ExCYT: Uma Interface gráfica do usuário para racionalizar a análise de dados de alta dimensão Cytometry
16 de janeiro de 2019
ExCYT é um baseado em MATLAB Graphical User Interface (GUI) que permite aos usuários analisar seus dados de citometria de fluxo via comumente empregadas técnicas de análise dos dados de alta dimensão incluindo redução de dimensionalidade através de t-PND, uma variedade de automático e manual fluxo de alta dimensão romance, heatmaps e métodos de clustering parcelas.
Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo biomédico, como a compreensão do fenótipo de subsébios biologicamente relevantes. A principal vantagem dessa técnica é que permite que um indivíduo sem experiência de programação analise seus dados de citometria com o que há de mais moderno em técnicas de alta dimensão. Para iniciar um pipeline de análise, selecione primeiro o tipo de citometria e o número de eventos para amostrar do arquivo.
Em seguida, clique em População de Portão, selecione as populações celulares de interesse e insira a porcentagem de eventos para análise a jusante. Em seguida, selecione o número de canais a serem usados para a análise na caixa de lista. Para a análise do Vizinho Estocástico distribuído por T, ou análise t-SNE, clique em t-SNE para começar a calcular o conjunto de dados de dimensionalidade reduzido.
Quando o conjunto tiver sido calculado, clique em Salvar a imagem TSNE e no menu pop-s t-SNE específico do marcador, selecione um marcador específico de interesse. Uma figura aparecerá mostrando uma representação do mapa de calor do enredo t-SNE que pode ser salvo para geração de figuras. Para iniciar a análise de clustering, selecione uma opção na lista Método de clustering e clique em Cluster.
Para classificar os clusters por um marcador de interesse, selecione a opção correspondente apropriada no menu pop-up Sort e clique em Ascender, Descendo, para atualizar a lista de clusters na lista Clusters. Para definir um valor mínimo de limite para um determinado cluster em um determinado canal, selecione uma opção no menu pop-up Threshold e defina um limite apropriado. Uma vez definido o limiar, clique em Adicionar acima do limiar ou adicionar abaixo do limiar, para especificar a direção do limiar e digitar um corte numérico na caixa Limiar de Frequência de Cluster, no painel Filtro de Cluster, para definir um limite mínimo para a frequência de um cluster.
Para selecionar clusters para posterior individualização de análise, selecione os clusters de interesse, na caixa de lista Clusters. E use o botão Selecionar, para mover as opções para a caixa de lista Cluster Analyze. Para criar mapas de calor dos clusters, selecione os clusters de interesse na caixa de lista Cluster Analyze e clique no botão HeatMap of Clusters.
Para criar um gráfico de caixa de alta dimensão, ou um gráfico de fluxo de alta dimensão, selecione os clusters de interesse na caixa de lista Cluster Analyze e clique em Gráfico de Caixa De alta dimensão, ou Gráfico de Fluxo de Alta Dimensão, para avaliar visualmente a distribuição de determinados canais de vários clusters em todas as dimensões. Para mostrar clusters em gráficos de fluxo 2D tradicionais, selecione a transformação e o canal apropriados no painel Plot de Fluxo Convencional e clique em Plot de Fluxo Convencional. Aqui, uma análise t-SNE representativa de mapas de calor para vários marcadores dentro de um pipeline de análise de painel mielóide, são mostrados.
Usando a rápida implementação gananciosa dentro do ExCYT para agrupar os dados com 100.000 dos vizinhos mais próximos, 19 subsu populações de células foram reveladas. A comparação dos mapas de calor originais com os clusters criados pela ExCYT permitiu que grupos semelhantes das células mielóides fossem identificados entre os dois grupos de dados. A análise do painel linfoide com uma abordagem hierárquica mais convencional e mais rápida, rendeu distribuições de marcadores semelhantes através de mapas de calor t-SNE.
Além disso, o agrupamento dos dados através de agrupamento hierárquico demonstrou agrupamentos semelhantes de células linfoides. Notavelmente, uma população de células T regulamentar única também foi identificada através de uma parcela de fluxo de alta dimensão. Para avaliar de forma rápida e quantitativa as co-associações entre os marcadores, primeiro um algoritmo de agrupamento de meios K rígido foi usado para estabelecer 5000 clusters nos dados t-SNE bidimensionais.
A expressão mediana de todos os marcadores de todos os clusters foi então utilizada, para criar um mapa de calor a partir desses clusters, permitindo que co-associações fossem facilmente identificadas, como a co-associação de Tim-3, PD-1, CD38 e 4-1BB. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de explorar os diferentes parâmetros, como diferentes métodos de agrupamento, para explorar completamente os dados que você está estudando.
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Visão Geral
ExCYT é uma interface gráfica baseada no MATLAB projetada para analisar dados de citometria de fluxo utilizando técnicas analíticas avançadas. Permite que usuários sem experiência em programação realizem redução de dimensionalidade, agrupamento e visualização de dados de alta dimensionalidade.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Citometria de Fluxo
- Análise de Dados
- Pesquisa Biomédica
Contexto
- A citometria de fluxo é essencial para analisar populações celulares.
