Name: Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a técnica de imunohistoquímica para visualizar moléculas de ordenação de axônios em neurônios sensoriais olfativos de camundongos. Este método permite analisar padrões de expressão sem variação entre seções.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Mitsubishi, a Takeda Science Foundation, JST PRESTO e JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do comitê de ética de experimento animal na Universidade de Tóquio e de acordo com as diretrizes da Universidade de Tóquio para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. Preparação de soluções <ol><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato 0,01 M (PBS): adicionar um comprimido de PBS (NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, 0,010 M PO 4 3- , pH 7,4) a 1 L de água destilada e agitar à TA até dissolver completamente. </li><li> Preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS: adicionar 4 g de PFA a 100 mL de PBS. Mexa a solução a 60 ° C até dissolver completamente. <ol><li> Depois de dissolver o PFA em PBS, ajuste o pH da solução para 7,4 com hidróxido de sódio 1 N (NaOH). Em seguida, esfrie com gelo e filtre a solução através de um papel de filtro para remover qualquer matéria em partículas. Armazenar a 4 ° C. Cuidado: tome cuidado apropriado ao usar esses reagentes. Lidar comCom cuidado e use luvas, óculos de segurança e bata de laboratório sob um capô químico. NOTA: Use solução fresca de 4% de PFA preparada em 2 d. </li></ol></li><li> Preparar PBS 0,01 M suplementado com 0,3% de Triton X-100 (PBST): adicionar 3 mL de Triton X-100 a 997 mL de PBS. Agite a solução à temperatura ambiente até dissolver completamente. </li><li> Prepare solução de bloqueio de 1% e 5%: adicione 10 g de leite desnatado a 200 mL de PBST para preparar 5% de solução de bloqueio. Mexa à TA até dissolver completamente. Diluir 5% de solução de bloqueio cinco vezes com PBST para preparar 1% de solução de bloqueio. </li></ol> 2. Preparação de Secções OB Parasagittal <ol><li> Use animais entre 1-2 semanas de idade. Esses grupos etários são adequados para as seguintes experiências porque os glomérulos são claramente visíveis e o cérebro pode ser cortado com o crânio. </li><li> Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg / kg de peso corporal). Perfume o animal transcardialmente com 4% de gelo geladoFA em PBS. Manuseie com cuidado e use luvas, óculos de segurança e bata de laboratório sob uma capa química. </li><li> Após a perfusão, corte a cabeça com uma tesoura e remova cuidadosamente a pele. Em seguida, insira uma lâmina das tesouras no espaço entre os dentes superiores e inferiores e corte horizontalmente para remover a mandíbula inferior. Corte o excesso de tecido com fórceps e tesouras para deixar o tecido olfativo, incluindo OB e OE. NOTA: Não remova o crânio em torno do OB, pois isso retém o glomeruli medial alinhado verticalmente diretamente. </li><li> Mergulhe o tecido olfativo em PBS para remover o ar na cavidade nasal. Corte a parte posterior do cérebro verticalmente e coloque o tecido olfativo na parte inferior do molde de encaixe com o corte virado para baixo. Encha o molde com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) e, em seguida, mergulhe o molde em nitrogênio líquido. <ol><li> Depois que o tecido do composto estiver completamente congelado, incuba-o nos cryosTat a -20 ° C durante 1 h. </li></ol></li><li> Faça secções parasagittal em série (10 μm) do OB com um criostato e colecione-as, aderindo aos slides de vidro revestidos com MAS. Depois de adormecer, seque as lâminas imediatamente com um secador de cabelo. </li></ol> 3. Dia 1: Imunocoloração quádrupla das fatias OB <ol><li> Lave as lâminas por 5 minutos com PBS à TA. Repita 3 vezes. </li><li> Bloqueie os locais de ligação não específicos incubando as lâminas durante 1 h com a solução de bloqueio a 5% na RT. </li><li> Incube as lâminas O / N com um coquetel de anticorpos primários (400 μL cada slide) na solução de bloqueio de 1% na RT. Utilize os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-Kirrel2 de cobaia (1: 1000), anticorpo de cabra anti-Semaporin-7A (Sema7A) (1: 500), anticorpo anti-OL-protocadherina (OLPC) de rato (1: 500) E anticorpo anti-vesicular do transportador de glutamato do mouse2 (VGLUT2) anticorpo (1: 500). </li></ol> 4. Dia 2: Imunocoloração quádrupla do OBFatias <ol><li> Descarte a solução primária de anticorpo e lave as lâminas por 5 min com PBST à TA. Repita 3 vezes. </li><li> Incube as lâminas durante 1 h com um coquetel de anticorpos secundários (400 μL cada slide) em PBS à RT. Use os seguintes anticorpos secundários: Alexa Fluor 405 (1: 400) anti-mouse de burro, Alexa Fluor 488 (1: 400) e coxa de burro Alexa Fluor 555 (1: 400), burro anti-cobaya Alexa Fluor 555 (1: 400) e burro anti- Rato Alexa Fluor 647 (1: 400). NOTA: Todos os anticorpos secundários devem vir da mesma espécie hospedeira. Escolha um comprimento de onda diferente de fluorescência de anticorpos secundários para cada anticorpo primário para garantir que não haja sobreposição de comprimentos de onda. </li><li> Descarte a solução e lave as lâminas por 5 minutos com PBS à TA. Repita 3 vezes. </li><li> Montar lamínulas nas lâminas com o meio de montagem. Para isso, aplique 2 gotas do meio de montagem em cada slide e, em seguida, coloque uma lamínula removendo as bolhas de ar. </li></ol> 5. Intensity MeAsurações <ol><li> Obtenha imagens fluorescentes com um microscópio de fluorescência. Use os seguintes cubos de filtro: cubo de filtro DAPI (excitação de 360/40 nm, emissão de 460/50 nm e espelho dicroico de 400 nm) para os sinais Alexa Fluor 405, cubo de filtro GFP (470/40 nm de excitação, emissão de 525/50 nm, E espelho dicroico de 495 nm) para Alexa Fluor 488, cubo de filtro TRITC (excitação de 545/25 nm, emissão de 605/70 nm e espelho dicroico de 565 nm) para Alexa Fluor 555 e cubo de filtro Cy5 (excitação de 620/60 nm, 700 / Emissão de 75 nm e espelho dicroico de 600 nm) para Alexa Fluor 647. Nota: Ajuste o tempo de exposição para obter sinais fluorescentes da imagem sem saturação. </li><li> Define a estrutura glomerular por sinais de imunofluorescência de VGLUT2. Medir as intensidades de coloração das moléculas de classificação axônica dentro dos glomérulos com ImageJ. </li></ol> 6. Análise de dados <ol><li> Subtrair os sinais de fundo das intensidades de coloração das moléculas de classificação axônica. </li><li> Prepare thMatriz de dados de expressão e, que possui colunas compostas por moléculas e linhas de triagem de axônio compostas pelos glomérulos. </li><li> Execute uma análise de componente principal (PCA) usando o conjunto de dados de expressão preparado. Em seguida, obtenha as pontuações PCA, os índices de contribuição e as cargas fatoriais de cada componente principal. </li></ol>

