Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

O objetivo geral deste procedimento é criar uma matriz modular de proteínas que não exija uma etapa de purificação, tornando-a compatível com qualquer biblioteca de proteínas. Isso é feito primeiro gerando genes sintéticos por meio de PCR de montagem. Em seguida, os genes sintéticos são dispostos em lâminas de epóxi.

Para fabricar o dispositivo microfluídico, use PDMS com controle de silicone e moldes de fluxo. Em seguida, o dispositivo microfluídico é alinhado à matriz de DNA manchado. Finalmente, o lisado de reticulócitos de coelho é fluído para o dispositivo microfluídico e as proteínas são expressas.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão de milhares de proteínas por meio da marcação de anticorpos fluorescentes. Existem várias vantagens em usar a técnica baseada em microfluídica em relação aos métodos existentes, como microarrays de proteínas. Nós microarray DNA e depois usamos cellis para fazer proteínas no dispositivo.

Assim, não necessitamos de purificação de proteínas e as proteínas nunca secam. Eles permanecem frescos durante todo o experimento. A técnica microfluídica também fornece maior sensibilidade Para fabricar o dispositivo microfluídico, exponha o controle de silicone e os moldes de fluxo ao vapor de cloro trimetil sileno por 10 minutos para promover a liberação de elastômero.

Após as etapas de cozimento, prepare uma mistura de elastômero à base de silicone e agente de cura em duas proporções diferentes de cinco para um e 20 para um para os moldes de controle e fluxo, respectivamente. Despeje o PDMS de cinco para um na camada de controle. Desgaseifique a camada de controle e asse por 30 minutos a 80 graus Celsius.

Em seguida, gire a mistura de 20 a um PDMS na camada de fluxo a 2.600 RPM por 60 segundos e, em seguida, asse a 80 graus Celsius por 30 minutos. Separe lentamente a camada de controle do molde, tomando cuidado para não descascar o padrão SU oito. Em seguida, usando um bisturi, corte o dispositivo em todo o seu perímetro e use uma agulha cega para fazer furos para acessar os canais de controle sob um microscópio.

Alinhe manualmente as camadas de fluxo e controle começando com o canto superior esquerdo e posicionando a válvula de botão na camada de controle no meio da câmara de reação. Em seguida, alinhe a primeira linha e solte suavemente a camada de controle linha por linha. Certifique-se de que todas as válvulas botão estejam no meio das câmaras de reação e que as válvulas de endereço e entrada cruzem os canais de fluxo na posição correta.

Repita o processo localmente até que todas as linhas estejam alinhadas. Quando estiver totalmente alinhado, libere qualquer tensão no PDMS levantando-o cuidadosamente pelas laterais e cantos. Em seguida, asse o dispositivo por duas horas a 80 graus Celsius após o cozimento.

Corte ao redor do perímetro e descasque o dispositivo de duas camadas dos orifícios de perfuração do molde de fluxo para acessar os canais de fluxo para gerar construções de DNA para o dispositivo. Realize PCR para produzir genes sintéticos compostos por um promotor T sete, um sítio de ligação ao ribossomo, um quadro de leitura aberto com diferentes tags de epítopos em cada extremidade e um terminador T sete. Para preparar os genes sintéticos para a disposição, faça uma mistura de polietilenoglicol e D triose di-hidratada Dispense dois microlitros por reação nos poços de um 384.

Placa de poço. Adicione os genes sintéticos em uma placa de 384 poços. Em seguida, adicione água destilada a um volume final de 20 microlitros.

Em seguida, usando um ponto de microarray, uma série de genes sintéticos em substratos de vidro revestidos com epóxi. Sob um estereoscópio, alinhe manualmente o dispositivo microfluídico ao arranjo de genes com o ponto de DNA posicionado no meio das câmaras de DNA. Em seguida, alinhe o resto das linhas.

Terminando com o ajuste fino de todo o dispositivo para aliviar qualquer estresse no PDMS e garantir que ele se ligue bem ao microarray. Levante-o localmente. Por fim, cole o dispositivo à lâmina de vidro incubando-o durante a noite em uma placa quente a 80 graus Celsius.

