Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica
23 de agosto de 2012
Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.
O objetivo geral deste procedimento é criar uma matriz modular de proteínas que não exija uma etapa de purificação, tornando-a compatível com qualquer biblioteca de proteínas. Isso é feito primeiro gerando genes sintéticos por meio de PCR de montagem. Em seguida, os genes sintéticos são dispostos em lâminas de epóxi.
Para fabricar o dispositivo microfluídico, use PDMS com controle de silicone e moldes de fluxo. Em seguida, o dispositivo microfluídico é alinhado à matriz de DNA manchado. Finalmente, o lisado de reticulócitos de coelho é fluído para o dispositivo microfluídico e as proteínas são expressas.
Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão de milhares de proteínas por meio da marcação de anticorpos fluorescentes. Existem várias vantagens em usar a técnica baseada em microfluídica em relação aos métodos existentes, como microarrays de proteínas. Nós microarray DNA e depois usamos cellis para fazer proteínas no dispositivo.
Assim, não necessitamos de purificação de proteínas e as proteínas nunca secam. Eles permanecem frescos durante todo o experimento. A técnica microfluídica também fornece maior sensibilidade Para fabricar o dispositivo microfluídico, exponha o controle de silicone e os moldes de fluxo ao vapor de cloro trimetil sileno por 10 minutos para promover a liberação de elastômero.
Após as etapas de cozimento, prepare uma mistura de elastômero à base de silicone e agente de cura em duas proporções diferentes de cinco para um e 20 para um para os moldes de controle e fluxo, respectivamente. Despeje o PDMS de cinco para um na camada de controle. Desgaseifique a camada de controle e asse por 30 minutos a 80 graus Celsius.
Em seguida, gire a mistura de 20 a um PDMS na camada de fluxo a 2.600 RPM por 60 segundos e, em seguida, asse a 80 graus Celsius por 30 minutos. Separe lentamente a camada de controle do molde, tomando cuidado para não descascar o padrão SU oito. Em seguida, usando um bisturi, corte o dispositivo em todo o seu perímetro e use uma agulha cega para fazer furos para acessar os canais de controle sob um microscópio.
Alinhe manualmente as camadas de fluxo e controle começando com o canto superior esquerdo e posicionando a válvula de botão na camada de controle no meio da câmara de reação. Em seguida, alinhe a primeira linha e solte suavemente a camada de controle linha por linha. Certifique-se de que todas as válvulas botão estejam no meio das câmaras de reação e que as válvulas de endereço e entrada cruzem os canais de fluxo na posição correta.
Repita o processo localmente até que todas as linhas estejam alinhadas. Quando estiver totalmente alinhado, libere qualquer tensão no PDMS levantando-o cuidadosamente pelas laterais e cantos. Em seguida, asse o dispositivo por duas horas a 80 graus Celsius após o cozimento.
Corte ao redor do perímetro e descasque o dispositivo de duas camadas dos orifícios de perfuração do molde de fluxo para acessar os canais de fluxo para gerar construções de DNA para o dispositivo. Realize PCR para produzir genes sintéticos compostos por um promotor T sete, um sítio de ligação ao ribossomo, um quadro de leitura aberto com diferentes tags de epítopos em cada extremidade e um terminador T sete. Para preparar os genes sintéticos para a disposição, faça uma mistura de polietilenoglicol e D triose di-hidratada Dispense dois microlitros por reação nos poços de um 384.
Placa de poço. Adicione os genes sintéticos em uma placa de 384 poços. Em seguida, adicione água destilada a um volume final de 20 microlitros.
Em seguida, usando um ponto de microarray, uma série de genes sintéticos em substratos de vidro revestidos com epóxi. Sob um estereoscópio, alinhe manualmente o dispositivo microfluídico ao arranjo de genes com o ponto de DNA posicionado no meio das câmaras de DNA. Em seguida, alinhe o resto das linhas.
Terminando com o ajuste fino de todo o dispositivo para aliviar qualquer estresse no PDMS e garantir que ele se ligue bem ao microarray. Levante-o localmente. Por fim, cole o dispositivo à lâmina de vidro incubando-o durante a noite em uma placa quente a 80 graus Celsius.
