Name: Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Aprenda a preparar amostras para citometria de massa com marcação de anticorpos consistente em populações celulares heterogêneas. Este método permite analisar identidade e sinalização celular em nível de célula única.

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O trabalho no laboratório Barton foi apoiado por uma doação do Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (CPRIT RP110471). Esta pesquisa foi apoiada, em parte, por uma bolsa de treinamento para Ryan L. McCarthy do Programa de Treinamento em Genética Molecular 5 T32 do National Institutes of Health CA009299. A instalação principal que mantém e executa a máquina de citometria de massa é apoiada pela concessão CPRIT (RP121010) e pela concessão principal do NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui apresentado tem sido empregue com sucesso para o tratamento de várias linhas de cultura de células (H1 e H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e amostras de tecido primárias (de medula óssea de ratinho, rato fígado embrionário, rato adulto fígado, tumor de rato). Independentemente da fonte, qualquer tecido que pode ser dissociado em células individuais, preservando o estado celular devem ser passíveis de análise por citometria de massa, mas pode requerer alguma optimização protocolo. É imp...

Citometria permite a medição simultânea de múltiplos alvos de anticorpos a um nel de cula ica em grandes populações de células. Em citometria de fluxo baseado em fluorescência tradicional, o número de parâmetros que podem ser quantificados é limitada pela sobreposição espectral entre o espectro de emissão de vários fluoróforos, que requer cálculos de compensação cada vez mais complexos, como o número de parâmetros aumenta. Estas limitações são abordados por massa citometria, onde anticorpos de metal-conjugado pesados ​​são detectadas e quantificadas por tempo de voo (TOF) espectrometria de massa para expandir o número de parâmetros recolhidos ao mesmo tempo e produzir um perfil de proteína de abundância alta dimensional para cada célula individual. Uma compreensão básica do funcionamento da massa citometria instrumento é benéfico para o usuário e pode ser essencial para solução de problemas. Para uma descrição mais completa do ajuste e executando uma máquina de citometria de massa,ver o manuscrito relacionados 1. Resumidamente, uma amostra celular é marcada com um painel de anticorpos conjugados de metal de segmentação marcadores da superfície celular, proteínas citoplasmáticas, proteínas nucleares, proteínas ligadas a cromatina ou outros epitopos de interesse (Figura 1-I). As células marcadas são carregados na máquina, quer uma de cada vez através de injecção manual ou usando um amostrador automático que amostras a partir de uma placa de 96 poços. As células carregadas foram injectados através de um nebulizador, a qual gera uma pulverização de gotículas de líquido que encapsulam as células (Figura 1ii). Esta pulverização é posicionado de modo que as células são ionizados por uma tocha de plasma de árgon. Este ionização gera uma nuvem de partículas formada por todos os átomos constituintes de cada uma das células (Figura 1iii). Como esta nuvem de partículas viaja para o detector, átomos de baixa massa atómica são separados dos iões de massa elevadas por um filtro de massa de quadrupolo. Os restantes iões de massa de alta continuar para o detector, onde o abunddade de cada isótopo é quantificado (Figura 1iv). Os dados brutos recolhidos pelo detector, são analisados ​​pelo software do instrumento de citometria de massa para identificar eventos celulares. Para cada evento celular identificado, o sinal detectado em cada canal é quantificado e guardada num ficheiro de saída um .fcs. Os canais de massa utilizados para detectar os anticorpos de metal pesado conjugados apresentam um mínimo de sobreposição espectral, que varia de 0-4%, com a maioria das contribuições abaixo de 1%. Devido a essa baixa diafonia entre canais, geralmente não é necessário para transformar os dados com uma matriz de compensação antes da análise 2. No entanto, deve ser tomado cuidado durante a concepção do painel experimental de anticorpos para assegurar que um anticorpo com um epitopo de alta abundância não é atribuído a um canal de massa que contribui sinal a um canal atribuído a um anticorpo de baixa abundância, pois isso pode criar uma população artificialmente elevados no canal de receber a contribuição de sinal. <p clburro = &quot;jove_content&quot;&gt; A preparação exacta de amostras para análise de citometria de massa é altamente dependente dos tipos de amostras a ser recolhidos e a hipótese experimental a ser testado. Nós fornecem exemplos de dois protocolos para a