Name: Um protocolo para laboratório habitação de turquesa Killifish (Nothobranchius furzeri) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a criar Nothobranchius furzeri em laboratório para estudos de envelhecimento e doenças relacionadas à idade. Este protocolo padronizado permite pesquisas de alta produtividade com o peixe mais curto de vida entre vertebrados.

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Agradecemos Alessandro Cellerino, Tyrone Genade, Anne Brunet, Sabrina Sharp, Mickie Powell, Simone Keil, Yumi Kim, Patrick Smith, Kai Mathar e todos os membros do laboratório Valenzano no Instituto Max Planck de biologia do envelhecimento contribuem para diferentes aspectos o protocolo de criação de killifish actual ao longo dos anos.

<ol><li>Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+aging+model+systems+and+why+we+need+them%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Non-canonical aging model systems and why we need them.</a> EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).</li>
<li>Harel, I., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish%3A+A+Model+for+Exploring+Vertebrate+Aging+and+Diseases+in+the+Fast+Lane%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).</li>
<li>Smith, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+life+span+by+the+gut+microbiota+in+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+bush+to+the+bench%3A+the+annual+Nothobranchius+fishes+as+a+new+model+system+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).</li>
<li>Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short-lived+African+turquoise+killifish%3A+an+emerging+experimental+model+for+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).</li>
<li>Blazek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intraspecific+divergence+in+life+span+and+aging+of+African+annual+fishes+along+an+aridity+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient.</a> Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).</li>
<li>Terzibasi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+differences+in+aging+phenotype+between+strains+of+the+short-lived+annual+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri.</a> PLoS One. 3 (12), e3866(2008).</li>
<li>Kirschner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+quantitative+trait+loci+controlling+lifespan+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri--a+new+vertebrate+model+for+age+research%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research.</a> Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+loci+associated+with+tail+color+and+sex+determination+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).</li>
<li>Reichwald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Sex+Chromosome+Evolution+and+Aging+from+the+Genome+of+a+Short-Lived+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish.</a> Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+Turquoise+Killifish+Genome+Provides+Insights+into+Evolution+and+Genetic+Architecture+of+Lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan.</a> Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).</li>
<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

Todos os autores declaram não concorrentes interesses financeiros e não financeiros.

Descreveremos um protocolo para laboratório de cultivo de killies turquesa, incluindo a colheita de embriões, incubação, bem como a carcaça de peixes adultos, reprodução e alimentação. Nosso protocolo destina-se especificamente aos laboratórios que realizam pesquisas focadas em peixes adultos, em particular em estudos experimentais sobre envelhecimento e vida útil. Killies turquesa podem ser gerado em uma instalação padrão do zebrafish; no entanto, aspectos importantes da criação de killifish diferem dos cuidados de zebrafish padrão16. Essas adaptações incluem transição precoce de uma dieta só de artémia para uma dieta suplementada com verme de sangue rico em proteínas, bem como as etapas específicas na incubação de embriões, consistindo de uma fase de incubação líquidas e secas.
Passos críticos dentro do protocolo incluem transporte de embriões na faixa de temperatura de 8-30 ° C. Em caso de reprodução, fecundidade depende da alimentação, frequência e qualidade dos alimentos; Portanto, recomendamos pelo menos duas refeições por dia por reprodução tanque para aumentar o rendimento de embriões (ver secção 5.6.). Durante o clareamento de embrião, não se estendem incubação de embriões na solução de branqueamento. Isso pode causar danos ao córion ovo e embrião maior mortalidade. Quando incubando embriões com azul de metileno, não prolonga a incubação de embriões de pronto-a-porta por mais de 2 semanas como sua viabilidade será drasticamente reduzida. Para incubação killies turquesa, baixa temperatura da solução de ácido húmico melhora para incubação e imersão completa dos embriões na solução permite sincronizado para incubação. Não é suficiente arejamento durante os resultados de incubação em altas taxas de alevinos não é capazes de encher a bexiga de gás (fenótipo "barriga-slider", ver notas na secção 5.1).
Limitação do protocolo para reprodução inclui o uso do substrato areia quais desafios de poses para centralizada de sistemas de filtragem e devem ser substituídos por métodos alternativos no futuro. Possíveis alternativas poderiam ser a utilização de tanques de criação de zebrafish. Branqueamento de embrião pode causar grandes mudanças físico-químicas no córion ovo que pode resultar na fisiologia do córion alterada e o sucesso da incubação. Constante exposição dos embriões ao azul de metileno pode induzir mudanças de longo prazo em fisiologia de peixes adultos. Criar peixes adultos em tanques individuais para estudos de coorte de sobrevivência pode afetar negativamente saúde e comportamento dos peixes. No entanto, Alojamento em grupo para estudos de coorte de sobrevivência adiciona fatores de confundimento significativos devido ao estabelecimento de dominância social e territórios masculinos, levando a rígidas hierarquias sociais. Portanto, julgamos que o isolamento de peixe masculino para estudos de sobrevivência é um compromisso razoável. Colônias de killies laboratório alimentação com alimento vivo de fontes não-controlados adicionar um risco de contaminações externas de comunidades microbianas potencialmente patogênicas e parasitas. No futuro, um alimento para peixes estéril ad hoc deve ser desenvolvido.
Futuras melhorias para este protocolo incidirá sobre uma dieta controlada, não-vivo, que ainda leva para completar a maturação sexual dentro de 3-4 semanas. Em resumo, nosso protocolo oferece acessibilidade para turquesa killies laboratório de cultivo de uma comunidade científica ampla.