Os corantes alimentares são usados nesta seção para fins de visualização. As válvulas na camada de controle são acionadas a partir do computador usando a visualização de laboratório. O script de visualização de laboratório controla uma série de microválvulas solenoides por meio de uma caixa de controle eletrônico.
O coletor da válvula solenóide é conectado ao ar comprimido, que controla o fluxo de ar e a pressão nas válvulas de controle do dispositivo. Usando um tubo de plástico flexível com diâmetro interno de 0.02 polegadas e um pino de aço inoxidável, conecte o dispositivo ao coletor das válvulas solenóides. Encha os tubos com água bidestilada e insira o pino nos orifícios de acesso da camada de controle.
Certifique-se de que cada tubo esteja conectado ao canal de controle correspondente. Para ativar os canais de controle, execute o laboratório view aplicativo, defina a pressão do ar para cinco PS. Em seguida, aplico pressão de ar ativando a válvula a partir do script de visualização de laboratório. Isso empurrará a água para os canais de controle do PDMS para identificar possíveis diafonias entre os canais de controle de dispositivos defeituosos.
Encha primeiro o sanduíche e as válvulas de endereço. Afinal, os canais de controle e as válvulas estão cheios de água, prepare as válvulas para bloquear os canais de fluxo embaixo delas. Aumentando primeiro a pressão do ar para 15 PSI e, em seguida, no programa de visualização de laboratório por meio de um conjunto de interruptores liga/desliga conectados a válvulas solenóides individuais.
Ative todas as válvulas ligando todos os botões do interruptor para garantir que todas as válvulas estejam abertas. Conecte um tubo a uma das entradas de fluxo e, com quatro a cinco PSI, flua ar para o dispositivo. Isso liberará todas as válvulas pegajosas da corrediça de vidro.
O dispositivo agora está preparado e pronto para fins de visualização. O corante alimentar amarelo é usado para visualizar os reagentes nesta seção e a solução incolor representa os hippies para facilitar a automontagem de uma matriz de proteínas na superfície e evitar a absorção não específica dentro do dispositivo microfluídico, modificar quimicamente a superfície conectando primeiro um novo tubo com a solução necessária a um dos canais de fluxo no dispositivo. Em seguida, conecte o lado livre do tubo ao coletor manual e abra o fluxo de pressão de ar.
Carregue 40 microlitros de BSA exultante de biotina em um novo tubo e flua aproximadamente metade dele pelo dispositivo por 20 minutos. Use hippies de 50 milimolares para lavar qualquer substrato não reativo entre cada uma das etapas. Em seguida, flua 25 microlitros de estreptavidina por 20 minutos.
Em cima da biotina exaltada BSA lave com hees por cinco minutos para comer a superfície ao redor do botão, feche a válvula do botão e flua o resto do BSA biotinilado e, em seguida, lave com a ervilha novamente por cinco minutos. Finalmente, para criar uma matriz de etiquetas anti-chiado sob o botão, solte a válvula do botão e flua 30 microlitros de biotina Penta por 20 minutos para criar uma matriz de proteínas no dispositivo. Abra as válvulas do pescoço e flua reticulócito de coelho.
Solução de reação de transcrição e tradução de acoplamento rápido através do dispositivo para a câmara de DNA. Em seguida, feche as válvulas sanduíche para separar cada gene de seu ambiente e incube o dispositivo em uma placa quente por 2,5 horas a 30 graus Celsius. Em seguida, rotule o terminal final das proteínas com o anticorpo C mix SI três.
Finalmente, usando um scanner de microarray com um laser de 532 nanômetros e um filtro de emissão de 575 nanômetros. Determine os níveis de proteína. Esta figura mostra os níveis variáveis de expressão de proteínas em uma matriz de proteínas.
Normalmente, 20% de uma biblioteca de genes não consegue se expressar em níveis detectáveis. Os níveis de fundo foram determinados usando câmaras que não foram manchadas com DNA. Assim, os sinais das câmaras de proteínas correspondentes são devidos ao ruído ou à absorção não específica dos anticorpos de marcação.
Se for realizada corretamente, a verificação do dispositivo leva quatro horas e o experimento com chip leva cinco horas.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma abordagem microfluídica para a expressão de matrizes de proteínas, utilizando um dispositivo com milhares de câmaras de reação controladas por válvulas micromecânicas. A integração de uma biblioteca de genes impressa em microarray permite a transcrição e tradução no chip, resultando em uma matriz de proteínas pronta para uso.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microfluidics
- Expressão de Proteínas
- Bibliotecas de Genes
Fundamentos
- Matrizes de proteínas são essenciais para vários ensaios biológicos.
