Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

O objetivo geral deste sistema de infecção baseado em inserção de membrana permeável é estudar os efeitos das toxinas bacterianas secretadas nas células hospedeiras durante a infecção. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das interações patógeno-hospedeiro, como como componentes bacterianos secretados específicos contribuem para as respostas da célula hospedeira durante a infecção bacteriana. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo de componentes de bactérias secretadas e modela mais de perto um ambiente hospedeiro-patógeno fisiologicamente relevante no contexto da infecção humana.

Demonstrando o procedimento estará Rebecca Flaherty, uma estudante de pós-graduação sênior do meu laboratório. Para preparar cepas isogênicas de estreptococos do grupo A do tipo selvagem, ou GAS, e GAS M1T1 5448 mutantes, inicie culturas líquidas durante a noite inoculando cinco a 10 mililitros de caldo Todd Hewitt e incubando a 37 graus Celsius por 16 horas. Centrifugar as culturas bacterianas durante a noite e utilizar o volume original de meio bacteriano fresco para ressuspender o sedimento.

Em seguida, normalize as culturas bacterianas para concentrações iniciais iguais, diluindo as culturas ressuspensas em meio adicional para chegar ao mesmo OD600. Para coletar lisados para realizar análises de sinalização e ensaios de determinação de ATP, colocar células HaCaT em placas de seis poços com uma densidade de assentamento de aproximadamente três vezes 10 elevado a quinta células por poço e cultura a 90% de confluência. Para realizar ensaios de permeabilização da membrana do homodímero de etídio e liberação de lactato desidrogenase, coloque células HaCaT em placas de 24 poços a uma densidade de assento de aproximadamente cinco vezes 10 elevado ao quarto de células por poço e cresça até 90% de confluência.

Imediatamente antes do tratamento, use 1x PBS para lavar as células. Em seguida, aplique dois mililitros de meio de crescimento fresco com ou sem tratamento farmacológico nas placas de seis poços, ou 0,5 mililitros de meio nos poços das placas de 24 poços. Em seguida, sob uma capa de fluxo laminar, use uma pinça estéril para colocar cuidadosamente uma inserção de membrana permeável estéril de 0,4 mícron em cada poço.

O manuseio cuidadoso e estéril das inserções permeáveis durante a preparação da infecção é fundamental para evitar que a membrana seja comprometida ou contaminada durante esse processo. Aplicar meio de culturas de células frescas na câmara superior de cada poço de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, aplique um volume apropriado das culturas bacterianas normalizadas na câmara superior do sistema de inserção de membrana permeável e aplique meio bacteriano nos poços de controle.

A adição cuidadosa das bactérias à câmara superior, bem como o transporte suave das células infectadas para a incubadora, são essenciais, pois é essencial que as bactérias não contaminem a câmara inferior durante a configuração experimental. Para avaliar as proteínas secretadas do hospedeiro, use uma pinça estéril para remover cuidadosamente a inserção da membrana permeável. Em seguida, sem perturbar a monocamada de células, colete o meio da câmara inferior em tubos de 1,5 mililitro.

Centrifugar as amostras a 14 000 RCF e a quatro graus Celsius durante 10 minutos para produzir detritos celulares. Em seguida, remova tudo, exceto 50 microlitros do sobrenadante, transfira para um novo tubo de 1,5 mililitro e armazene a menos 20 graus Celsius ou use imediatamente. Para avaliação dos lisados das células hospedeiras, aspire suavemente o meio acima da monocamada sem perturbar as células hospedeiras.

Em seguida, use PBS para enxaguar as células uma vez. Aspire suavemente o PBS e aplique imediatamente um volume de tampão de lise gelado para atingir, por exemplo, uma concentração de proteína de 0,5 a 1,5 miligramas por mililitro. Em seguida, incube as amostras no gelo por 15 minutos.

Em seguida, use um raspador de células para separar as células da superfície da placa de cada poço e transfira todo o conteúdo de cada poço para um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugue as amostras a 14.000 RCF e quatro graus Celsius por 20 minutos. Para avaliar os componentes solúveis do lisestado, transfira o sobrenadante para um tubo novo e armazene a 20 graus Celsius negativos ou use imediatamente.

Para avaliar os componentes nucleares ou outros componentes insolúveis do lisado, reserve o pellet e armazene-o a menos 20 graus Celsius ou use imediatamente. Para avaliação por imagem de imunofluorescência, aspire o meio e use 1x PBS frio para lavar as células. Em seguida, com 4% de PFA e PBS, fixe as células durante a noite.

Realizar análises adicionais de acordo com o protocolo de texto. Os dados de western blot mostrados aqui demonstram ativação significativamente aumentada da MAP quinase p38 e queratinócitos na presença de estreptolisina S ou cepas de gás produtoras de SLS, indicando que este sistema pode ser usado para avaliar mudanças na ativação de proteínas de sinalização do hospedeiro independentes de contato. Nesta figura, a ativação dependente de SLS do principal mediador inflamatório fator nuclear - kappa B, que se transloca do citoplasma para o núcleo após a ativação, é mostrada, indicando que este sistema pode ser usado para visualizar os efeitos de fatores bacterianos secretados nas respostas proteicas do hospedeiro usando abordagens de microscopia de imunofluorescência.

Aqui, aumentos significativos na permeabilização da membrana e na liberação de LDH das células hospedeiras são demonstrados após a exposição a cepas de gás produtoras de SLS, em comparação com células não infectadas ou células expostas a uma cepa deficiente em SLS. Esses resultados indicam que esse sistema pode avaliar mudanças dependentes de toxinas na citotoxicidade do hospedeiro. Neste experimento, foram determinados os níveis de ATP nos queratinócitos e a resposta à infecção por gases.

16 horas após a infecção, foi observada uma redução significativa no ATP, e a perda de ATP foi mais pronunciada na presença de SLS, consistente com os aumentos dependentes de toxinas na sinalização e toxicidade da resposta ao estresse do hospedeiro. Uma vez estabelecida, essa técnica pode ser utilizada para estudar as respostas específicas de qualquer fator microbiano secretado em uma variedade de tipos de células hospedeiras. Ao executar este procedimento, é importante praticar a técnica estéril durante todas as etapas de configuração experimental e manter o manuseio cuidadoso das inserções de membrana permeável, tanto durante a configuração inicial quanto durante a coleta da amostra.

Após esse procedimento, métodos como western blotting, imagem de imunofluorescência e ensaios de permeabilização por membrana podem ser realizados, a fim de determinar como o fator bacteriano de interesse contribui para mudanças nas cascatas de sinalização e influencia a citotoxicidade geral durante a infecção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras de células hospedeiras para a avaliação de uma variedade de respostas de células hospedeiras após a exposição a um fator bacteriano secretado específico de interesse. Não se esqueça de que o manuseio de materiais de risco biológico, como patógenos bacterianos, requer certas considerações de segurança.

O uso adequado de óculos de segurança, luvas e jalecos, juntamente com o uso adequado de um capuz de biossegurança, é necessário para realizar esses experimentos com segurança.