Name: Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a analisar sinapses imunológicas entre células T humanas e células apresentadoras de antígeno usando citometria de fluxo com imagem. Este método permite avaliação rápida e detalhada de interações celulares ex vivo.

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O trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa alemã (DFG) com subsídios não. SFB-938-M e SA 393/3-4.

1. preparação do Panleucócitos
<ol><li>Empate 1 mL de sangue periférico de um doador saudável (ou paciente) em uma seringa heparinizada. Certifique-se de ter a aprovação pelo Comitê de ética responsável para a doação de sangue.</li>
	<li>Misturar 1 mL de periférico humano com 30 mL de tampão de Lise ACK (150mm NH4Cl, 1mm KHCO3e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) em um tubo de 50 mL de sangue e incubar durante 8 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Encha os tubos com PBS e centrifugar x 300 g por 6 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 30 mL de tampão de Lise ACK.</li>
	<li>Repita as etapas de 1.2 e 1.3 até que o sobrenadante é claro. Finalmente, lave as células em PBS, centrifugar x g por 6 min à temperatura ambiente e ressuspender as células em 2 mL de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incube as células a 37 ° C por 60 min.</li>
</ol>2. carregamento do Raji células com SEB
<ol><li>Prepare dois tubos Falcon de 15ml com 1,5 x 106 células Raji por tubo. Gire para baixo as células (300 x g durante 6 min à temperatura ambiente) e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em meio residual (aproximadamente 50-100 µ l), adicionar 1,9 µ l (1,9 µ g) SEB e incubar a temperatura ambiente por 15 min. adicionar 5 mL de meio de cultura, spin para baixo as células (300 x g durante 6 min à temperatura ambiente) e resuspenda o pellet em meio de cultura (RPMI 1640 + 10% FCS) com uma densidade de 1 x 106 células/mL.</li>
</ol>3. indução de sinapses imunes e mancha o protocolo
<ol><li>Pipete 500 µ l da preparação de células Raji SEB-carregado em um tubo de FACS e 500 µ l da preparação de descarregado células Raji em outro tubo de FACS. Adicione 650 µ l de panleucócitos a cada tubo e spin-down as células (300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 150 µ l de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incube a 37 ° C (normalmente por 45 min).</li>
	<li>Vórtice suavemente as células (10 s a 1.000 rpm) e adicione 1,5 mL de paraformaldeído (1,5%) durante o vórtice para consertar as células. Pare a fixação adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA. Sedimento das células (x g durante 10 minutos a temperatura ambiente e ressuspensão o centrifugado em 1 mL de PBS + 1% de BSA após incubação à temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>(300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente) de pelotas e ressuspender as células em 100 µ l de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina durante 15 minutos à temperatura ambiente para permeabilize as células (placa de 96 poços, em forma de U).</li>
	<li>Lavar as células em PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina com centrifugação (300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente) e ressuspender as células em 50 µ l de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina contendo anticorpos fluoróforo-rotulados ou compostos (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1:150) e DAPI (1:3, 000)).</li>
	<li>Incube as celulas em temperatura ambiente no escuro por 30 min. lavar as células 3 vezes, adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Re-Ressuspender as células em 60 µ l de PBS por citometria de fluxo de imagem.</li>
</ol>4. imagem aquisição usando um citômetro de fluxo
Nota: A seguinte imagem aquisição procedimento e análise de dados baseiam-se na imagem de citometria de fluxo, usando o software como imagestream (IS100), INSPIRE e ideias. No entanto, outro software de cytometers e análise de fluxo também pode ser usado.
<ol><li>Abra o software de análise no computador conectado para o citômetro de fluxo de imagens e clique em inicializar Fluidics do menu instrumento. Aplicam-se os grânulos na porta direita, quando solicitado a fazê-lo.</li>
	<li>Carregar o modelo padrão do menu arquivo e clique em executar/Setup. Escolha grânulos no menu suspenso de vista.</li>
	<li>Ajuste o iluminador brilhante-campo clicando na intensidade de definir se o valor indicado for inferior a 200.</li>
	<li>Executar a calibração e teste de rotina na aba Assist clicando em Iniciar todos.</li>
	<li>Clique em carga/descarga/Lock e aplicar as amostras na porta à esquerda, quando solicitado a fazê-lo. Depois de carregar as células no citômetro de fluxo, abra o classificador de célula e ajustar os valores da seguinte forma: limite superior intensidade de pico em 1.022 para cada canal, pico intensidade limite inferior aos 50 para canal 2 (DAPI) e canal 5 (TxR-CD3-Pe), limite inferior de área em 50 para canal 1 (dispersão de lado) e o limite superior em 1.500.</li>
	<li>Mudar a potência do laser de excitação a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) no guia de instalação.</li>
	<li>Alterne o dropdown menu Exibir entre células e grânulos para avaliar os ajustes de potência de célula classificador e laser. Nota: Certifique-se de que todas as células e célula casais encontram-se a exibição de célula e que aglomerados de células, detritos e imagens com pixels saturados são encontradas na exibição de detritos, alterando os classificadores de célula e/ou os poderes do laser de excitação.</li>
	<li>Defina o nome da amostra e a quantidade de imagens para adquirir (15.000-25.000 para amostras) e 500 para controles de compensação na guia configuração, clique em executar/Setup para iniciar a aquisição.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>Transferir os arquivos de imagem raw (.rif) para o computador de análise de dados e abrir o software de análise.</li>
	<li>Produzir uma matriz de compensação, seguindo as instruções da lista pendente de compensação. Salve a matriz de compensação como comp_Date.ctm.</li>