- Métodos tradicionais frequentemente requerem etapas de purificação, limitando a compatibilidade.
- Dispositivos microfluídicos podem simplificar o processo de expressão de proteínas.
- PCR de montagem é usado para gerar genes sintéticos para a matriz.
Objetivo do Estudo
- Criar uma matriz de proteínas modular sem etapas de purificação.
- Melhorar a compatibilidade com qualquer biblioteca de proteínas.
- Aumentar a eficiência da expressão de proteínas usando microfluídica.
Métodos Utilizados
- Geração de genes sintéticos através de PCR de montagem.
- Montagem de genes sintéticos em lâminas de epóxi.
- Fabricação de um dispositivo microfluídico usando PDMS.
- Fluxo de lisado de reticulócitos de coelho no dispositivo para expressão de proteínas.
Principais Resultados
- Um dispositivo microfluídico funcional foi criado com sucesso.
- As proteínas foram expressas no chip sem purificação.
- O método demonstrou compatibilidade com várias bibliotecas de proteínas.
- A transcrição e tradução no chip foram efetivamente alcançadas.
Conclusões
- Esta abordagem microfluídica simplifica a criação de matrizes de proteínas.
- Elimina a necessidade de purificação, melhorando a usabilidade.
- A técnica pode ser aplicada a diversas bibliotecas de proteínas para pesquisa.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This microfluidic protein expression platform enables high-throughput generation of functional protein arrays without purification, addressing a key bottleneck in target validation and interaction screening. By maintaining proteins in a native, non-denatured state on-chip, the method supports reliable detection of protein-protein, protein-DNA, and protein-RNA interactions. This capability enhances predictive confidence in early discovery by reducing false negatives from protein loss or misfolding during purification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional target validation by expressing full-length proteins with correct folding and post-translational modifications.
- Operational Value: Eliminates purification steps, reducing sample loss and increasing throughput for large-scale library screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by providing quantitative expression data for thousands of variants in parallel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized protein arrays directly from DNA templates, ensuring batch-to-batch consistency for reproducible interaction assays.
- Operational Value: Integrates gene arraying and protein expression on a single microfluidic device, minimizing hands-on time and cross-contamination risk.
- Assay Readiness: Produces quantifiable fluorescent readouts compatible with microarray scanners for high-density interaction mapping.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables rapid profiling of protein interactions across disease-relevant targets identified in upstream omics studies.
- Biomarker Alignment: Supports screening for autoantibodies or therapeutic binding events using patient-derived samples on expressed antigen arrays.
- Preclinical De-risking: Allows early assessment of off-target binding or cross-reactivity profiles before advancing candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from synthetic gene library preparation to interaction screening, enabling a seamless transition from target identification to lead validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by expressing arrayed genes to assess functional protein activity without purification bias.
- Screening: Delivers standardized, fresh protein arrays ready for immediate use in biochemical or biophysical interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence-based readouts that allow comparison of expression levels and binding affinities across thousands of conditions.
- Translational Research: Connects genetic variants to functional protein outputs, enabling correlation with phenotypic or clinical data.
- Enterprise Reuse: The microfluidic platform can be reprogrammed with new DNA arrays, supporting iterative screening campaigns across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by expressing proteins in a native state, reducing artifacts from purification or denaturation.
- Operational Value: Enables parallel processing of thousands of reactions in a compact footprint, improving reagent efficiency and throughput.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly generating interaction data for large variant libraries.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on comprehensive interaction profiles and expression fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including PDMS molding and layer alignment.
- Depends on access to microarray spotting equipment for DNA array generation and microfluidic control systems (e.g., LabVIEW with solenoid valves).
- Necessitates standardized protocols for gene library preparation, including assembly PCR and epitope tagging for detection.
- Involves optimization of incubation times and reagent concentrations (e.g., rabbit reticulocyte lysate, biotinylated reagents) for specific protein expression goals.
- Limited by the accessibility of microfluidic fabrication facilities and the technical skill required for precise layer alignment and bonding.