Dada a sua curta duração e ciclo de vida rápido, killies turquesas estão crescendo rapidamente como um promissor novo organismo modelo em biologia1,2,3. Esta espécie é caracterizada por um ciclo de vida exclusivo para um teleósteos, consistindo de diapausa embrionária, rápida maturação sexual e uma duração prolongada pós-reprodutivo estágio4,5. Trabalhos recentes tem contribuído para elucidar a biologia desta espécie em cativeiro e no selvagem6,7. Turquesas killies vivem em corpos de água doce sazonal que se formam durante a estação chuvosa na savana africana em Zimbabwe e Moçambique. Durante a estação seca, embriões sobrevivem na lama seca na ausência de água em virtude de um estágio de vida resistente ao estresse chamado diapausa.
Mapas de genética desta espécie foram gerados8,9, e recentemente seu genoma foi sequenciado e montado10,11. Desenvolveram-se várias cepas de peixes do laboratório puras e transgênese e genoma edição via CRISPR/Cas9 tornaram-se disponíveis nesta espécie, de fato promover killies turquesa como um organismo de vertebrados modelo competitivo de laboratório 12,13,14.
Embora um protocolo do laboratório já tenha sido publicado por esta espécie de15, no presente protocolo, nós desenvolvemos uma lista abrangente das orientações do laboratório experimental que visam especificamente a estudos que investigam o envelhecimento e sobrevivência. O presente protocolo permite que pesquisadores já familiarizados com a criação do zebrafish e medaka tornar-se versado na criação de killifish turquesa através da adopção de um número mínimo de ajustes chaves. Ao mesmo tempo, este protocolo fornece pesquisadores sem experiência prévia em criação de peixes com as ferramentas essenciais para criar uma próspera colônia de killies turquesa.