	<li>Abrir um arquivo de imagem raw de amostra (.rif) e aplique o comp_Date.ctm na janela que aparece produzir arquivos de imagem de compensado (ID_de_Componente) e o arquivo de análise de dados de padrão (.daf).</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem de compensado. Converter as imagens para o modo de cor e ajustar as tabelas de pesquisa para obter óptimas cores visíveis na barra de propriedades da Galeria de imagem. Obter uma imagem RGB-mesclado usando a guia composta de barra de ferramentas Propriedades da Galeria de imagem.</li>
	<li>
Abra o Gerenciador de máscara na lista suspensa análise. Crie máscaras para definir as células T e a sinapse imunológica, como segue:
	<ol>
<li>Selecione a máscara de células T: "(preenchimento (Threshold_Ch05, 60)." Selecione a máscara vale: "Valley(Ch02,3)." Selecione a célula T sinapse máscara: "máscara de células T e vale (M02, Ch02, 3)."</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Abra o Gerenciador de recurso na lista suspensa análise. Calcule as seguintes características:
	<ol>
<li>Para a total expressão de CD3 em células T, selecione "Intensity_T-cells_Ch5." O montante total de F-Actina nas células T, selecione "Intensity_T-cells_Ch6." Para a expressão de CD3 na sinapse imunológica, selecione "Intensity_T-celular synapse_Ch5." Para a quantidade de F-Actina na sinapse imunológica, selecione "Intensity_T-celular synapse_Ch6."</li>
		<li>Para calcular a área de células T, selecione "Area_T-células." Para calcular a área de sinapse imunológica de célula T, selecione "sinapse da célula Area_T."</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a F-Actina e CD3 enriquecimento na sinapse imune usando a equação no Gerenciador de recurso: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55345/55345eq1.jpg">
</li>
	<li>
Aplicar a seguinte estratégia associada usando histogramas e ponto parcelas da área de análise (para maiores detalhes, veja referências 17 e 19):
	<ol>
<li>Descarte de células fora de foco plotando a RMS_M2_Ch2"gradiente" em um histograma; Defina o limite aos 15 anos.</li>
		<li>Sinopse o CCD versus CD3 intensidade em uma trama de ponto. Defina um portão em eventos CD3-positivo.</li>
		<li>Sinopse o "Aspect ratio" de M02 (mancha DAPI) contra a área de M02 (Dapi mancha). Portão em camisolas de células T e células de casais em conformidade. Corrigi para casais de verdadeiras células usando a área da máscara de sinapse, conforme descrito anteriormente,17,19.</li>
		<li>Determine a quantidade de F-Actina em camisolas de células T e células T de casais T-celular/APC e a porcentagem de F-Actina na sinapse imunológica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+Costimulation%3A+From+Mechanism+to+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy.</a> Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).</li>
<li>Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeletal+dynamics+in+T+lymphocyte+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration.</a> Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).</li>
<li>Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin%3A+a+redox+sensitive+mediator+of+actin+dynamics+during+T-cell+activation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration.</a> Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).</li>
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<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+flow+drives+affinity+maturation+and+spatial+organization+of+LFA-1+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse.</a> J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).</li>
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<li>Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiskott-Aldrich+Syndrome%3A+Immunodeficiency+resulting+from+defective+cell+migration+and+impaired+immunostimulatory+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation.</a> Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Dustin, M. L., Depoil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+T+cell+synapse+from+single+molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the T cell synapse from single molecule techniques.</a> Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse%3A+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front Immunol. 3, 421(2012).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+LFA-1+cluster+formation+in+the+immune+synapse+requires+the+combined+activities+of+L-plastin+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin.</a> European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).</li>
<li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-plastin+phosphorylation%3A+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((InFlow+microscopy+of+human+leukocytes%3A+A+tool+for+quantitative+analysis+of+actin+rearrangements+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse.</a> J Immunol Methods. , (2015).</li>
<li>Basiji, D., O'Gorman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).</li>
<li>Wabnitz, G. H., Samstag, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+Characterization+of+Human+T-Cell+Immune+Synapses+by+InFlow+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy.</a> Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).</li>
<li>Balta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analysis+of+PMN%2FT-cell+interactions+by+InFlow+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy.</a> Methods. , (2016).</li>
<li>Hochweller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+control+T+cell+tonic+signaling+required+for+responsiveness+to+foreign+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de imunes sinapses entre as células T humanas (ex vivo) e APCs. Notavelmente, eritrócitos-lysed panleucócitos foram usados como fontes de células T, tornando as etapas de purificação de células T dispensável. A linhagem de células de linfoma de célula B Ribeiro serviu como substituto APCs. Isto traz vantagens significativas, uma vez que permite comparações entre doadores de sangue do lado da sinapse imunológica de célula T. Além disso, a DCs autólogos são dific...

