Anticorpos que neutralizam a absorção celular de terapias de substituição enzimática com um ensaio de baseada em célula de

Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunogenicidade e bioanalítica sobre o impacto dos anticorpos neutralizantes na segurança, eficácia e perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos dos medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um método baseado em células sensível e biologicamente relevante para medir anticorpos neutralizantes específicos de medicamentos de maneira semiquantitativa. Nesta técnica, as enzimas marcadas com fluoróforo entram nas células Jurkat através da ligação de um resíduo de manose-6-fosfato ao receptor de manose-6-fosfato independente de cátions ou CI-M6PR.

Os anticorpos neutralizantes que impedem a interação enzimática-receptor induzem uma diminuição na fluorescência medida por citometria de fluxo. Para começar, semeie 7,5 vezes 10 para a quarta célula Jurkat em 100 microlitros de meio de crescimento celular por poço em uma placa de cultura de células de fundo redondo de 96 poços para uma incubação de 14 a 20 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com 95% de umidade. Diluir primeiro as amostras de ensaio em meio sem soro na proporção de um para 2,5.

Em seguida, adicione 60 microlitros de cada amostra aos poços apropriados de uma placa de polipropileno não vinculativa de fundo redondo branco de 96 poços. Esta será a placa de incubação de amostra. Para amostras que foram positivas e precisam ser confirmadas, vortex um frasco de Terapia de Reposição Enzimática ou grânulos ERT e adicione o número apropriado de grânulos a um tubo cônico de 15 mililitros para outro vórtice.

Em seguida, coloque o tubo em um suporte de tubo magnético por dois minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante. Após a quarta lavagem, adicione 100 microlitros de grânulos aos poços apropriados de uma nova placa de polipropileno branca de 96 poços de fundo redondo não vinculante. Quando todas as contas tiverem sido banhadas, coloque a placa em um ímã de 96 poços com saia lateral e permita que as contas formem uma pelota antes de remover cuidadosamente o sobrenadante transparente.

Em seguida, adicione 140 microlitros de cada amostra nos poços apropriados e sele a placa com filme plástico para agitar por pelo menos 60 minutos em um agitador rotativo a aproximadamente 800 RPM à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa de confirmação no ímã de 96 poços com saia lateral para permitir que as esferas formem outro pellet e adicione 60 microlitros de amostra aos poços apropriados de uma placa de incubação de amostra de polipropileno não vinculativa de fundo redondo branco de 96 poços. Para amostras que foram rastreadas e confirmadas como positivas, uma série de títulos pode ser realizada.

Para preparar uma série de títulos, dilua em série a amostra na matriz agrupada um número suficiente de vezes para cruzar o ponto de corte do título predeterminado e adicione 60 microlitros de cada amostra diluída aos poços apropriados da placa de incubação da amostra e 60 microlitros das concentrações apropriadas de ERT marcado com fluoróforo aos poços apropriados de uma nova placa de polipropileno não vinculativa de fundo redondo branco de 96 poços de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, pipete a solução de amostra de fluoróforo ERT várias vezes para misturar e embrulhar as placas em papel alumínio para uma incubação de 14 a 20 horas a dois a oito graus Celsius. Na manhã seguinte, aqueça as placas de amostra em um banho de esferas de 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos e verifique as células plaqueadas em um microscópio invertido para confirmar se as células estão saudáveis e uniformemente distribuídas pelos poços.

Quando as placas estiverem aquecidas, adicione 100 microlitros de amostra e mistura de ERT marcada com fluoróforo à placa celular de acordo com o mapa experimental da placa e retorne as células à incubadora de cultura de células por mais três horas e 15 minutos. No final da incubação, pulverizar as células por centrifugação e confirmar a presença de um pellet no fundo de cada poço. Segurando a placa em um ângulo de 30 a 45 graus, remova cuidadosamente o sobrenadante em cada poço sem perturbar os pellets e lave as células três vezes em 200 microlitros de DPBS por poço por centrifugação.

Após a última lavagem, adicione 100 microlitros de mancha de mortos-vivos a cada poço para uma incubação de 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. No final da incubação, pelete as células por centrifugação e lave as células com 200 microlitros de DPBS por poço. Ressuspenda os pellets lavados em 100 microlitros de dois a oito graus Celsius 1% de paraformaldeído por poço e sele a placa para um vórtice de pulso suave.

Em seguida, embrulhe o prato em papel alumínio para uma fixação de 10 minutos a dois a oito graus Celsius. Para analisar a viabilidade celular por citometria de fluxo, misture as células com 50 microlitros de DPBS por poço para obter uma suspensão de célula única e leia as células em um citômetro de fluxo de acordo com os protocolos padrão de citometria de fluxo. A captação de ERT conjugada com fluoróforo pode então ser avaliada de acordo com a intensidade média de fluorescência ou MFI das células individuais vivas.

Antes de ser testado no ensaio, um ponto de corte de triagem experimental é calculado como um limite para determinar as amostras positivas e negativas. Neste exemplo, são mostrados controles de qualidade enriquecidos com quantidades altas ou baixas de anticorpos neutralizantes. As amostras positivas são então testadas em um ensaio confirmatório usando esferas magnéticas conjugadas com drogas para esgotar o anticorpo específico da droga das amostras.

As amostras com uma taxa de recuperação superior ao ponto de corte confirmatório são consideradas positivas. As amostras que foram selecionadas e confirmadas como positivas são diluídas em série e testadas no ensaio de título para determinar o título relativo de anticorpos neutralizantes em cada amostra. O título é o valor interpolado entre duas diluições que cruzam o ponto de corte do título.

Mostrado aqui, as IMFs de células únicas vivas avaliaram a captação de ERT conjugada com fluoróforo. Por exemplo, neste experimento, a matriz enriquecida com o anticorpo de controle positivo inibiu a captação de ERT conjugada com fluoróforo, resultando em uma baixa intensidade média de fluorescência. Em contraste, as células incubadas com a matriz na ausência do anticorpo de controle positivo exibiram uma intensidade de fluorescência mediana mais alta, demonstrando captação do TRE conjugado com fluoróforo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter janelas de incubação rigorosas para obter resultados confiáveis e consistentes. Também é importante otimizar o ensaio para cada terapia de reposição enzimática. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para cientistas de imunogenicidade e bioanalítica no desenvolvimento de medicamentos explorarem o impacto dos anticorpos neutralizantes de captação celular na segurança e eficácia da TRE.

Não se esqueça de que trabalhar com amostras humanas pode ser extremamente perigoso e que todas as amostras devem ser tratadas como se fossem potencialmente infecciosas durante a realização deste procedimento.