Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

O objetivo geral deste método é demonstrar como as armadilhas extracelulares de macrófagos podem ser visualizadas e estudadas usando microscopia confocal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da inflamação, como respostas a infecções e outros estímulos imunológicos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é uma modificação de um método bem estabelecido que tem sido usado para estudar armadilhas extracelulares de neutrófilos.

Demonstrando este procedimento estará Roleen Sharma. Após a obtenção de macrófagos pulmonares de humanos e camundongos por lavagem broncoalveolar, ou LBA, de acordo com o protocolo de texto, use azul de tripano e um hemocitômetro para realizar uma contagem de células viáveis na solução de LBA. Pipete de uma a quatro vezes 10 até o quinto macrófagos em 500 microlitros de meio de cultura em lamínulas nos poços das placas de 24 poços e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius durante a noite para que as células adiram.

Remova o meio de cultura e use PBS para lavar as células uma vez. Em seguida, adicione 2% de paraformaldeído-periodato-lisina ou fixador PLP e incube as amostras por 10 minutos. Depois de usar PBS para lavar brevemente as células, adicione 0,2% TWEEN 20 em PBS e incube as células por 20 minutos.

Em seguida, para bloquear as células, adicione soro de frango a 10% em 5% BSA, diluído em PBS e incube as amostras em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, substitua a solução em bloco por uma concentração de um a 100 anticorpos primários e de controle de isótopos e incube as células à temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, use PBS para lavar as células antes de adicionar os anticorpos secundários correspondentes.

Em seguida, incube as amostras por 40 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar as células em PBS, monte as amostras com meio de montagem baseado em DAPI e, em seguida, visualize as amostras usando um microscópio confocal. Para pré-tratar as amostras FFPE com solução de recuperação de antígeno, seque as lâminas no forno a 60 graus Celsius por 60 minutos.

Em seguida, transfira as lâminas para a solução de xileno por 30 minutos antes de transferir as amostras para etanol a 70% em temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de usar água da torneira para enxaguar as lâminas, coloque-as em filme plástico à prova de calor e submeta-as a uma maior recuperação de antígeno, colocando-as em uma panela de pressão em Tris-EDTA pH 9.0 por 10 minutos. Resfrie as amostras por 20 minutos e transfira-as para água da torneira.

Em seguida, coloque-os em uma cadeira de balanço por cinco minutos. Repita a lavagem com água da torneira e, em seguida, lave os slides uma vez em PBS no balancim. Para bloquear as amostras, adicione 10% de soro de frango em 5% BSA PBS e incube-as em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, para definir armadilhas extracelulares de macrófagos, ou METs em macrófagos, adicione uma diluição de um a 100 de anticorpos primários em PBS 1% BSA e incube as lâminas a quatro graus Celsius por 16 horas. Use PBS para lavar as amostras duas vezes em um balancim por cinco minutos cada. Adicione os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes em 1% BSA PBS e incube as lâminas em temperatura ambiente por 40 minutos.

Após as lavagens de PBS, use DAPI contendo meio de montagem para manchar a cromatina e montar as amostras. Usando um cabeçote de varredura a laser confocal conectado a um microscópio invertido, capture imagens fluorescentes usando objetivas de ar 20X 0,1 NA e 40X 1,0 NA óleo. Capture imagens de plano único de 512 por 512 pixels clicando no botão de nivelamento sequencial de linha.

Obtenha pelo menos 10 campos de visão por seção para análise e dados para cada resultado. Para corar as seções em tubos de microcentrífuga, adicione os anticorpos primários relevantes em volumes de 200 microlitros e incube as amostras a quatro graus Celsius por 16 horas. Lave as secções em PBS três vezes durante 10 minutos antes de adicionar os anticorpos secundários adequados e incubar as amostras à temperatura ambiente durante uma hora.

Use DAPI para corar as seções pulmonares em solução e incube as amostras por 20 minutos antes de adicionar lamínulas às seções nas lâminas do microscópio em PBS. Use um microscópio confocal invertido com uma objetiva 40X 1,3 NA, equipado com lasers de 405 nanômetros, 440 nanômetros, 473 nanômetros, 543 nanômetros e 635 nanômetros, para capturar imagens e gravar pilhas Z 3D, 0,54 mícrons de espessura, com seccionamento Z ideal. Por fim, analise as imagens de acordo com o protocolo de texto.

Um exemplo de METs em uma amostra de BAL é mostrado aqui. A primeira característica detectável é o movimento do núcleo para a borda da célula, como visto neste estágio anterior do MET que tem uma forma aproximadamente esférica. Isso é seguido pela cromatina extracelular com outros mediadores co-expressos, como H3Cit e proteases granulares, como visto neste MET mais maduro.

O estágio anterior MET é superior esquerdo e o estágio posterior MET está abaixo disso em direção ao centro. Os METs do tecido pulmonar são mostrados nesta figura. À medida que os pulmões são inflados com fluido para definir a arquitetura pulmonar, os METs serão empurrados contra as paredes alveolares.

A morfologia dos METs também varia dependendo do plano em que o tecido foi cortado. As seções padrão usadas para amostras de tecido pulmonar têm de quatro a cinco mícrons de espessura. Seções de tecido mais espessas permitem que várias imagens sejam tiradas e os METs podem ser visualizados em 3D.

Um exemplo de uma imagem 3D de tecido pulmonar de camundongo cortado em seções de 25 a 35 mícrons é apresentado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias de coloração e imagem, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser gentil com as lavagens.

Após este procedimento, outros métodos, como a zimografia, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a expressão da protease. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para o estudo das respostas inflamatórias dos macrófagos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar METs usando microscopia confocal.

Não se esqueça de que trabalhar com PLP pode ser perigoso e precauções como usar luvas e proteção para os olhos devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.