As células T são importantes reguladores do sistema imune adaptativo e são ativadas através de peptídeos antigênicos que são apresentados no contexto dos complexos de histocompatibilidade (MHC). Ativação de células T completa requer dois sinais, o sinal de competência através do receptor de células T antígeno-específicos (TCR) / CD3 complexo e o sinal de co-estimulação via receptores acessórios. Ambos os sinais são gerados através da interação direta de células T com apresentadoras células (APCs). APCs maduros fornecem o sinal de competência para a ativação de células T através dos complexos peptídeo-MHC, e expressam a co-estimulação ligantes (por exemplo,, CD80 ou CD86) para garantir a progressão da ativação de células T1. Uma função importante de costimulation é o rearranjo do citoesqueleto de actina2,3,4. A F-Actina cortical é relativamente estática no repouso de células T. Estimulação de células T através do antígeno-rolamento APCs leva a uma profunda reorganização do citoesqueleto de actina. Dinâmica de actina (ou seja,, actina rápida polimerização/despolimerização círculos) permite que as células T criar as forças que são usadas para o transporte de proteínas ou organelas, por exemplo. Além disso, o citoesqueleto de actina é importante para o desenvolvimento de uma zona especial de contato entre as células T e APCs, chamados de sinapse imunológica. Devido à importância do citoesqueleto de actina para o sinapse imunológica, tornou-se essencial desenvolver métodos para quantificar alterações do citoesqueleto de actina de T células5,6,7,8 , 9.
Através da ajuda do citoesqueleto de actina, receptores de superfície e proteínas de sinalização são segregadas em clusters de activação supramoleculares (SMACs) dentro da sinapse imunológica. A estabilidade da sinapse imunológica é assegurada pela ligação dos receptores para pacotes de F-Actina que aumentam a elasticidade do citoesqueleto de actina. Formação de sinapse imunológica foi mostrada para ser crítico para a geração das respostas imune adaptativas. Os efeitos nocivos de uma formação de sinapse imune defeituoso em vivo primeiro foram realizados em pacientes que sofrem de Wiskott Aldrich síndrome (WAS), uma doença na qual polimerização da actina e, concomitantemente, a formação de sinapse imunológica são perturbados10 . FOI de pacientes podem sofrer de eczema, infecções recorrentes graves, doenças auto-imunes e melanomas. Apesar desta constatação, atualmente não se sabe se a formação de sinapse imunológica diferente nas células T de indivíduos saudáveis e pacientes que sofrem de defeitos imunes ou doenças auto-imunes.
Microscopia de fluorescência, incluindo confocal, TIRF e microscopia de super-resolução, foram usados para descobrir a arquitectura do sinapse imunológica11,12,13,14. A alta resolução desses sistemas e a possibilidade de realização de imagem latente da viver-pilha permite a recolha de informações exatas, espaço-temporais sobre o citoesqueleto de actina e proteínas intracelulares ou superfície na sinapse imunológica. Muitos resultados, no entanto, baseiam-se na análise de apenas algumas dezenas de células T. Além disso, as células T devem ser purificadas para estes tipos de microscopia de fluorescência. No entanto, para muitas perguntas de pesquisa, o uso de células impuro, ao invés da resolução mais alta possível é de extrema importância. É relevante se as células T de pacientes são analisadas, desde que a quantidade de sangue doado é limitada e pode haver a necessidade de processar muitas amostras em paralelo.
Nós estabelecemos métodos microscópicos que permitem a análise do citoesqueleto de actina na sinapse imunológica no sistema humano15,16,17. Estes métodos baseiam-se na imagem de citometria de fluxo, também chamada de fluxo em microscopia18. Como um híbrido entre multiespectrais fluxo cytometry e fluorescência microscopia, citometria de fluxo de imagem tem seus pontos fortes na análise de parâmetros morfológicos e a localização da proteína em populações de células heterogêneas, tais como panleucócitos do sangue periférico. Introduzimos uma metodologia que nos permite quantificar a F-Actina em conjugados de T-celular/APC de células T humanas de amostras de sangue total, sem a necessidade de etapas de purificação demorada e dispendiosa17. A técnica aqui apresentada compreende o fluxo de trabalho inteiro, de obter a amostra de sangue para a quantificação de F-Actina na sinapse imunológica.

