Name: Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a visualizar armadilhas extracelulares de macrófagos por microscopia confocal em amostras pulmonares humanas e murinas. Este método avança pesquisas em imunologia e respostas inflamatórias.

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Este trabalho foi financiado por doações da Monash University, National Health e Medical Research Council e o pulmão de Monash e Instituto do sono. Os autores gostaria de agradecer o pessoal da imunologia clínica na saúde de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) para obter ajuda com a microscopia confocal da imagem latente, e os autores reconhecem as instalações do MMI da Universidade de Monash. Os autores reconhecem a instalações e assistência científica e técnica da plataforma de histologia de Monash.

este protocolo segue experiências aprovadas em: (1) os seres humanos pelo Comitê de ética de Monash Medical centro e (2) animais pelo Comitê de ética da Universidade de Melbourne.
 1. macrófagos do lavado broncoalveolar (BAL) <ol><li>BAL de uso para obter os macrófagos pulmonares em: (1) humanos sujeitos por broncoscopia 6 e (2) ratos usando aspiração intratraqueal 13 . 
	Nota: Aquisição de macrófagos em geral, causa uma ativação dessas células. Os macrófagos são obtidos de pacientes que requerem uma broncoscopia para investigar um problema médico potencial e nem todos os temas podem ser adequados para análise dos METs (isto terá de ser determinado para cada projecto).
	<ol><li>Tomar a solução de BAL e spin-down (500 x g durante 10 minutos) para formar um pellet, lave duas vezes com meio de cultura (Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI) com 5% de soro fetal bezerro e 1% L-glutamina) à temperatura ambiente e em seguida diluir as células em 4 mL de cultura medi ....</li>
		<li>, Se necessário, solicitar um formal contagem diferencial; a maioria das células (geralmente &#62; 80%) será macrófagos 6. 
		Nota: Isso geralmente será executado por um serviço clínico Histologia usando a aparência morfológica dos tipos diferentes de células 6.</li>
		<li>Executar uma célula macrófago viável conta com a solução de BAL usando Trypan azul exclusão e um hemocytometer. 
		Nota: Solução de BAL é Obtida de seres humanos e ratos como mencionado na etapa 1.1.</li>
		<li>Add 1-4 x 10 5 macrófagos para placas boas 24 em lamelas em 500 µ l do meio de cultura por bem e deixar durante a noite a 37 ° C; as células irão aderir as lamelas. Para amostras humanas, adicionar antibióticos (por exemplo, penicilina e estreptomicina, 10 4 U/mL) para evitar a contaminação bacteriana.</li>
	</ol></li></ol> 2. Rotulagem/microscopia de imunofluorescência de macrófagos BAL Nota: as células são respeitadas em lamelas, como mencionado acima.
<ol><li>Remover o meio de cultura e lavar as células uma vez com solução salina tampão fosfato (PBS). Consertar as células em fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP) 2% durante 10 min.</li>
	<li>Lavar as células brevemente em PBS e em seguida permeabilize em 0,2% Tween 20 em PBS por 20 min.</li>
	<li>Células de bloco com sera de frango de 10% em 5% albumina de soro bovino (BSA) diluído em PBS durante 30 min.</li>
	Anticorpos <li>incubar com primário e do isotipo controle por 1h à temperatura ambiente em concentrações de 1: 100 (detalhes mais específicos estão listados na Tabela de materiais) a 37 ° C. 
	Nota: Para as amostras de BAL, um marcador específico de macrófagos normalmente não é necessário.</li>
	<li>Após a adição de anticorpos primários, lavar as células em PBS e incube ainda mais com os correspondentes anticorpos secundários por 40 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>1,0 at óleo objetivo, lave as seções em PBS e montagem com meio de montagem baseada em DAPI para visualização usando um microscópio confocal (como mencionado acima), a laser excitações 405, 488, 561 e 647 nm e uma 40 X.</li>
</ol> 3. Amostras de tecido de pulmão Nota: estudos em vivo do tecido pulmonar, estudar as amostras após a exposição relevante (por exemplo, como descrito por O &#39; Sullivan et al 7). a exposição que é mais relevante para este experimento são microorganismos infecciosos, particularmente bactérias. Cepas de mouse que podem ser usadas para este método são camundongos C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semanas de idade e peso 25-30 g macho.
<ol><li>Euthanize ratos, através de uma injeção intraperitoneal de cetamina (400 mg/kg) e xilazina (40 mg/kg). Abra a cavidade torácica e expor os pulmões e o coração usando a tesoura e pinça cirúrgica.