<table><tbody><tr><td>Solução tampão de calibração da sonda pH=7,0</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>Solução tampão de 1L pH=7,0 para calibrar o eléctrodo de pH do sistema de água</td></tr><tr><td>Solução tampão de calibração da sonda pH=4,0</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>Solução tampão de 1L pH=4,0 para calibrar o eléctrodo de pH do sistema de água</td></tr><tr><td>Padrão de condutividade</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL Padrão de condutividade 1.413 uS/cm para calibrar o sistema de água eléctrodo de condutividade</td></tr><tr><td>Easy Strips Test 6in1</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>Tiras de teste para determinação dos valores de cloro da água do sistema</td></tr><tr><td>Teste de amoníaco</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>Teste para determinar o teor de amoníaco da água do sistema</td></tr><tr><td>Sal do Mar</td><td>Vermelho Balde</td><td></td><td>de 22 kg</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>Ácido húmico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>Novo enriquecimento de Artemia HUFA</td><td>ZM Systems UK</td><td></td><td>garrafa de 75g</td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (p / p)</td></tr> <tr><td>Fibra de coco</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>GE saúde</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>Etanol puro</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr> <tr><td>areia de sílica</td><td>pet shop</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Artemia Eggs Lixadeiras</td><td></td><td></td><td></td>de grau premium</tr><tr><td>Bloodworm</td><td>distribuidor</td><td></td> local <td>Poseidon Aquakultur Alemanha</td></tr><tr><td>dNTPs solução mix</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5U/uL</td></tr><tr><td>PCR 10x Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH=8,0 solução</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1M</td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Tanques</td> <td>de peixesVolume de abrandamento</td><td></td><td>: 0,8 L, 2,8 L, 9,5 L; equipado com defletores, malha de fritura e tampas</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>modelo 5000</td></tr><tr><td>Incubadora microbiológica</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>modelo IMC18; para armazenamento de embriões na fase líquida, definido para t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>: Pasta de Incubadora de Resfriamento</td><td></td><td>9020-0209</td><td>modelo KT115; para embriões de armazenamento na fase sólida, definido para t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Incubadora de incubação</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>modelo OGS180; para incubação de embriões, definido como t=27-28&deg; C</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td></td><td>modelo M80</td></tr><tr><td>Caixas de areia/incubação de reprodução</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000mL</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92x16mm</td></tr><tr><td>50 mL Tubo cônico</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cônico</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico descartável Pasteur</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2mL; Para peixes que se alimentam com minhocas ou seleção de embriões, corte a ponta para abrir</td></tr> a <tr><td>pipeta sorológica</td> de 3-4 mm de diâmetro <td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>Seringa de 50mL</td></tr><tr><td></td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10mL</td></tr><tr><td>Finura do filtro</td><td></td><td></td> de metal <td>< 1mm; para a colheita de embriões</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>tipo5/45; para transferência de embriões</td></tr><tr><td>25 L Nascedouro de artêmia</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>nascedouro principal</td></tr><tr><td>500 mL Nascedouro de artêmia</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>modelo Artemio 1; nascedouro de reserva</td></tr><tr><td>Rede de malha estreita</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copo de areia</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td> Copo de separação de artêmia <td>de 5000mL</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000mL</td></tr><tr><td>Saco plástico com zíper</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>para armazenamento de peixes mortos</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>modelo Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ar</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>4-6 mm de diâmetro</td></tr><tr><td>1 L Garrafa de vidro</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L Garrafa de vidro</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Garrafa squeeze</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>para alimentação de peixes com artêmia</td></tr><tr><td>120-&#956; filtro de artêmia m</td> Florida <td>Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>para coleta de artêmia/minhoca</td></tr><tr><td>Meias de filtro de acabamento</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&#956; m</td></tr><tr>Sistema <td></td><td></td><td>central de alojamento de peixes</td><td>de filtração Aquaneering, Techniplast, Habitats Aquáticos, Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

um protocolo para laboratório habitação de turquesa killifish (nothobranchius furzeri)

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

O desenvolvimento de práticas de produção animal em laboratório não-modelo peixe utilizados para fins experimentais muito beneficiou a criação de peixes de referência sistemas modelo, tais como o zebrafish e medaka. Nos últimos anos, um peixe emergente – os killies turquesa (Nothobranchius furzeri) – tem sido adotado por um número crescente de grupos de pesquisa nos campos da biologia do envelhecimento e ecologia. Com uma extensão de vida em cativeiro de 4 a 8 meses, esta espécie é o enfase vertebrados criados em cativeiro e permite que a comunidade científica para teste – em um curto período de tempo – intervenções experimentais que podem levar a alterações da taxa de envelhecimento e a expectativa de vida. Dada a biologia exclusiva desta espécie, caracterizada por diapausa embrionária, maturação sexual explosiva, marcado dimorfismo sexual morfológico e comportamental - e sua expectativa de vida relativamente curta adulta - criação ad hoc , as práticas são em urgente demanda. Este protocolo relata um conjunto de medidas de criação de chave que permitem ideal killies turquesa cuidados de laboratório, permitindo que a comunidade científica adoptar esta espécie como um modelo animal de laboratório poderoso.