<ol><li>Mori, K., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+olfactory+map+formed+and+interpreted+in+the+mammalian+brain%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?</a> Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).</li>
<li>Takeuchi, H., Sakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+map+formation+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural map formation in the mouse olfactory system.</a> Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+an+olfactory+sensory+map%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing an olfactory sensory map.</a> Cell. 87, 675-686 (1996).</li>
<li>Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contextual+model+for+axonal+sorting+into+glomeruli+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system.</a> Cell. 117, 817-831 (2004).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoallelic+expression+of+the+odourant+receptor+gene+and+axonal+projection+of+olfactory+sensory+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cell%22%5BJournal%5D)">Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones.</a> Genes Cell. 6, 71-78 (2001).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-independent+GPCR+activity+regulates+anterior-posterior+targeting+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons.</a> Cell. 154, 1314-1325 (2013).</li>
<li>Serizawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+identity+code+for+the+odorant+receptor-specific+and+activity-dependent+axon+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting.</a> Cell. 127, 1057-1069 (2006).</li>
<li>Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIG-2+mediates+olfactory+axon+convergence+to+target+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli.</a> Neuron. 57, 834-846 (2008).</li>
<li>Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+axon-sorting+molecules+in+mouse+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons.</a> Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).</li>
<li>Williams, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta+Protocadherin+10+is+Regulated+by+Activity+in+the+Mouse+Main+Olfactory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System.</a> Front Neural Circuits. 5, 9(2011).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

A imunotinção quádrupla das seções de parasagittal OB possibilitou a visualização e quantificação dos níveis de expressão de até quatro moléculas de triagem de axônio simultaneamente em um maior número de glomérulos. Ao analisar esses dados multivariáveis ​​com PCA, as características para a expressão dessas moléculas podem ser especuladas. Para a coloração bem sucedida, a preparação da amostra de tecido é extremamente importante. Alguns protocolos sugerem que os tecidos devem ser post-fixad...