	<ol><li>Infundir PBS quente usando uma agulha de calibre 21 para o ventrículo direito para lavar o sangue dos vasos por 30 s, infundir em seguida 10 mL de fixador PLP 2% por 30 s (para o ventrículo direito).</li>
		<li>Use quente PBS (42 ° C) para lavagem da cavidade de peito aberto. Intubação da traqueia com uma agulha de calibre 21 e um pedaço de tubo de 0,8 mm, corte ao tamanho e injetar 800 µ l de previamente aquecido (a 42 ° C), baixo ponto de fusão ponto solução de agarose 3.</li>
		<li>Gravata fora da traqueia com seda trançada (USP 4.0). Coloque a linha ao redor da traqueia, logo abaixo do ponto de inserção da cânula e fixá-lo através de um simples nó de laçada. Para solidificar o agarose, administre PBS gelado ao redor dos pulmões. Remova os pulmões e o coração como um bloco da cavidade torácica, usando uma tesoura e dissecção romba. Remover cada pulmão individualmente e então corrigi-los para 16 h em 2% PLP ou formalina a 4 ° C.</li>
		<li>Armazenar as amostras em PBS a 4 ° C até o corte de tecido. Esses métodos para a obtenção de tecido pulmonar têm sido descritas anteriormente 13.</li>
	</ol></li> <li>Para preparar o tecido pulmonar amostras usam as seguintes etapas.
	<ol><li>Reparo do tecido pulmonar tecidos (ressecados em passo 3.1) em tampão natural formol a 10% por 24 horas à temperatura ambiente. Transferência de 75% de etanol e colocar em um processador de tecido em um ciclo de 12 h, (2.5 h em 75% EtOH, 3h em EtOH absoluto, 3,5 h em solvente 3B e para 3h em parafina).</li>
		<li>Embed em parafina padrão para criar formalin-fixas, parafina blocos (FFPE) que são armazenados à temperatura ambiente. 
		Nota: Nesta fase, é geralmente conveniente cortar as seções de pulmão para slides padrão.</li>
		<li>Cortar as seções de pulmão FFPE na espessura de 4-5 µm usando um micrótomo e montar no cobrado, revestidos slides conforme descritos por s &#39; et al. Sullivan 7</li> <li>para montar slides, coloque 3 gotas de meio de montagem em lamelas de 60 mm x 24 mm (tamanho 1.5), inverter o slide na lamela e empurrar para fora o excesso de meio. Hermeticamente selar com esmaltes e armazenar à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li></ol> 4. Preparação/microscopia de amostras de tecido de pulmão <ol><li>de cera, hidratar e pré-tratamento da amostra de tecido de pulmão FFPE com solução de recuperação de antígeno.
	<ol><li>Forno seco o FFPE desliza por 60 min a 60 ° C. Então coloque as lâminas em solução de xilol por 30 min e transferência para solução de etanol 70% por 5 min à temperatura ambiente. Enxaguar em água da torneira.</li>
		<li>Lugar em plástico resistente ao calor e sujeitos a recuperação HIER-antígeno em uma panela de pressão por 10 min em 10 m/mol/L Tris, pH 1 mmol/EDTA 9.0. Legal de 20 min. lavar duas vezes na água da torneira por 5 min em uma cadeira de balanço, em seguida, uma vez com PBS basculante.</li>
		<li>Bloco com soro de frango de 10% em 5% BSA/PBS durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Manchar o tecido.
	<ol><li>Definir METs em macrófagos, acrescente os anticorpos primários (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 1% BSA/PBS para 16 h a 4 ° C, a diluição de 1/100 (detalhes específicos sobre quantidades de anticorpos são listados na Tabela de materiais). Lave duas vezes com PBS por 5 min em um balancim.</li>
		Anticorpos <li>alcançar a deteção fluorescente de incubação com secundário correspondente em 1% BSA/PBS durante 40 min à temperatura ambiente. Os anticorpos são: anti-rato (1) frango (verde) 488, anti-cabra de frango (2) 594 (vermelho) e (3) burro anti-mouse 647 (vermelho distante).</li>
		<li>Lavar as seções em PBS e montagem com DAPI-contendo o meio de montagem para coloração de cromatina.</li>
	</ol></li> <li>Obter imagens fluorescentes, usando um laser confocal de varredura anexada a um microscópio invertido de cabeça.
	Lasers de nm <ol><li>Excite a preparação com 405, 488, 561 e 647. Capturar imagens de 512 x 512-pixel único avião clicando sobre a linha sequencial, nivelamento de botão (2 linha média) usando 20 X 0.1 ar at e 40 X 1.0 at óleo objectivos.</li>
		<li>Obter pelo menos dez campos de vista por seção de análise e dados para cada resultado (ou seja, 10 de alta potência campos de visão (HFOV) para o controle, 10 para a amostra estimulada, etc., para cada rato). 