Os corantes alimentares são usados nesta seção para fins de visualização. As válvulas na camada de controle são acionadas a partir do computador usando a visualização de laboratório. O script de visualização de laboratório controla uma série de microválvulas solenoides por meio de uma caixa de controle eletrônico.

O coletor da válvula solenóide é conectado ao ar comprimido, que controla o fluxo de ar e a pressão nas válvulas de controle do dispositivo. Usando um tubo de plástico flexível com diâmetro interno de 0.02 polegadas e um pino de aço inoxidável, conecte o dispositivo ao coletor das válvulas solenóides. Encha os tubos com água bidestilada e insira o pino nos orifícios de acesso da camada de controle.

Certifique-se de que cada tubo esteja conectado ao canal de controle correspondente. Para ativar os canais de controle, execute o laboratório view aplicativo, defina a pressão do ar para cinco PS. Em seguida, aplico pressão de ar ativando a válvula a partir do script de visualização de laboratório. Isso empurrará a água para os canais de controle do PDMS para identificar possíveis diafonias entre os canais de controle de dispositivos defeituosos.

Encha primeiro o sanduíche e as válvulas de endereço. Afinal, os canais de controle e as válvulas estão cheios de água, prepare as válvulas para bloquear os canais de fluxo embaixo delas. Aumentando primeiro a pressão do ar para 15 PSI e, em seguida, no programa de visualização de laboratório por meio de um conjunto de interruptores liga/desliga conectados a válvulas solenóides individuais.

Ative todas as válvulas ligando todos os botões do interruptor para garantir que todas as válvulas estejam abertas. Conecte um tubo a uma das entradas de fluxo e, com quatro a cinco PSI, flua ar para o dispositivo. Isso liberará todas as válvulas pegajosas da corrediça de vidro.

O dispositivo agora está preparado e pronto para fins de visualização. O corante alimentar amarelo é usado para visualizar os reagentes nesta seção e a solução incolor representa os hippies para facilitar a automontagem de uma matriz de proteínas na superfície e evitar a absorção não específica dentro do dispositivo microfluídico, modificar quimicamente a superfície conectando primeiro um novo tubo com a solução necessária a um dos canais de fluxo no dispositivo. Em seguida, conecte o lado livre do tubo ao coletor manual e abra o fluxo de pressão de ar.

Carregue 40 microlitros de BSA exultante de biotina em um novo tubo e flua aproximadamente metade dele pelo dispositivo por 20 minutos. Use hippies de 50 milimolares para lavar qualquer substrato não reativo entre cada uma das etapas. Em seguida, flua 25 microlitros de estreptavidina por 20 minutos.

Em cima da biotina exaltada BSA lave com hees por cinco minutos para comer a superfície ao redor do botão, feche a válvula do botão e flua o resto do BSA biotinilado e, em seguida, lave com a ervilha novamente por cinco minutos. Finalmente, para criar uma matriz de etiquetas anti-chiado sob o botão, solte a válvula do botão e flua 30 microlitros de biotina Penta por 20 minutos para criar uma matriz de proteínas no dispositivo. Abra as válvulas do pescoço e flua reticulócito de coelho.

Solução de reação de transcrição e tradução de acoplamento rápido através do dispositivo para a câmara de DNA. Em seguida, feche as válvulas sanduíche para separar cada gene de seu ambiente e incube o dispositivo em uma placa quente por 2,5 horas a 30 graus Celsius. Em seguida, rotule o terminal final das proteínas com o anticorpo C mix SI três.

Finalmente, usando um scanner de microarray com um laser de 532 nanômetros e um filtro de emissão de 575 nanômetros. Determine os níveis de proteína. Esta figura mostra os níveis variáveis de expressão de proteínas em uma matriz de proteínas.

Normalmente, 20% de uma biblioteca de genes não consegue se expressar em níveis detectáveis. Os níveis de fundo foram determinados usando câmaras que não foram manchadas com DNA. Assim, os sinais das câmaras de proteínas correspondentes são devidos ao ruído ou à absorção não específica dos anticorpos de marcação.

Se for realizada corretamente, a verificação do dispositivo leva quatro horas e o experimento com chip leva cinco horas.