0,07% (wt/vol)</td>
			<td>6 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução HMD</td>
			<td>2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80mm</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibidor de RNase, 40 U / µ l</td>
			<td>0,5 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>1 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: RdRP componente de mistura de reação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagentes</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribonuclease RNase ONE, 10 U / µ l</td>
			<td>0,2 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amortecedor da reação, 10 x</td>
			<td>20 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água livre de RNase</td>
			<td>159.8 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Componente de mistura de reação Ribonuclease.

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do RNA, como qual é o significado biológico de RdRP ou TERT em células humanas? A principal vantagem desta técnica é que este ensaio é estabelecido como o primeiro método sensível para detectar a atividade de RdRP humana expressa em células. Comece este procedimento com a preparação de células HeLa conforme descrito no protocolo de texto.Lave as células uma vez com 10 mililitros de PBS. Em seguida, centrifugue a amostra a 1.450 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Use um mililitro de tampão de lise A gelado por 10 milhões de células para lisar as células por pipetagem suave.Sonicar a amostra em um tubo de 1,5 mililitro a uma amplificação do sonicador de 25% por 10 segundos. Após a sonicação, centrifugue a amostra a 20.400 vezes a gravidade por 15 minutos a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante e transfira um mililitro de cada sobrenadante para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Pré-limpe o lisado adicionando 40 microlitros de grânulos de proteína A-agarose pré-lavados por um mililitro do lisado. Misture bem invertendo o tubo várias vezes. Em seguida, gire a amostra por 30 minutos a quatro graus Celsius.Centrifugar a amostra a 13 000 vezes a gravidade durante um minuto a quatro graus Celsius e recuperar o sobrenadante. Em seguida, adicione 40 microlitros de esferas de proteína A-agarose pré-lavadas e 10 microgramas de anticorpo TERT anti-humano no lisado pré-limpo. Misture bem invertendo o tubo várias vezes e gire a amostra a quatro graus Celsius durante a noite.Após a centrifugação a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Em seguida, lave as contas com o Wash Buffer One. Adicione um mililitro de Wash Buffer One às contas e misture bem invertendo o tubo.Em seguida, gire a amostra por cinco minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue a amostra a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e repita esta etapa três vezes adicionais.Após a lavagem da solução AGC conforme descrito no protocolo de texto, trate os grânulos com nuclease microcócica ressuspendendo-os em 60 microlitros da mistura de reação da nuclease microcócica por pipetagem suave. Em seguida, agite a amostra suavemente em uma plataforma giratória de um shaker colocado em uma incubadora do tipo Peltier por 15 minutos a 25 graus Celsius. Depois de centrifugar a amostra a 3.300 vezes a gravidade por 30 segundos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante.Finalmente, lave os grânulos duas vezes com uma solução AGC contendo três milimolares EGTA e lave os grânulos uma vez com o tampão de lavagem dois, conforme descrito no protocolo de texto. Preparar a mistura de reacção RdRP num novo tubo, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione seis microlitros de trifosfato de uridina marcado no grupo alfa fosfato com P dash 32 à mistura de reação e misture bem pipetando.Em seguida, adicione um microlitro de RNA molde à mistura e misture bem. Ressuspenda os grânulos com 20 microlitros da mistura de reação RdRP resultante. Em seguida, agite a amostra suavemente em uma plataforma giratória de um shaker colocado em uma incubadora do tipo Peltier por duas horas a 32 graus Celsius.Após a incubação, adicione 5,4 microlitros de 20 miligramas por mililitro de Proteinase K e 45,4 microlitros de tampão 2X Proteinase K à mistura de reação. Misturar pipetando, e agitar a amostra numa incubadora do tipo Peltier durante 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de adicionar 109,2 microlitros de água livre de RNase à amostra, adicione 200 microlitros de fenol-clorofórmio ácido.Misture bem por vórtice antes de centrifugar a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por cinco minutos à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Repita esta etapa uma vez.Em seguida, adicione 20 microlitros de acetato de sódio de três molares, pH 5,2, quatro microlitros de transportador de precipitação e 250 microlitros de etanol à fase aquosa. Agite bem o tubo para misturar. Centrifugue a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por 20 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.Em seguida, lave o pellet com 300 microlitros de etanol frio a 70% por volume armazenado a menos 20 graus Celsius. Centrifugue a amostra a 21, 100 vezes a gravidade por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e seque o pellet ao ar.Ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água livre de RNase. Preparar a mistura de reacção da RNase num novo tubo, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 180 microlitros da mistura de reação de RNase à amostra.Em seguida, incube o tubo por duas horas a 37 graus Celsius. Adicione 2,3 microlitros de 10% de volume por volume SDS à amostra e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione dois microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K à amostra e incube por mais 15 minutos a 37 graus Celsius.Agora, adicione 205 microlitros de ácido fenol-clorofórmio à amostra. Depois de misturar e centrifugar como antes, transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicione acetato de sódio de três molares, transportador de precipitação e etanol à fase aquosa, seguido de mistura, centrifugação e lavagem do pellet conforme realizado anteriormente.Aqui são mostrados três resultados representativos do ensaio IP-RdRP em células HeLa tratadas com nocodazol ou DMSO para células não manipuladas. Um RNA de 34 nucleotídeos sintetizado quimicamente foi usado como modelo. Após a exposição durante a noite, os produtos RdRP podem ser vistos entre 20 a 30 nucleotídeos, especificamente em células HeLa dentro da fase mitótica.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar a atividade RdRP do TERT humano.

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

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