		Nota: Para obter uma amostra representativa de todo o campo, um sistema de matriz pode ser usado em que o campo é dividido em as seções diferentes e para cada amostra diferente a mesma matriz é usada para selecionar campos de visão (por exemplo, o campo pode ser dividido em 9 seções, e do centro e os 4 cantos, são tomadas duas HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. Tridimensional (3D) de imagens de METs Nota: como METs são estruturas 3-d, tomando z-pilha múltiplas imagens, que são reconstituídas, podem dar informações valiosas.
<ol><li>Seção as amostras de pulmão de blocos de parafina, em 200 µm usando um vibratome em uma amplitude de 1,8 mm e velocidade de 0.1-0.5 mm/s.</li>
	<li>Bloco de tecido pulmonar com 20% do respectivo soro (10% de soro fetal bezerro e frango de 10% de soro) e em seguida permeabilize em PBS completadas e 3,75% Triton-X100 para 7 h à temperatura ambiente sob leve agitação.</li>
	<li>Mancha as seções para 16 h a 4 ° C, com os anticorpos primários relevantes (MMP-9, H3Cit e F4/80) em 200 volumes µ l em tubos microcentrifuga (concentrações de anticorpos são listadas na Tabela de materiais).</li>
	<li>Lave as seções em PBS, 3 vezes por 10 minutos antes da incubação com anticorpos secundários relevantes à temperatura ambiente por 1 h.</li>
	<li>Mancha as seções de pulmão para DAPI (1:5, 000) na solução por 20 min, antes de adicionar as lamínulas para microscópio desliza em PBS.</li>
	<li>Obter imagens de fluorescência usando um microscópio confocal invertido (40 x 1.3 NA) equipado com 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm e 635 nm de lasers.</li>
	<li>Gravar o 3-d z-pilhas de 0,54 µm de espessura com z-corte ideal para o objectivo de óleo at 40 x 1.3. 
	Nota: O software utilizado pode variar dependendo do microscópio individual. Um exemplo de como o software pode ser usado para um microscópio é fornecido no arquivo suplementar 1.</li>
</ol> 6. Análise de imagem Nota: A análise de amostras requer o uso de software de análise de imagem específicos e exemplos estão listados na Tabela de materiais. Enquanto a análise dos resultados dependerá o programa específico utilizado, os pontos listados abaixo são importantes.
<ol><li>De amostras de análise de BAL <ol><li>Define o número de macrófagos, selecionando o canal azul para DAPI e atribuindo um tamanho mínimo para as células (por exemplo, &#62; 18 µm de diâmetro). Usando o software relevante, medir o número total de macrófagos por campo.</li>
		<li>Contar o número de células que possuem as características de um MET pela presença de cromatina extracelular detectada pelo DAPI com expressão co de outros marcadores (por exemplo, MMP12, PAD2 e H3Cit). 
		Nota: O número de marcadores que podem ser analisados depende do número de lasers disponíveis, mas idealmente além de DAPI, pelo menos, dois outros marcadores devem ser incluídos. Outros menos parâmetros específicos para expressão MET (por exemplo, o número de células com cromatina extracelular e um núcleo alargado) pode ser usado.</li>
		<li>Para comparar a expressão MET em BAL amostras (entre o controle, fumo e fumo/DNase Tratado grupos), analisar um mínimo de 100 macrófagos BAL por amostra.</li>
		<li>Para medir o anticorpo secundário e isotipo controlar níveis de fluorescência; medir um mínimo de 100 células em cada amostra para sua fluorescência. Medir o nível médio de fluorescência de fundo para cada marcador (por exemplo, H3Cit) usando o software padrão.</li>
		<li>Para definir a expressão do MET, contar as células com o fenótipo típico (por exemplo, cromatina extracelular com expressão co de H3Cit e MMP9) e para cada MET, medir o nível de fluorescência dos marcadores (por exemplo, H3Cit e MMP9). Excluir células produzindo METs se sua coloração não foi acima do fundo e do isotipo controle.</li>
		<li>Para amostras humanas de BAL, analisar um mínimo de 100 células para cada amostra para o percentual de macrófagos que fazem METs. Para amostras de murino, como as células são menores e METs são mais difíceis de definir, analisar um número maior de células para cada amostra (por exemplo, 200 macrófagos).</li>
	</ol></li> <li>Análise de amostras de tecido de pulmão <ol><li>para determinar a presença de metástases no tecido pulmonar, use o marcador para macrófagos específicos tais como F4/80.</li>
		<li>Definir a presença de metástases no tecido pulmonar, usando a localização co de F4/80 em células que expressam extracelular cromatina com outros parâmetros, conforme listado na seção 6.1.</li>
		<li>Determinar os níveis de fluorescência de fundo em amostras com anticorpo secundário e os controles do isotipo. Excluir o METs de análise que não está acima do plano de fundo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
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</ol>