Durante o desenvolvimento, os neurônios estão precisamente conectados uns aos outros para formar circuitos neurais adequados, o que é crítico para a função normal do cérebro. Uma vez que os circuitos neurais aberrantes no cérebro são pensados ​​para ser a causa de transtornos mentais, como autismo e esquizofrenia, a compreensão dos mecanismos de formação de circuitos neurais é um dos principais desafios no campo da neurociência. No sistema olfativo do mouse, cada Neurônio Sensorial Olfativo (OSN) no Epitelio Olfatório (OE) expressa apenas um gene funcional do Receptor Olfativo (OR) e OSNs expressando o mesmo OR convergem seus axônios para um par específico de glomérulos em locais estereotipados no Bulbo Olfativo (OB) 1 , 2 . O sistema olfativo do mouse é um excelente modelo de sistema para estudar os mecanismos moleculares da formação de circuitos neurais porque os pesquisadores podem utilizar a expressão OR para identificar um específico sUbtype de OSNs e visualizar os sites de projeção de axônios de OSN como estruturas glomerulares claras. Uma característica notável da projeção OSN é que as RUP desempenham papéis instrutivos na projeção de axônios OSN para o OB 3 , 4 , 5 , 6 . Mais especificamente, após os axônios do OSN serem orientados para aproximar as regiões alvo, eles são segregados para formar glomérulos de forma dependente de OR. Estudos anteriores mostraram que as moléculas de OR controlam a expressão de moléculas de triagem de axônio, que regulam a segregação glomerular 7 , 8 . Além disso, as evidências acumuladas sugerem que as moléculas de OR geram o código de identidade neuronal por uma combinação única de moléculas de classificação axônica 9 . Assim, para entender o mecanismo de segregação glomerular dependente de OR, é necessário caracterizar os perfis de expressão do mol de ordenação axônicaEcules em OSNs. A imunocoloração fluorescente é um método comum para visualizar a expressão de genes específicos. Uma vez que as proteínas das moléculas de triagem axônica estão predominantemente localizadas em axônios OSN, os pesquisadores precisam usar seções OB para caracterizar seus padrões de expressão em OSNs. O corte coronal do OB foi rotineiramente utilizado para imunomarcação. No entanto, esta preparação perde a informação topográfica ao longo do eixo anterior-posterior na mesma seção de OB. Desta forma, desenvolvemos uma preparação parasagital do lado medial do OB, que pode montar tantos glomerulis circundantes quanto possível na mesma seção de OB. Combinado com imunomarcação com múltiplos anticorpos, esta preparação permite a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de triagem de axônio sem variação de coloração entre seções de OB. Além disso, um método de coloração imuno-histoquimica foi apresentado sem pós-fixação com PFA aE tratamento de sacarose. Este método permite aos pesquisadores obter dados suficientes de coloração de alta qualidade para análise de dados multivariáveis. Os protocolos aqui apresentados fornecerão detalhes de métodos poderosos para pesquisadores que estudam a formação de circuitos neurais olfativos.

<table><tbody><tr><td>Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH7.4</td><td>TAKARA BIO</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado</td><td>nacalai tesque</td><td>31149-75</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Sema7A de cabra</td><td>R & D Systems</td><td>AF2068</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-OLPC de rato</td><td>Merck Millipore</td><td>MABT20</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-VGLUT2 de camundongo</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5504</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-BIG-2 de cabra</td><td>R & D Systems</td><td>AF2205</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Kirrel2 para porcos da Operon</td><td>Biotechnologies</td><td></td><td>Os anticorpos anti-Kirrel2 foram gerados pela imunização de porquinhos-da-índia com peptídeos sintéticos conjugados com KLH (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP</td></tr><tr><td>burro anti-rato Alexa Fluor 405</td><td>Abcam</td><td>ab175658</td><td></td></tr><tr><td>burro anti-cabra Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-545-003</td><td></td></tr><tr><td>burro anti-cobaia Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>burro anti-rato Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td> <td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>MAS revestiu os vidros de lâmina</td><td>MATSUNAMI</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>fórceps</td> Tesoura de mola <td>Fine Science Tools</td><td>11253-27</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td> Tesoura de dissecação <td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescente</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro DAPI</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87762</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro GFP</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87763</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro TRITC</td><td>KEYENCE</td><td>OP-87764</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro</td><td>Cy5 KEYENCE</td><td>OP-87766</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro</td><td>ADVANTEC</td><td>00011185</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>M71484</td><td></td></tr></tbody></table>

imunossinção quadruple da lâmpada olfativa para visualização de códigos de identidade molecular de axon sensorial olfativo