colheita de diferentes tipos de células (células estaminais embrionárias humanas) e células primárias (de ratinho de tumor da mama do isolado de células epiteliais). Ao começar um estudo de citometria de massa, é aconselhável primeiro fazer uma pequena experiência piloto para garantir que todos os protocolos e anticorpos a serem utilizados estão a trabalhar bem nas mãos do investigador. Isto é especialmente essencial quando estão a ser utilizados anticorpos costume conjugados, como a reacção de redução parcial durante a conjugação anticorpo tem o potencial de alterar a afinidade do anticorpo; portanto, cada anticorpo costume precisa ser validado empiricamente para garantir a precisão dos dados. Outras considerações incluem a determinação de se os anticorpos da superfície celular para ser usado no ensaio irá reconhecer os seus epitopos após fixação ou, se need para ser aplicado às células ao vivo. Alguns fixação pode evitar coloração adequada com anticorpos de superfície celular como é conhecida para ocorrer com o péptido-MHC de coloração 3, 4. Realizando a coloração de anticorpos de superfície celular em células vivas pode ser necessária para alguns anticorpos, mas este opõe-se a opção de código de barras de antes da marcação do anticorpo como a maioria dos métodos de códigos de barras são realizadas após a fixação 5, embora o código de barras à base de anticorpo 6, 7 é uma excepção. Ao determinar o número de células a ser preparados para análise, é importante saber que apenas uma fracção das células carregadas dentro da máquina será detectado e produzir dados. Esta perda é principalmente devido a ineficiências quando o nebulizador pulveriza a amostra a tocha. A perda exata cento depende da massa citometria de configuração da máquina e tipo de célula, mas pode variar de 50-85% e deve serconsiderado na concepção do experimento. Este protocolo foi optimizado para 2x10 6 culas por amostra mas pode ser adaptado para o processamento de tamanhos de amostras menores ou maiores. Este protocolo pode ser utilizado com modificações mínimas para tamanhos de amostra a partir de 1 x 10 6 4 x 10 6, no entanto, é crítico que o tamanho da amostra ser mantidos consistentes dentro de uma experiência. As alterações no número de células pode afectar a intensidade de código de barras e anticorpo coloração e deve ser mantido aproximadamente constante entre as amostras a serem comparadas directamente. Alguns procedimentos, tais como a rotulagem de células mortas e de marcao de ADN, deve ser levada a cabo na grande maioria, se não todos os modelos experimentais. A marcação das células mortas em experiências de análise de marcadores de superfície apenas pode ser conseguida utilizando Rh103, mas Rh103 deve ser evitado para experiências onde permeabilização é necessária, uma vez que resulta em perda de coloração. Para experiências envolvendo permeabilização, é aconselhável utilizar a cisplatina <s-se classe = &quot;refex&quot;&gt; 8 e, quando possível, um anticorpo que reconhece a PARP clivada ou caspase para detectar células apoptóticas e mortas. Amostras de código de barras pode reduzir o consumo de anticorpo, diminuir o tempo de aquisição e eliminar amostra-a-amostra variabilidade 9. O processo de barcoding envolve a aplicação de um código específico de amostra única para todas as células, que é usado para atribuir cada célula para sua amostra de origem. Depois de código de barras das amostras podem ser reunidas antes da coloração do anticorpo, um processo que assegura que todas as amostras são igualmente coradas. Para minimizar o erro experimental, é prudente de código de barras e reunir as amostras que estão a ser comparados directamente uns com os outros. Actualmente existem vários métodos para o código de barras de amostras para análise de citometria de massa 5, 6, 7, dois dos quais são aqui apresentados (ver abaixo). Com Reagen atualmente disponívelts é possível quantificar a abundância de 38 alvos de anticorpos, identificar as células na fase S 10, distinguir as células vivas e mortas 8 e medir os níveis celulares de hipoxia 11 numa experiência multiplexado de múltiplas amostras. Esta capacidade de recolher os dados de uma única célula elevado de parâmetros para as populações de células grandes permite uma melhor perfis de populações de células altamente heterogéneos e já produziu um número de novos conhecimentos biológicos 12, 13, 14, 15, 16. Destilando os dados complexo resultante à informação interpretável tem exigido o uso de algoritmos computacionais incluindo Spanning Tree Progressão da densidade normalizados Eventos (PÁ) 17 e vişne 18. Este artigo apresenta uma acessíveisvisão geral de como projetar e realizar uma massa citometria de experiência e introduz análise básica de massa citometria de dados.