Os autores têm sem divulgações para fazer em relação a este trabalho.

O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes14. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL... e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-estimuladas. Os macr...

Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al 1 eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadilhas extracelulares, incluindo macrófagos. Armadilhas extracellular do macrófago (METs) ainda não são uma entidade bem definida na literatura4,5. Nós recentemente estabeleceram métodos para detectar a presença de metástases tanto in vitro e in vivode6,7. Neste artigo, será descrita a medição dos METs usando microscopia confocal.
Principais características do NETosis que a distinguem de outras vias celulares (como a apoptose8) são a extrusão da cromatina em conjunto com: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) expressão co de proteases grânulo10 e (3) participação do peptidyl arginina deiminase (PAD) 411,12. Os macrófagos também expressam H3Cit, proteases do grânulo e almofada, e esses recursos podem ser usados para definir a presença de metástases.
Os METs podem ter um papel particularmente importante no pulmão, como o macrófago é a célula dominante presente nos alvéolos e vias aéreas do pulmão e tem papel inicial na direção da resposta imune celular a infecção/inflamação. Além disso, enquanto grande parte do pulmão é espaço vazio (por exemplo, dentro do alvéolo), os METs são potencialmente capazes de expandir-se para o espaço disponível, em contraste com órgãos sólidos.
O método mais utilizado para definir a presença de redes é por microscopia confocal. Não há ainda uma maneira claramente definida para medir METs. A técnica para a medição de redes tem sido adaptada para medir a presença de metástases no presente protocolo. Os requisitos principais para este método são acesso a microscopia confocal e software de imagem apropriado para análise.

<table><tbody><tr><td><forte>Amostras humanas: Anticorpos primários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-humano H3Cit (Citrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Coelho anti-humano MMP12</td><td>Novus Biológico</td><td>NB110-57214</td><td>concentração 1:100 não quantificável</td></tr><tr><td>Rato anti-humano MMP9</td><td>Novus Biológico</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascite, sem concentração dado</td></tr><tr><td>Coelho anti-humano PADI2 / PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug / ml</td></tr><tr><td>Rato anti-humano PADI4 / PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug / ml</td></tr><tr><td>Ovelha anti-humana NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug / ml</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Amostras de camundongos: Anticorpos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Coelho anti-mouse H3Cit (Citrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rato anti-rato F4/80</td><td>Internamente (hibridoma)</td><td>Em casa</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Ovelhas anti-humano Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouse anti-humano &tímido; e tímido; e tímido; e tímido; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost mais corrediças</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolongar ouro</td><td>Sondas moleculares</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpos secundários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato para galinhas AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ovelha para burros AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato para galinhas AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ovelha para burros AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Controle de</td><td></td><td></td> isotipo<td></td></tr><tr><td>Coelho IgG</td><td>Em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coelho IgG</td><td>Em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG1</td><td>BD Biociência</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Coelho IgG</td><td>Em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rato IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Ovelha IgG</td><td>Em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Programas de software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Para a intensidade média dos fluoróforos, um aplicativo de escritório padrão como o Microsoft Excel pode ser usado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Microscópios</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>C1 Microscópio de varredura confocal</td> Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Microscópio de varredura confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Fontes de tecido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amostras de LBA humana da sala de broncoscopia do Monash Medical Center</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amostras de BAL de camundongos e tecido pulmonar do Departamento de Farmacologia da Universidade de Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Outros reagentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>fixador de paraformaldeído/periodato/lisina (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Formalina natural</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvente 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Camundongos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 preto 6</td><td>Monash plataforma de pesquisa animal (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia confocal

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.

