Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo

Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.

O objetivo geral deste método de coloração imuno-histoquímica é visualizar a expressão combinada de moléculas de classificação de axônios nos terminais axônicos dos neurônios sensoriais olfativos. Este método pode ajudar a caracterizar processos-chave no campo do desenvolvimento olfativo, como orientação de axônios, formações de sinapses e regeneração de neurônios sensoriais olfativos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que os cientistas comparem e analisem os padrões de expressão das moléculas de classificação de axônios no bulbo olfatório sem sustentar variação entre as seções.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a etapa de incorporação é difícil de aprender, porque a posição e o ângulo da amostra de tecidos olfativos no molde são difíceis de descrever em palavras. Comece com cabeças de camundongos de uma a duas semanas de idade que foram fixadas por perfusão intracardíaca de paraformaldeído a 4%. Insira uma lâmina de tesoura no espaço entre os dentes superiores e inferiores e corte horizontalmente para remover o maxilar inferior.

Em seguida, corte o excesso de tecido com uma pinça e uma tesoura, para deixar o tecido olfatório, incluindo o bulbo olfatório e o epitélio olfatório. Mergulhe o tecido olfatório em PBS para remover o ar da cavidade nasal, depois faça um corte vertical para remover a parte posterior do cérebro e coloque o tecido olfatório na parte inferior de um molde de incorporação com a extremidade cortada voltada para baixo. Encha o molde com composto de temperatura de corte ideal e, em seguida, mergulhe em nitrogênio líquido.

Depois que o tecido e a OCT estiverem completamente congelados, equilibre o tecido no criostato a 20 graus Celsius por uma hora. Agora faça seções parassagitais seriais do bulbo olfatório com o criostato e colete-as colando em lâminas de vidro revestidas com MAS. Após a colagem, seque as lâminas imediatamente com um secador de cabelo.

Comece a imunocoloração lavando as lâminas secas com PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Bloqueie locais de ligação inespecíficos incubando as lâminas por uma hora com solução de bloqueio a 5% à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 400 microlitros de um coquetel de anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio a 1% em cada lâmina.

Incube as lâminas durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, descarte a solução primária de anticorpos e lave as lâminas com PBST três vezes por cinco minutos cada em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 400 microlitros de um coquetel de anticorpos secundários e PBS a cada lâmina.

Proteger da luz e incubar durante uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação, descarte a solução e lave novamente as lâminas três vezes por cinco minutos cada com PBS em temperatura ambiente. Por fim, monte as lamínulas nas lâminas aplicando duas gotas de meio de montagem em cada lâmina, colocando a lamínula e removendo as bolhas de ar.

Obtenha imagens fluorescentes com o microscópio de fluorescência usando o filtro apropriado para cada fluoróforo. Ajuste o tempo de exposição para obter sinais fluorescentes da imagem sem saturação. Definir a estrutura glomerular por sinais imunofluorescentes de GLUT2.

Use a imagem J para medir as intensidades de coloração das moléculas de classificação de axônios dentro dos glomérulos. Esta imagem mostra uma seção de bulbo olfatório parasagital de um camundongo de duas semanas de idade imunocorado com anticorpos contra VGLUT2, Kirrel2 mostrado em vermelho, Semaforin 7A mostrado em verde e OLPC em azul. A imagem mesclada demonstra que as moléculas de classificação do axônio envolvidas na segregação glomerular são expressas em um padrão de mosaico independente da posição.

Cada glomérulo é definido por sinais fluorescentes do marcador pré-sináptico VGLUT2. As estruturas glomerulares são circundadas por linhas tracejadas. As intensidades de sinal das moléculas de classificação de axônios foram medidas em cada glomérulo.

Como visto aqui, as moléculas de classificação de axônios são expressas diferencialmente em cada glomérulo. Por exemplo, glomérulo 3 tem altos níveis de OLPC, níveis intermediários de Semaforina 7A e níveis mais baixos de Kirrel2, e essa diferença pode ser quantificada medindo a intensidade da coloração. Considerando que glomérulo 4 tem altos níveis de OLPC e níveis mais baixos de Kirrel2 e Semaforina 7A.

Novamente, essa diferença pode ser quantificada medindo a intensidade da coloração. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de omitir a pós-fixação com PFA e o tratamento com solução de sacarose, que normalmente são recomendados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colocar mais glomérulos na seção do bulbo olfatório único e como realizar imunocoloração de alta qualidade com vários anticorpos, que podem ser aplicados a outras áreas do cérebro.

Não se esqueça de esperar, este método irá ajudá-lo a ter sucesso em seus experimentos futuros.