Protocolo para aguda e crônica de ensaios toxicológicos do turquesa Killifish Nothobranchius furzeri

O objetivo geral deste experimento é estudar os efeitos de tóxicos no killifish turquesa Nothobranchius furzeri. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da ecotoxicologia, como os efeitos a longo prazo dos estressores em características importantes da história de vida, sendo o tempo de maturação, o crescimento ou a fecundidade. A principal vantagem deste experimento é que usamos um vertebrado com um ciclo de vida muito rápido, resultando em experimentos eficientes em termos de tempo e custo.

Esses killifish são modelos ideais para estudar o impacto dos efeitos de longo prazo e multigeracionais dos estressores. Em última análise, contribuirão para uma melhor compreensão do impacto ambiental dos tóxicos. Embora esse método possa fornecer novos insights sobre os efeitos combinados de tóxicos e temperatura, ele também pode ser aplicado a outros estressores, como radiação UV, privação de alimentos e alterações de pH.

É difícil trabalhar com Killifish, porque eles são um novo sistema modelo em ecotoxicologia e porque sua sensibilidade a muitos poluentes ainda é desconhecida. Desenvolvemos a ideia para este método experimental quando aprendemos pela primeira vez sobre a vida útil excepcionalmente curta do killifish e sua capacidade de produzir ovos dormentes que podem ser armazenados por anos na prateleira. A demonstração visual deste método é crítica, pois o tipo de experimento, bem como o manuseio dos indivíduos, podem alterar os resultados.

Para começar, selecione gona ray zoo, ou ovos GRZ, no estágio D3, que são reconhecíveis pela presença de olhos dourados. E use uma pinça macia para transferi-los suavemente para um tanque de plástico de dois litros. Adicione um centímetro do meio de incubação a 12 graus Celsius e deixe a temperatura da água se ajustar gradualmente à temperatura ambiente.

Após 24 horas, alimente os filhotes com uma dose concentrada de náuplios de artêmia recém-eclodidos e aumente a profundidade da água para cinco centímetros adicionando meio de peixe. 48 horas após a eclosão, transfira larvas saudáveis e flutuantes para recipientes individuais com meio de exposição e concentrações tóxicas, conforme descrito no protocolo de texto. Todas as manhãs e noites, verifique se há mortalidade, estresse e doença nos peixes e calcule os valores de CL50 de acordo com o protocolo de texto.

Realize um teste de exposição crônica enchendo recipientes individuais com o meio de exposição correto e adicione um tubo de ar para arejar o frasco. Transfira o peixe para os potes pelo restante do experimento. De dois a 23 dias após a eclosão ou DPH, alimente o peixe com náuplios de artemia duas vezes ao dia ad libitum.

Então, após suplementar com larvas de chironomus picadas até 37 DPH, use larvas de chironomus congeladas para alimentar os peixes ad libitum duas vezes por dia, todos os dias, avançando. Para determinar o crescimento, meça o tamanho do corpo semanalmente, transferindo os peixes para uma placa de Petri cheia de meio do reservatório. Tire de quatro a cinco fotos de vista dorsal calibradas em tamanho dos peixes a uma altura fixa.

E use um programa de medição espacial para analisá-los digitalmente. A partir de 15 DPH, inspecione visualmente o peixe macho quanto à coloração, para determinar a maturação. Verifique as barbatanas em busca dos primeiros sinais de coloração nupcial e use o dia em que a coloração do punho era visível como um indicador do tempo de maturação do macho.

A partir de 30 DPH, verifique a fecundidade montando um tanque de desova de um litro para o casal macho e fêmea maduros dentro de cada tratamento, usando meio de exposição do aquário do macho, e complemente-o com substrato de desova. Transfira o macho e a fêmea para o tanque de desova. E enquanto minimiza a atividade humana ou perturbação ao redor dos recipientes de desova, permita que eles desovem por duas horas.

Depois, sem mistura desnecessária da água, que giraria os ovos no substrato de desova, transfira suavemente os peixes de volta aos seus recipientes originais. Filtre os ovos despejando o substrato de desova sobre uma malha de 500 micrômetros. Conte os ovos e use uma pipeta, para transferi-los para turfa úmida em placas de Petri.

Remova os ovos mortos diariamente. Após uma semana, use filme de vedação para selar a placa de Petri. E armazene-o em uma incubadora com temperatura controlada a 28 graus Celsius, com um ciclo de 14 a 10 claros para escuros, para desenvolvimento imediato para a fase D3.

Para conservação a longo prazo, armazene os ovos na escuridão constante a 17 graus Celsius, após os quais os ovos entram na fase dormente e permanecem viáveis por vários anos. Para recrutar peixes dos ovos dormentes, transfira os ovos para 28 graus Celsius e um ciclo de 14 a 10 claros para escuros, por aproximadamente três semanas, para permitir que eles se desenvolvam até a fase D3. Para medir o máximo térmico crítico, ou CT max de peixes adultos, comece com um banho-maria de circulação contínua, aquecido a uma taxa constante de 0,33 graus Celsius por minuto.

Adicione vários aquários de um litro, para cada peixe individual. Comece a trilha adicionando os peixes ao aquário, quando a água atingir a temperatura experimental de criação dos peixes. Use um termômetro digital para monitorar a temperatura nos aquários de um litro do banho CT max, a cada cinco minutos.

Quando o peixe não consegue manter uma posição vertical ventral dorsal, ou começa a se contorcer fortemente, meça a temperatura no aquário de um litro, que é a temperatura máxima crítica. Em seguida, transfira o peixe de volta ao seu alojamento experimental para recuperação. Conforme mostrado neste gráfico, a exposição aguda do enfurzeri a diferentes concentrações de cobre causou um aumento na mortalidade com o aumento da concentração de tóxicos.

Os valores de CL50 diminuem com o tempo, o que significa que, com a diminuição das concentrações, mais tempo passa antes que 50% das réplicas morram. No ensaio de exposição crônica, usando cobre nascido na água, os peixes são mais curtos em comprimento, medidos após três semanas quando criados na concentração mais alta testada. Neste experimento usando clorpirifós ou CPH transmitido pela água, quando criados a 28 graus Celsius, os peixes produziram menos ovos quando expostos à maior concentração de CPF, no entanto, a 30 graus Celsius, os peixes de controle produziram mais ovos do que os peixes expostos a qualquer concentração de CPF, indicando que a combinação de CPF e um aumento na temperatura afetou a fecundidade mais do que cada estressor separadamente.

Aqui é relatada a idade média em que os primeiros sinais de coloração apareceram em machos enfurzeri, expostos ao CPF a 28 e 30 graus Celsius. Após a exposição a quatro microgramas por litro de CPF, o peixe macho demorou 18% mais para amadurecer do que o peixe controle. A medição do CT max de peixes criados a 24 ou 28 graus Celsius e a exposição ao poluente 3, 4-DCA revelaram que a natação errática, o aumento do movimento opercular e a perda da capacidade de permanecer na posição vertical dorsoventral, ocorreram a uma temperatura mais baixa quando os peixes foram criados a 24 graus Celsius.

Uma vez dominado, este protocolo, incluindo os efeitos na fecundidade, pode ser medido em dois meses. Para medir os efeitos em todo o período reprodutivo ou mesmo em uma geração seguinte, o protocolo pode ser estendido, mas ainda pode ser realizado em seis meses.