Os METs podem ser visualizados de amostras de BAL, no tecido pulmonar e nas seções mais grossas de pulmão com imagens em 3D. Um exemplo de METs visualizado em uma amostra de BAL é mostrado na Figura 1. A morfologia do METs irá variar de acordo com seu estágio de maturação. A primeira característica detectável na microscopia é o movimento do núcleo à borda da célula. Isto é seguido por cromatina extracelular com outros mediadores co expressas, tais como H3Cit ...

Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

O objetivo geral deste método é demonstrar como as armadilhas extracelulares de macrófagos podem ser visualizadas e estudadas usando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação, como respostas a infecções e outros estímulos imunológicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma modificação de um método bem estabelecido que tem sido usado para estudar armadilhas extracelulares de neutrófilos.Demonstrando este procedimento estará Roleen Sharma. Após a obtenção de macrófagos pulmonares de humanos e camundongos por lavagem broncoalveolar, ou LBA, de acordo com o protocolo de texto, use azul de tripano e um hemocitômetro para realizar uma contagem de células viáveis na solução de LBA. Pipete de uma a quatro vezes 10 até o quinto macrófagos em 500 microlitros de meio de cultura em lamínulas nos poços das placas de 24 poços e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius durante a noite para que as células adiram.Remova o meio de cultura e use PBS para lavar as células uma vez. Em seguida, adicione 2% de paraformaldeído-periodato-lisina ou fixador PLP e incube as amostras por 10 minutos. Depois de usar PBS para lavar brevemente as células, adicione 0,2% TWEEN 20 em PBS e incube as células por 20 minutos.Em seguida, para bloquear as células, adicione soro de frango a 10% em 5% BSA, diluído em PBS e incube as amostras em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, substitua a solução em bloco por uma concentração de um a 100 anticorpos primários e de controle de isótopos e incube as células à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, use PBS para lavar as células antes de adicionar os anticorpos secundários correspondentes.Em seguida, incube as amostras por 40 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar as células em PBS, monte as amostras com meio de montagem baseado em DAPI e, em seguida, visualize as amostras usando um microscópio confocal. Para pré-tratar as amostras FFPE com solução de recuperação de antígeno, seque as lâminas no forno a 60 graus Celsius por 60 minutos.Em seguida, transfira as lâminas para a solução de xileno por 30 minutos antes de transferir as amostras para etanol a 70% em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de usar água da torneira para enxaguar as lâminas, coloque-as em filme plástico à prova de calor e submeta-as a uma maior recuperação de antígeno, colocando-as em uma panela de pressão em Tris-EDTA pH 9.0 por 10 minutos. Resfrie as amostras por 20 minutos e transfira-as para água da torneira.Em seguida, coloque-os em uma cadeira de balanço por cinco minutos. Repita a lavagem com água da torneira e, em seguida, lave os slides uma vez em PBS no balancim. Para bloquear as amostras, adicione 10% de soro de frango em 5% BSA PBS e incube-as em temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, para definir armadilhas extracelulares de macrófagos, ou METs em macrófagos, adicione uma diluição de um a 100 de anticorpos primários em PBS 1% BSA e incube as lâminas a quatro graus Celsius por 16 horas. Use PBS para lavar as amostras duas vezes em um balancim por cinco minutos cada. Adicione os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes em 1% BSA PBS e incube as lâminas em temperatura ambiente por 40 minutos.Após as lavagens de PBS, use DAPI contendo meio de montagem para manchar a cromatina e montar as amostras. Usando um cabeçote de varredura a laser confocal conectado a um microscópio invertido, capture imagens fluorescentes usando objetivas de ar 20X 0,1 NA e 40X 1,0 NA óleo. Capture imagens de plano único de 512 por 512 pixels clicando no botão de nivelamento sequencial de linha.Obtenha pelo menos 10 campos de visão por seção para análise e dados para cada resultado. Para corar as seções em tubos de microcentrífuga, adicione os anticorpos primários relevantes em volumes de 200 microlitros e incube as amostras a quatro graus Celsius por 16 horas. Lave as secções em PBS três vezes durante 10 minutos antes de adicionar os anticorpos secundários adequados e incubar as amostras à temperatura ambiente durante uma hora.Use DAPI para corar as seções pulmonares em solução e incube as amostras por 20 minutos antes de adicionar lamínulas às seções nas lâminas do microscópio em PBS. Use um microscópio confocal invertido com uma objetiva 40X 1,3 NA, equipado com lasers de 405 nanômetros, 440 nanômetros, 473 nanômetros, 543 nanômetros e 635 nanômetros, para capturar imagens e gravar pilhas Z 3D, 0,54 mícrons de espessura, com seccionamento Z ideal. Por fim, analise as imagens de acordo com o protocolo de texto.Um exemplo de METs em uma amostra de BAL é mostrado aqui. A primeira característica detectável é o movimento do núcleo para a borda da célula, como visto neste estágio anterior do MET que tem uma forma aproximadamente esférica. Isso é seguido pela cromatina extracelular com outros mediadores co-expressos, como H3Cit e proteases granulares, como visto neste MET mais maduro.O estágio anterior MET é superior esquerdo e o estágio posterior MET está abaixo disso em direção ao centro. Os METs do tecido pulmonar são mostrados nesta figura. À medida que os pulmões são inflados com fluido para definir a arquitetura pulmonar, os METs serão empurrados contra as paredes alveolares.A morfologia dos METs também varia dependendo do plano em que o tecido foi cortado. As seções padrão usadas para amostras de tecido pulmonar têm de quatro a cinco mícrons de espessura. Seções de tecido mais espessas permitem que várias imagens sejam tiradas e os METs podem ser visualizados em 3D.Um exemplo de uma imagem 3D de tecido pulmonar de camundongo cortado em seções de 25 a 35 mícrons é apresentado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias de coloração e imagem, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser gentil com as lavagens.Após este procedimento, outros métodos, como a zimografia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a expressão da protease. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para o estudo das respostas inflamatórias dos macrófagos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar METs usando microscopia confocal.Não se esqueça de que trabalhar com PLP pode ser perigoso e precauções como usar luvas e proteção para os olhos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Um método é descrito para selecionar individualmente, manipular e patógenos imagem ao vivo usando uma armadilha óptica acoplada a um microscópio disco giratório. A armadilha óptica fornece controle espacial e temporal dos organismos e os coloca ao lado células hospedeiras. Microscopia de fluorescência captura dinâmica interações intercelulares com perturbação mínima para as células.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para a imunocoloração e visualização baseada em microscopia confocal de armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) em tecido pulmonar murino. Os macrófagos residentes no tecido são caracterizados pela expressão do marcador de glicoproteína de superfície F4/80 específico do macrófago, enquanto os METs são visualizados marcando os marcadores MET metaloproteinase 9 da matriz, histona citrulinada H3 e cromatina extracelular.