<table><tbody><tr><td>Kit médio mTeSR1</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>05850</td><td>Aqueça à temperatura ambiente antes</td></tr><tr><td>de usar DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Quente a 37&nbsp; &deg; C antes de usar</td></tr><tr>tecnologias de <td>células-tronco</td><td>Accutase</td><td>07920</td><td>Quente a 37&nbsp; &deg; C antes do uso</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>fosfato tamponado salina</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Fornecido em 1&nbsp; ID de</td></tr><tr><td>célula mM Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>fornecido em 1&nbsp; ID de</td></tr><tr><td>célula mM Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>fornecido em 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cisplatina</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Solúvel a 25&nbsp; mg/mL em DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Solúvel para 74&nbsp; mg/mL em 0,2&nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Ródio 103 agente intercelante</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Resfrie a -20&nbsp; &deg; C antes</td></tr><tr><td>do uso Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubos de fundo redondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956; m tubos de tampa de filtro</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ quatro elementos contas de calibração</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase Tipo I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase de Clostridium histolyticum</td><td>Bisturi Descartável Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de amostras para análise mass citometria

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass citometria utiliza anticorpos conjugados com etiquetas de metal pesado, uma abordagem que aumentou muito o número de parâmetros e oportunidades para a análise profunda bem além do que é possível com fluxo baseado em fluorescência convencional citometria. Tal como acontece com qualquer nova tecnologia, há passos críticos que ajudam a garantir a geração confiável de dados de alta qualidade. Apresentada aqui é um protocolo optimizado que incorpora várias técnicas para o processamento de amostras de células para análise de citometria de massa. Os métodos descritos aqui vai ajudar o utilizador a evitar erros comuns e alcançar resultados consistentes, minimizando variabilidade, que pode levar a dados incorrectos. Para informar desenho experimental, a lógica subjacente a passos opcionais ou alternativos no protocolo e a sua eficácia na descoberta de novas descobertas na biologia do sistema a ser investigada é coberto. Finalmente, os dados representativo é apresentado para ilustrar os resultados esperados a partir da Presente técnicasd aqui.

O protocolo aqui apresentado pode ser amplamente aplicada a uma vasta variedade de amostras de células cultivadas e primárias, com apenas pequenas modificações. Dependendo dos requisitos de uma experiência, que pode ser realizada de uma maneira modular, quando certos elementos, tais como o código de barras ou de coloração da superfície celular, não são necessários. Utilizado na sua totalidade, este protocolo permite a preparação de massa multiplexado por citometria de amostras marcadas p...

Este artigo descreve a coleta e o processamento de amostras para análise de citometria de massa.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