<table><tbody><tr><td>>Multifuge 3 SR</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>LifeTechnologies</td><td>#11875085</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Pan Biotech#3302-P101102</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo inferior redondo de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>#352054</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Kulturflasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>#178883</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Roth</td><td>#8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#16005</td><td></td></tr><tr><td>FACS Lavagem Saponina</td><td></td><td>PBS 1% BSA 0.15 Saponina</td><td></td></tr><tr><td>ReaktiosgefaB</td><td>Sarstedt</td><td>72.699.002</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>Speed Bead</td><td>Amnis</td><td>#400041</td><td></td></tr><tr><td>Minishaker MS1</td><td>IKA Works</td><td>&nbsp; MS1</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Greiner Bio One</td><td>#650101</td><td>96U</td></tr><tr><td>Enterotoxina SEB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4881</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>1:3000</td></tr><tr><td>CD3-PeTxR</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD0317</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Phalloidin-AF647</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A22287</td><td>1:150</td></tr><tr><td>IS100</td><td>Amnis</td><td></td><td>Citômetro de fluxo para imagiologia</td></tr><tr><td>IDEAS</td><td>Amnis</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>INSPIRE</td><td>Amnis</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

A sinapse imunológica é a área de comunicação entre as células T e células apresentadoras de antígeno (APCs). Células T polarizar a receptores de superfície e proteínas para a sinapse imunológica para assegurar uma ligação estável e troca o sinal. Microscopia confocal, TIRF ou super-resolução clássica têm sido utilizados para estudar a sinapse imunológica. Uma vez que esses métodos exigem a aquisição de imagem manual e quantificação demorada, a imagem de eventos raros é um desafio. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que permite a análise morfológica de dezenas de milhares de células. Imune as sinapses são induzidas entre as células T humanas primárias em preparações de panleucócitos e as células Raji B SEB-carregado de enterotoxina Staphylococcus aureus como APCs. Aquisição de imagens é realizada com imaging citometria de fluxo, também chamada de microscopia em fluxo, que combina características de um citômetro de fluxo e um microscópio de fluorescência. Uma estratégia completa associada para identificar a célula T/APC casais e analisando as sinapses imunes é fornecida. Como esse fluxo de trabalho permite a análise de imune sinapses nos preparativos do panleucócitos impuro e, portanto, requer apenas um pequeno volume de sangue (ou seja,, 1 mL), pode ser aplicado a amostras de pacientes. Importante, várias amostras podem ser preparadas, medidas e analisadas em paralelo.