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

O sistema olfativo do mouse é freqüentemente usado para estudar mecanismos de formação de circuitos neurais devido à sua estrutura anatômica simples. Um Neurônio Sensorial Olfatório (OSN) é uma célula bipolar com um único dendrito e um único axônio não derivado. Um OSN expressa apenas um gene de receptor olfatório (OR), OSNs que expressam um determinado tipo de OR convergem seus axônios para alguns conjuntos de glomérulos invariantes no bulbo olfatório (OB). Uma característica notável da projeção de OSN é que as OU expressadas desempenham papéis instrutivos na projeção axonal. As ORs regulam a expressão de múltiplas moléculas de classificação axônica e geram o código molecular combinatório de moléculas de classificação de axônio no terminal axônico OSN. Assim, para entender os mecanismos moleculares dos mecanismos de orientação axônica OR específicos, é vital caracterizar seus perfis de expressão no terminal axônico OSN dentro do mesmo glomérulo. O objetivo deste artigo foi introduzir métodos para coletar tantos glomeruli como possiblE em uma única seção de OB e para realizar imunocoloração usando múltiplos anticorpos. Isso permitiria a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de classificação de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.

O mapa glomerular olfatório é formado por alvos globais iniciais e subseqüente segregação glomerular dos axônios 1 , 2 do OSN. A segregação glomerular é regulada pelas interações axônicas adesivas / repulsivas mediadas por moléculas de classificação de axônio cujos níveis de expressão são determinados por moléculas OR expressas 7 . As moléculas de classificação axônica envolvidas na segregação glomerular s...

Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.

Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

O objetivo geral deste método de coloração imunohistoquímica é visualizar a expressão combinada de moléculas de ordenação de axônios nos terminais axonais de neurônios sensoriais olfativos. Este método pode auxiliar na caracterização de processos fundamentais na área do desenvolvimento olfativo, como o direcionamento axonal, formação de sinapses e a regeneração de neurônios sensoriais olfativos. A principal vantagem desta técnica é que ela permite aos cientistas comparar e analisar os padrões de expressão de moléculas de ordenação axonal no bulbo olfativo sem sofrer variações entre cortes.A demonstração visual deste método é essencial, pois a etapa de inclusão é difícil de aprender, já que a posição e o ângulo da amostra de tecido olfativo no molde são difíceis de descrever com palavras. Comece com cabeças de camundongos com idade entre uma e duas semanas que foram fixadas por perfusão intracardíaca com paraformaldeído 4%. Insira a lâmina da tesoura no espaço entre os dentes superiores e inferiores e corte horizontalmente para remover o maxilar inferior.Em seguida, retire os tecidos excedentes com pinça e tesoura, deixando apenas o tecido olfatório, incluindo o bulbo olfatório e o

quadruple-immunostaining-olfactory-bulb-for-visualization-olfactory

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Nós apresentamos uma técnica lentiviral para a manipulação genética e visualização de axônio único neurônio olfactory sensoriais e sua arborização...

Lentivírus mediada Manipulação Genética e Visualização de Olfactory neurônios sensoriais In vivo</em

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Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

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Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

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Aqui descrevemos um protocolo para medir e analisar as respostas de temperatura no bulbo olfatório de Xenopus laevis. Os neurônios receptores olfatórios e as células mitrais são corados diferencialmente, após o que as alterações de cálcio são registradas, refletindo uma sensibilidade de algumas redes neurais no bulbo às quedas de temperatura induzidas no nariz.

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Xenopus girinos oferecem uma plataforma única para investigar a função do sistema nervoso em vivo. Descrevemos as metodologias para avaliar o processamento das informações olfativas em vida Xenopus larvas em condições normais de criação ou após lesão.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

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Um sistema de explant para estudos de imagem de lapso de tempo da montagem do circuito olfativo em Drosophila

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Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

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