O objetivo geral deste processo de preparação de amostras é produzir uma coloração de anticorpos robusta e consistente de diversas amostras para permitir a interrogação de populações de células heterogêneas. Este método pode ajudar a responder a perguntas sobre identidade celular, sinalização celular e resposta celular em uma população celular heterogênea complexa. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a medição de níveis de proteína de alto parâmetro no nível de célula única.Demonstrando este procedimento estará Aundrietta Duncan, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para cada amostra de suspensão de célula única, ressuspenda-a em quatro vezes 10 elevado a sexto por mililitro em meio livre de soro, adicione 500 microlitros de cisplatina 50 micromolar recém-preparada por 2/10 nas seis células e incube as amostras em um agitador orbital com mistura constante à temperatura ambiente. Após um minuto, tempere a cisplatina com um volume igual de tampão de lavagem e centrifugue as células.Descarte o sobrenadante e lave as amostras mais duas vezes adicionando 500 microlitros de tampão de lavagem, centrifugando as células e despejando o tampão de lavagem. Em seguida, duas lavagens em 500 microlitros de PBS, centrifugando as amostras e descartando o sobrenadante. Após a segunda lavagem com PBS, ressuspenda os pellets em 500 microlitros de PBS fresco e fixe as células com 500 microlitros de 4% de PFA.Pipete as células para misturar. Em seguida, colocar as amostras no agitador orbital com mistura constante durante 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, pulverizar as células por centrifugação, despejar o sobrenadante e, em seguida, lavar em PBS fresco.Para permeabilizar as células, gire as células novamente e descarte os sobrenadantes. Ressuspenda as amostras no PBS residual por vórtice suave e adicione imediatamente um mililitro de metanol a 100% por 2/10 10 às sextas células com pipetagem suave. Incubar as amostras a quatro graus durante pelo menos uma hora e, no final da incubação, centrifugar as células.Depois, despeje o metanol. Em seguida, lave os pellets em um mililitro de tampão de lavagem para cada mililitro de metanol, seguido por mais duas lavagens em 500 microlitros de tampão de lavagem fresco. Usando uma pipeta de 200 microlitros ajustada para 50 microlitros, transfira o tampão de lavagem restante de cada pellet para um tubo do coquetel de anticorpos correspondente apropriado.Pipete a solução combinada sem aspirar ar para a ponta, mantendo o êmbolo parcialmente pressionado. Em seguida, transfira a ponta da pipeta para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de tampão de lavagem sem soltar o êmbolo. Solte o êmbolo, levantando o tampão de lavagem para um volume total de coquetel de anticorpos de 50 microlitros e rotule a amostra correspondente apropriada com o coquetel de anticorpos aspirado por pipetagem suave.Após uma hora em temperatura ambiente com agitação constante, lave as amostras quatro vezes, despejando o tampão de lavagem a cada vez. Para rotular as células com irídio, ressuspenda os pellets finais em 500 microlitros de PBS, seguido pela adição de 500 microlitros de quatro por cento de PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 500 microlitros de irídio 62,5 nanomolar recém-preparado e PFA às amostras por mais 15 minutos de agitação à temperatura ambiente.Em seguida, centrifugue as células, despeje o sobrenadante e siga por duas lavagens em 500 microlitros de 0,1% de BSA e água deionizada filtrada. Analise as amostras adicionando grânulos de normalização nos poços das placas de amostra, pipetando células nesses poços e, em seguida, realizando citometria de massa em 24 horas. Após a normalização da intensidade do sinal, os grânulos de calibração podem ser removidos dos dados por gating na população negativa de grânulos positivos de irídio 191.Os eventos de célula única podem então ser bloqueados para remover os detritos e multipletos de células usando um gráfico biaxial de expressão negativa de irídio 193 versus o comprimento do evento. A marcação com cisplatina pode ser usada para medir a quantidade de profundidade celular. Por exemplo, aqui são mostradas amostras com quantidades baixas e maiores de células mortas.As células mortas podem ser removidas afastando a população positiva de platina 198, o código de barras resulta em uma separação distinta das amostras dentro dos parâmetros de código de barras, permitindo que as células sejam atribuídas às suas identidades de amostra originais. A marcação de UDI pode ser usada para detectar células faciais de US observadas aqui. Após a normalização inicial, de-barcoding e gating, os dados de alta dimensão podem ser analisados usando o algoritmo SPADE para gerar uma representação dimensional inferior dos dados que é mais passível de interpretação visual.Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída dentro de quatro a seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a perda de amostra ao fazer a etapa de lavagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras para análise de citometria de massa.Não se esqueça de que trabalhar com azida sódica pode ser perigoso, portanto, você deve tomar precauções como usar EPI adequado ao realizar este procedimento.

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Biologia

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Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

Este vídeo destaca um método proteômico de célula única que emprega anticorpos conjugados com metais pesados para código de barras de células distintas. Posteriormente, a imunocoloração e a citometria de massa são aplicadas para avaliar alterações fenotípicas e funcionais imunes em células imunes derivadas do sangue total humano.

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Aprenda a preparar amostras para citometria de massa com marcação de anticorpos consistente em populações celulares heterogêneas. Este método permite analisar identidade e sinalização celular em nível de célula única.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

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