Criação adequada de turquesa killies resulta na sobrevida média variando entre 12-18 semanas na estirpe GRZ (por exemplo, Figura 4A). Variações de sobrevida mediana dependem de dieta, frequência de alimentação e as condições de temperatura de alojamento. Resultados de criação pobre em curvas de sobrevivência apresentando aumentaram a mortalidade precoce e repetitivas, súbitas gotas de sobrevivência ao longo do tempo, caracteriza-se por vários pontos de inflexão (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg"> Figura 1: estádios de desenvolvimento embrionários representativos com substrato de incubação respectivos. (A) recém coletados embriões, incubados em solução de azul de metileno na incubadora a 28 ° C. (B) pronto para ser transferido para um meio sólido, embriões também filtro de fibra de papel ou coco. (C) embriões pronto para ser chocado, exibindo o típicas íris douradas. Barra de escala é igual a 1 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg"> Figura 2: estágios de turquesa killies pós-incubação desenvolvimento. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg"> Figura 3: etiqueta de identificação representativa de peixe para peixe de fase 3 em diante. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg"> Figura 4: curva representativa de sobrevivência para 70 masculinos turquesas killies. (A) curva de sobrevivência típico para laboratório-gerado turquesa killies. (B) comparação de curvas de sobrevivência obtidos de peixes criados sob condições ideais de criação (preto) e pecuária pobre (vermelho e azul). Linha horizontal tracejada vermelha indica 50% de sobrevivência, curva de sobrevivência se cruzam no tempo de vida médio (indicado no eixo x). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ID</td>
			<td colspan="2">Cartilha para a frente</td>
			<td colspan="2">Primeira demão reversa</td>
			<td>Faixa de tamanho (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
<tr>
<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
<tr>
<td>* NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">* - marcadores de determinação do sexo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Primers de genotipagem para identificação da estirpe.

Habitação de laboratório de turquesa killies podem ser escalados para casa e eficientemente criar milhares de peixes individuais em um sistema de filtragem de água centralizado, empregando a mesma infraestrutura utilizada para instalações padrão do zebrafish. Aqui detalhamos uma lista de procedimentos padronizados que permitem a manutenção eficiente killies.

Um protocolo para laboratório habitação de turquesa Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