Dos principais objetivos do método descrito aqui é a quantificação do enriquecimento de proteína (por exemplo,, F-Actina) na sinapse imunológica entre APCs (células Raji) e células T em panleucócitos impuro, tomadas de amostras de sangue humano de baixo volume (1ml) de aluguel. A captura de tela na Figura 1 dá uma visão geral da estratégia associada da crítica desse método. Ele mostra a Galeria de imagens na esquerda e a área de análise à direita (Figura ...

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo imunológico humano, como como a comunicação entre leucócitos ocorre no nível molecular e celular. A principal vantagem dessa técnica é que as células T humanas não purificadas podem ser analisadas ex vivo em um período de tempo relativamente curto. Demonstrando este procedimento estará Henning Kirchgessner, um técnico do nosso laboratório.Comece misturando um mililitro de sangue periférico humano recém-desenhado com 30 mililitros de tampão de lise ACK em um tubo cônico de 50 mililitros. Depois de oito minutos em temperatura ambiente, encha o tubo com PBS para uma lavagem de centrifugação e resuspense a pelota em dois mililitros de cultura para uma incubação de 60 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação, adicione cinco vezes 10 ao quinto Staphylococcus aureus enterotoxin b ou células Raji carregadas ou descarregadas de SEB em 500 microliters de meio de cultura em tubos FACS individuais, seguido por 650 microliters de pan-leucócitos.Gire as co-culturas e resuspenja as pelotas em 150 microliters de meio de cultura fresca para uma incubação de 45 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, suavemente vórtice as células por 10 segundos a 100 rpm enquanto adiciona 1,5 mililitros de 1,5% paraformaldeído. Após 10 minutos em temperatura ambiente, pare a fixação com um mililitro de PBS suplementado com 1%BSA e colete as células por centrifugação.Resuspenque as pelotas em 100 microlitadores de PBS mais BSA e 0,1% saponina, e adicione as amostras de células a dois poços individuais de uma placa de fundo U de 96 poços. Após 15 minutos em temperatura ambiente, centrifugar a placa e resuspensar as pelotas em 50 microliters de PBS mais BSA e saponina contendo os anticorpos conjugados fluorophore ou compostos de interesse para uma incubação de 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as células três vezes em 150 microliters de PBS mais BSA e saponina e resuspenja as pelotas em 60 microliters de PBS.Para imaginar as células por citometria de fluxo, abra o software de análise, verifique o nível líquido e clique em Iniciar no menu Instrumento. Em seguida, clique em Carregar e carregue as amostras na porta quando solicitado. Sob a guia Iluminação, altere a potência do laser de excitação para os comprimentos de nanômetros apropriados.Em seguida, ajuste os portões para os canais quatro e 11, e ajuste a área para o canal um. Para avaliar os ajustes de alimentação de gating e laser, mude o menu Exibir para o respectivo portão e ajuste os portões e os poderes de laser até que as células e casais de células sejam visíveis. Em seguida, na guia Aquisição de Arquivos, defina o nome da amostra e o número de imagens a serem adquiridas e o portão apropriado para coloração de CD3 e clique em Adquirir para iniciar a aquisição.Para analisar as imagens celulares adquiridas, abra o software de análise adequado. Seguindo as instruções na compensação, produza uma matriz de compensação e salve a matriz como data comp ctm. Em seguida, abra um arquivo de imagem bruta de amostra e aplique a data comp ctm na janela para gerar os arquivos de análise de imagem e dados padrão compensados.Depois de abrir os arquivos de imagem compensados, converta as imagens em modo de cor. Ajuste as tabelas de procuração para obter cores visíveis ideais na barra de ferramentas Image Gallery Properties. Abra o gerenciador de máscaras no menu Análise e defina as células T selecionando uma máscara limiar de 60% para o canal cinco e preenchendo a máscara para criar a máscara de célula T.Em seguida, selecione a máscara do Valley para o canal dois com uma largura de três pixels para criar a máscara do Vale, e combine as máscaras de célula T e Vale para criar a máscara de sinapse de células T. Para calcular a expressão cd3 total em células T, abra o Gerenciador de Recursos e crie o recurso Intensidade, célula T, canal cinco. Para calcular a quantidade total de F-actin nas células T, crie o recurso Intensidade, Células T, canal seis.Para avaliar a quantidade cd3 em sinapses imunológicas, crie o recurso Intensidade, Sinapse de células T, canal cinco. Para determinar a quantidade de F-actin na sinapse imunológica, crie o recurso Intensidade, Sinapse de células T, canal seis. Por fim, para definir o enriquecimento F-actin e CD3, calcule as razões de F-actin ou CD3 na sinapse imunológica e a expressão total da proteína selecionada, respectivamente.Nestes gráficos, uma visão geral da estratégia crítica de gating para quantificar o enriquecimento de proteínas na sinapse imunológica entre as células que apresentam antígenos substitutos, ou APCs, e as células T em pan-leucócitos não purificados retiradas de uma amostra de sangue humano de baixo volume é mostrada. Aqui, são mostradas imagens representativas de conjugados T-cell-APC com baixos níveis de CD3 e F-actin dentro de suas sinapses imunológicas na ausência de SEB, enquanto estes conjugados T-cell-APC demonstram um forte enriquecimento de CD3 e F-actin na presença de SEB. Na ausência de superantígeno, 15% das células T apresentaram enriquecimento tanto do CD3 quanto do F-actin na sinapse imunológica, enquanto um enriquecimento de 29% é observado na presença de superantígeno.De fato, na ausência de superantígeno, menos de 20% do total de F-actin nas células se acumula na sinapse imunológica, com mais de 30% observados na sinapse na presença de superantígeno. Notavelmente, o CD3 acumula-se na sinapse imunológica mesmo na ausência de superantígeno, embora esse acúmulo também seja significativamente aumentado pela adição de superantígeno, demonstrando a aptidão deste método para quantificar o acúmulo de proteínas na sinapse imunológica T-cell-APC. Uma vez dominada, essa técnica pode ser completada em seis a sete horas se realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de incluir todos os controles relevantes, incluindo amostras sem superantígeno, pois o enriquecimento de proteínas também ocorre se os APCs sem SEB forem usados. Após este procedimento, outros métodos como microscopia de super resolução podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a estrutura fina da sinapse imunológica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo das comunicações celulares explorarem a sinapse imunológica em humanos para pesquisas básicas, ensaios clínicos e ciência translacional.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar a zona conjuntiva T-cell-APC e a sinapse imune em células T humanas ex vivo. Não se esqueça que trabalhar com materiais humanos primários pode ser perigoso e que precauções como usar luvas ou trabalhar sob o nível de biossegurança dois devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

