Um protocolo para laboratório habitação de turquesa Killifish (Nothobranchius furzeri)

O objetivo geral deste protocolo é criar com sucesso uma colônia de laboratório de killifish turquesa para estudar o envelhecimento e doenças relacionadas à idade de maneira rápida e de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento, como se mutações genéticas únicas ou intervenções ambientais podem modular o processo de envelhecimento em espécies de vertebrados. A principal vantagem dessa técnica é que, seguindo nossos protocolos básicos, vários laboratórios agora podem realizar experimentos usando killifish turquesa.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a criação de killifish tem algumas características únicas. Por exemplo, os embriões são criados em um substrato seco antes da eclosão, o que é muito diferente dos modelos canônicos de peixes, como o peixe-zebra. Para começar, monte tanques de reprodução de 9,5 litros, cada um com um macho de cinco semanas e duas fêmeas de seis a sete semanas.

Em seguida, encha um recipiente de plástico com areia autoclavada de aproximadamente dois a três centímetros de profundidade e coloque a caixa de areia no centro do tanque de reprodução. Permita que o killifish turquesa se reproduza continuamente e colha embriões uma vez por semana para incubação de embriões. Para colher embriões de um estágio celular para uso em injeção e geração de linhagens transgênicas, monte um tanque de reprodução com um peixe macho e duas fêmeas, como acabamos de demonstrar.

Dois dias antes da coleta do embrião, transfira o macho para um tanque individual e mantenha-o em contato visual com as fêmeas adultas. No dia da coleta, adicione o macho e uma caixa de areia ao tanque de reprodução e deixe os peixes desovarem por duas horas. Depois de desovar e remover a caixa de areia do tanque, esvazie a caixa de areia em uma peneira e use a água do sistema para enxaguá-la.

Em seguida, mergulhe parcialmente o filtro na água do sistema e gire-o suavemente para que os embriões se agrupem no centro. Usando uma pipeta Pasteur de dois mililitros, colete os embriões e transfira-os para uma placa de Petri de 90 milímetros com aproximadamente 40 mililitros de água do sistema. Sob um microscópio óptico, inspecione os embriões na placa de Petri e remova aqueles que apresentam um córion rompido e sinais de danos.

Depois de branquear os embriões de acordo com o protocolo de texto, inspecione e remova quaisquer embriões mortos que seriam manchados de azul. Uma vez que os embriões tenham sido incubados em solução fresca de azul de metileno, verifique se os embriões desenvolvidos têm olhos pretos visíveis. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur descartável ou uma pinça curva fina, transfira os embriões para uma placa de papel de filtro.

Retenha todos os embriões não desenvolvidos em azul de metileno e monitore-os diariamente. Uma vez que os olhos negros tenham se desenvolvido, transfira-os para um meio de substrato sólido. Com uma pinça, espalhe os embriões com aproximadamente cinco milímetros de distância até 100 embriões por placa de 90 milímetros.

Em seguida, use parafina para selar o prato e incube os embriões a 28 graus Celsius por duas a três semanas até que tenham íris douradas totalmente desenvolvidas e estejam prontos para eclodir. Para armazenamento de longo prazo por até um ano, após incubação em solução de azul de metileno por três dias, transfira os embriões para placas médias de substrato sólido, conforme demonstrado, e incube-os a 17 graus Celsius. Para chocar os peixes, use uma pinça curva fina para transferir cuidadosamente 50 a 100 embriões desenvolvidos para a caixa de incubação e mergulhe-os totalmente em solução de ácido húmico a uma profundidade não superior a dois centímetros a quatro graus Celsius.

Uma etapa crítica neste protocolo é a incubação de embriões killifish, que é obtida pela transferência de embriões incubados em um substrato seco para uma solução de incubação contendo ácido húmico fornecido com aeração suficiente. Cubra a caixa de incubação com uma tampa e incube-a a 28 graus Celsius em uma incubadora de incubação. Para fornecer aeração suficiente, conecte a caixa a um suprimento de ar com tubulação.

Para manter a qualidade adequada da água na caixa de incubação, uma vez por dia a partir do dia seguinte à eclosão, reabasteça a caixa com uma proporção de um para um de água do sistema autoclavado, mantendo uma profundidade final de dois centímetros. Transfira todos os embriões não eclodidos de volta para o substrato sólido e tente eclodir uma semana depois. Para criar peixes juvenis e adultos cinco dias após a eclosão, mova os juvenis para o sistema de recirculação de água usando pipetas de plástico descartáveis ou uma colher de plástico para transferir cuidadosamente cinco juvenis por tanque de 0,8 litro equipado com uma tela de fritura de 400 micrômetros.

Aos 14 dias de idade, transfira os peixes juvenis para um tanque de 2,8 litros equipado com uma tela de alevinos de 850 micrômetros. A partir deste ponto, rotule cada tanque com um ID de peixe. Para ensaios de sobrevivência, aloje individualmente cada peixe em um único tanque. Os peixes criados para ensaios de sobrevivência também são alojados individualmente em um tanque de 2,8 litros.

Nos sete dias seguintes, alimente os juvenis duas vezes ao dia com cinco mililitros de artêmia suplementada com um a três vermes vivos do sangue. Às quatro semanas de idade, alimente cada peixe duas vezes por dia com artêmia e um mililitro de vermes sanguíneos. Nesta fase, certifique-se de que o peixe atinja a maturação sexual completa, verificando a presença de grandes barbatanas dorsais, anais e caudais com sinais de coloração nos machos e abdômen redondo cheio de ovos nas fêmeas.

Aqui é mostrada uma curva de sobrevivência representativa para 70 killifish turquesa machos. A criação adequada resulta em sobrevida média variando de 12 a 28 semanas na linhagem GRZ. As variações na sobrevida mediana dependem da dieta, frequência de alimentação e condições de temperatura do alojamento.

A curva de sobrevivência para peixes criados sob má criação revela um aumento na mortalidade precoce e quedas repentinas repetitivas na sobrevivência ao longo do tempo em comparação com peixes criados em condições ideais de criação. Ao seguir este protocolo, é importante monitorar de perto a condição da água e o excesso de alimentos dos alevinos recém-nascidos, pois é essencial que eles sejam mantidos em um ambiente limpo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem manipulações experimentais em killifish turquesa, incluindo transgênese, edição de genoma e manipulações dietéticas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar com sucesso killifish turquesa em laboratório e usar este modelo para explorar a biologia do envelhecimento no vertebrado de vida mais curta que pode ser criado em cativeiro.