Caracterização de armadilhas extracelulares de macrófagos em amostras de tecido pulmonar de camundongos

Este vídeo demonstra a imunomarcação de armadilhas extracelulares de macrófagos, METs, em macrófagos broncoalveolares do fluido de lavagem broncoalveolar, e sua visualização usando um microscópio confocal.

Visualização de Armadilhas Extracelulares em Macrófagos de Fluidos de Lavagem Broncoalveolar Humana

Este vídeo demonstra a estimulação in vitro de armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) em macrófagos derivados de monócitos humanos usando diferentes estímulos inflamatórios, como TNF-alfa, PMA e HOCL. O vídeo também demonstra o método de coloração com corante SYTOX de METs para visualização.

Estimulação in vitro e visualização de armadilhas extracelulares de macrófagos

Descrevemos uma configuração experimental para visualizar com alta resolução sem precedentes a formação e fechamento de fagossomos em três dimensões em macrófagos vivos, usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Permite o monitoramento da base do copo fagocítico, dos pseudópodes que se estendem, bem como do local preciso da cisão do fagossomo.

&quot;Fagossomo Encerramento Ensaio&quot; para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas tridimensionais geradas por granulócitos estimulados de neutrófilos. Tornou-se claro nos últimos anos que as redes estão envolvidas em uma grande variedade de doenças. A detecção de redes no tecido pode ter relevância diagnóstica, sendo necessários protocolos padronizados para a rotulagem de componentes NET.

Rotulagem de imunofluorescência de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e murinos em tecido embebido em parafina

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) estão associadas a várias doenças, e a imunofluorescência é frequentemente usada para sua visualização. No entanto, existem vários protocolos de coloração e, em muitos casos, apenas um tipo de tecido é examinado. Aqui, estabelecemos um protocolo geralmente aplicável para coloração de NETs em tecido humano e de camundongo.

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Aprenda a visualizar armadilhas extracelulares de macrófagos por microscopia confocal em amostras pulmonares humanas e murinas. Este método avança pesquisas em imunologia e respostas inflamatórias.

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

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