O objetivo geral deste protocolo é criar com sucesso uma colônia de laboratório de killifish turquesa para estudar o envelhecimento e doenças relacionadas à idade de maneira rápida e de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento, como se mutações genéticas únicas ou intervenções ambientais podem modular o processo de envelhecimento em espécies de vertebrados. A principal vantagem dessa técnica é que, seguindo nossos protocolos básicos, vários laboratórios agora podem realizar experimentos usando killifish turquesa.Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois a criação de killifish tem algumas características únicas. Por exemplo, os embriões são criados em um substrato seco antes da eclosão, o que é muito diferente dos modelos canônicos de peixes, como o peixe-zebra. Para começar, monte tanques de reprodução de 9,5 litros, cada um com um macho de cinco semanas e duas fêmeas de seis a sete semanas.Em seguida, encha um recipiente de plástico com areia autoclavada de aproximadamente dois a três centímetros de profundidade e coloque a caixa de areia no centro do tanque de reprodução. Permita que o killifish turquesa se reproduza continuamente e colha embriões uma vez por semana para incubação de embriões. Para colher embriões de um estágio celular para uso em injeção e geração de linhagens transgênicas, monte um tanque de reprodução com um peixe macho e duas fêmeas, como acabamos de demonstrar.Dois dias antes da coleta do embrião, transfira o macho para um tanque individual e mantenha-o em contato visual com as fêmeas adultas. No dia da coleta, adicione o macho e uma caixa de areia ao tanque de reprodução e deixe os peixes desovarem por duas horas. Depois de desovar e remover a caixa de areia do tanque, esvazie a caixa de areia em uma peneira e use a água do sistema para enxaguá-la.Em seguida, mergulhe parcialmente o filtro na água do sistema e gire-o suavemente para que os embriões se agrupem no centro. Usando uma pipeta Pasteur de dois mililitros, colete os embriões e transfira-os para uma placa de Petri de 90 milímetros com aproximadamente 40 mililitros de água do sistema. Sob um microscópio óptico, inspecione os embriões na placa de Petri e remova aqueles que apresentam um córion rompido e sinais de danos.Depois de branquear os embriões de acordo com o protocolo de texto, inspecione e remova quaisquer embriões mortos que seriam manchados de azul. Uma vez que os embriões tenham sido incubados em solução fresca de azul de metileno, verifique se os embriões desenvolvidos têm olhos pretos visíveis. Em seguida, usando uma pipeta Pasteur descartável ou uma pinça curva fina, transfira os embriões para uma placa de papel de filtro.Retenha todos os embriões não desenvolvidos em azul de metileno e monitore-os diariamente. Uma vez que os olhos negros tenham se desenvolvido, transfira-os para um meio de substrato sólido. Com uma pinça, espalhe os embriões com aproximadamente cinco milímetros de distância até 100 embriões por placa de 90 milímetros.Em seguida, use parafina para selar o prato e incube os embriões a 28 graus Celsius por duas a três semanas até que tenham íris douradas totalmente desenvolvidas e estejam prontos para eclodir. Para armazenamento de longo prazo por até um ano, após incubação em solução de azul de metileno por três dias, transfira os embriões para placas médias de substrato sólido, conforme demonstrado, e incube-os a 17 graus Celsius. Para chocar os peixes, use uma pinça curva fina para transferir cuidadosamente 50 a 100 embriões desenvolvidos para a caixa de incubação e mergulhe-os totalmente em solução de ácido húmico a uma profundidade não superior a dois centímetros a quatro graus Celsius.Uma etapa crítica neste protocolo é a incubação de embriões killifish, que é obtida pela transferência de embriões incubados em um substrato seco para uma solução de incubação contendo ácido húmico fornecido com aeração suficiente. Cubra a caixa de incubação com uma tampa e incube-a a 28 graus Celsius em uma incubadora de incubação. Para fornecer aeração suficiente, conecte a caixa a um suprimento de ar com tubulação.Para manter a qualidade adequada da água na caixa de incubação, uma vez por dia a partir do dia seguinte à eclosão, reabasteça a caixa com uma proporção de um para um de água do sistema autoclavado, mantendo uma profundidade final de dois centímetros. Transfira todos os embriões não eclodidos de volta para o substrato sólido e tente eclodir uma semana depois. Para criar peixes juvenis e adultos cinco dias após a eclosão, mova os juvenis para o sistema de recirculação de água usando pipetas de plástico descartáveis ou uma colher de plástico para transferir cuidadosamente cinco juvenis por tanque de 0,8 litro equipado com uma tela de fritura de 400 micrômetros.Aos 14 dias de idade, transfira os peixes juvenis para um tanque de 2,8 litros equipado com uma tela de alevinos de 850 micrômetros. A partir deste ponto, rotule cada tanque com um ID de peixe. Para ensaios de sobrevivência, aloje individualmente cada peixe em um único tanque. Os peixes criados para ensaios de sobrevivência também são alojados individualmente em um tanque de 2,8 litros.Nos sete dias seguintes, alimente os juvenis duas vezes ao dia com cinco mililitros de artêmia suplementada com um a três vermes vivos do sangue. Às quatro semanas de idade, alimente cada peixe duas vezes por dia com artêmia e um mililitro de vermes sanguíneos. Nesta fase, certifique-se de que o peixe atinja a maturação sexual completa, verificando a presença de grandes barbatanas dorsais, anais e caudais com sinais de coloração nos machos e abdômen redondo cheio de ovos nas fêmeas.Aqui é mostrada uma curva de sobrevivência representativa para 70 killifish turquesa machos. A criação adequada resulta em sobrevida média variando de 12 a 28 semanas na linhagem GRZ. As variações na sobrevida mediana dependem da dieta, frequência de alimentação e condições de temperatura do alojamento.A curva de sobrevivência para peixes criados sob má criação revela um aumento na mortalidade precoce e quedas repentinas repetitivas na sobrevivência ao longo do tempo em comparação com peixes criados em condições ideais de criação. Ao seguir este protocolo, é importante monitorar de perto a condição da água e o excesso de alimentos dos alevinos recém-nascidos, pois é essencial que eles sejam mantidos em um ambiente limpo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem manipulações experimentais em killifish turquesa, incluindo transgênese, edição de genoma e manipulações dietéticas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar com sucesso killifish turquesa em laboratório e usar este modelo para explorar a biologia do envelhecimento no vertebrado de vida mais curta que pode ser criado em cativeiro.

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Research

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Biology

Biologia

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