Descrevemos uso da tecnologia de ImageStream...

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Este vídeo analisa a formação de sinapses imunes entre células T em preparações panleucocitárias não purificadas e Staphylococcus aureus enterotoxina B, células Raji carregadas com SEB. O enriquecimento de CD3 e F-actina é observado na sinapse imune usando citometria de fluxo de imagem.

Análise de sinapses imunes entre células T humanas e células Raji carregadas com SEB usando citometria de fluxo de imagem

Fonte: Hidmark, A. S., et al. Análise de Células Imunes em Nervos Ciáticos Únicos e Gânglio da Raiz Dorsal de um Único Camundongo Usando Citometria de Fluxo. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Este vídeo demonstra o uso da citometria de fluxo para analisar células imunes em nervos ciáticos de camundongos e gânglios da raiz dorsal (DRGs). O processo envolve a marcação de células imunes com anticorpos marcados com fluoróforo e biotina, estabilizando e permeabilizando as células e usando marcadores...

Análise de células imunes em tecidos nervosos de camundongos usando citometria de fluxo

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Imagem da Sinapse Imunológica Humana

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Aqui apresentamos dois protocolos para quantificar o engolfamento microglial de sinapses positivas para vGLUT1 e sinaptossomos brutos marcados com pHRodo Red usando citometria de fluxo.

Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Este artigo irá detalhar o protocolo para medir a atividade das calpaínas em células fixas e vivendo por citometria de fluxo.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Aprenda a analisar sinapses imunológicas entre células T humanas e células apresentadoras de antígeno usando citometria de fluxo com imagem. Este método permite avaliação rápida e detalhada de interações celulares ex vivo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

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