- A análise de dados de alta dimensionalidade é fundamental para compreender sistemas biológicos complexos.
- O ExCYT simplifica o processo de análise para usuários não programadores.
- Técnicas de redução de dimensionalidade, como t-SNE, são vitais para visualizar dados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer uma interface amigável para a análise de dados de citometria de fluxo.
- Facilitar a compreensão de subpopulações biologicamente relevantes.
- Permitir que pesquisadores utilizem técnicas analíticas avançadas sem necessidade de habilidades em programação.
Métodos Utilizados
- Seleção do tipo de citometria e amostragem de eventos.
- Delimitação de populações celulares para análise.
- Utilização de t-SNE para redução de dimensionalidade.
- Criação de mapas de calor e gráficos de fluxo multidimensionais.
Resultados Principais
- O ExCYT permite a análise eficaz de dados complexos de citometria de fluxo.
- Os usuários podem visualizar e interpretar facilmente conjuntos de dados de alta dimensionalidade.
- A interface gráfica suporta métodos de agrupamento automatizados e manuais.
- Facilita a identificação de populações celulares relevantes.
Conclusões
- ExCYT é uma ferramenta poderosa para pesquisadores na área biomédica.
- Ele democratiza o acesso a técnicas avançadas de análise de dados.
- O software aprimora a compreensão dos fenótipos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
ExCYT aborda o desafio crescente de analisar dados citométricos de alta dimensão na descoberta de fármacos, fornecendo uma interface sem necessidade de programação para técnicas analíticas avançadas. Isso permite um acesso mais amplo aos fluxos de trabalho de triagem fenotípica e validação de alvos, reduzindo a dependência de especialistas em bioinformática e acelerando decisões na fase inicial de descoberta. A ferramenta apoia a desmistificação mecanicista ao facilitar a identificação objetiva de subpopulações biologicamente relevantes a partir de conjuntos de dados complexos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da exploração fenotípica imparcial da heterogeneidade celular.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao identificar e caracterizar populações celulares responsivas a fármacos sem viés de seleção manual.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao revelar padrões de coexpressão de pontos de controle imunológico e marcadores de ativação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, definindo agrupamentos fenotipicamente distintos utilizando t-SNE e agrupamento.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização de ensaios por meio da redução reprodutível de dimensionalidade e identificação de agrupamentos em arquivos FCS compensados e não compensados.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diversos painéis de imunologia e oncologia por meio de seleção flexível de canais e filtragem baseada em limiares.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a análise de sistemas relevantes para doenças ao associar marcadores (por exemplo, Tim-3, PD-1, CD38, 4-1BB) a fenótipos funcionais.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Facilita a validação pré-clínica mediante a visualização de gráficos de fluxo multidimensionais que revelam populações raras, como células T reguladoras.
- Progressão com Base em Avaliação de Riscos: Permite decisões quantitativas de avançar/não avançar com base em limiares de frequência de agrupamento e capacidades de classificação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
ExCYT insere-se no continuum de descoberta, desde a fase inicial de testes de hipóteses até a identificação de moléculas ativas, transformando dados brutos de citometria em informações fenotípicas acionáveis que orientam a seleção de alvos e a preparação para triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir o agrupamento objetivo de imunofenótipos a partir de painéis de alta dimensionalidade.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de visualização reprodutível com t-SNE e isolamento de agrupamentos para validação funcional subsequente.
- Análise de Dados: Fornece saídas quantitativas, incluindo mapas de calor, limiares de frequência de agrupamentos e gráficos de fluxo de alta dimensionalidade para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas ao trabalho pré-clínico ao identificar padrões de coexpressão de biomarcadores relevantes para a translação.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma analítica reutilizável em diversos projetos devido ao suporte a diferentes tipos de citometria e fluxos de trabalho supervisionados e não supervisionados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio de agrupamento não tendencioso.
- Valor Operacional: Melhora a padronização e escalabilidade por meio da automação orientada por interface gráfica (GUI) de fluxos de trabalho de t-SNE, agrupamento e seleção de populações.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao permitir acesso mais amplo da equipe a análises avançadas, reduzindo gargalos na interpretação de dados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer métricas quantitativas de agrupamento que orientam decisões de avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Exige familiaridade com o planejamento experimental de citometria e seleção de painéis de marcadores.
- Requer ambiente de execução MATLAB e acesso à infraestrutura de dados de arquivos FCS.
- Beneficia-se da padronização entre equipes em estratégias de gating e parâmetros de agrupamento para resultados reprodutíveis.
- Considerações para adaptação incluem ajustar a perplexidade do t-SNE e os limiares de agrupamento com base na complexidade do sistema biológico.
- Limitação prática: o desempenho pode variar com conjuntos de dados extremamente grandes (>1 milhão de eventos) sem amostragem posterior.
