Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

O objetivo geral deste procedimento é detectar respostas de células T a antígenos de interesse. Isso é feito primeiro codificando com anticorpos de captura. A segunda etapa do procedimento é adicionar células e antígenos de interesse e depois incubar durante a noite.

A terceira etapa do procedimento é adicionar anticorpos de detecção. A etapa final do procedimento é o desenvolvimento da placa com reagentes de substrato e a análise de manchas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que escolheram citocinas de interesse por meio da análise de unidades formadoras de manchas.

Olá, meu nome é Dr.Ki Richter e sou instrutor de pesquisa no Laboratório do Dr. Wonder Drake na Universidade Vanderbilt, na divisão de Doenças Infecciosas. Hoje estamos demonstrando a técnica Ellie Spot, também conhecida como ensaio de ponto imunológico ligado a enzimas. Dr. Isfahan Chambers e Tiffany Cone demonstrarão a técnica para você hoje.

Para manter os padrões de cultura de células, execute manipulações em condições estéreis no exaustor, abra uma placa pontual aliada e lave três vezes com PBS. Preparar uma solução de revestimento do anticorpo de captura em PBS. Misture bem por vórtice por conveniência.

Transfira a solução de anticorpos para um reservatório para o multicanal, pipetador e alíquota de 100 microlitros de solução de revestimento em cada um. Feche bem a placa com perfil e coloque na geladeira durante a noite. Essas placas revestidas com anticorpos são boas por semanas.

A regra geral determina que uma placa pode ser usada se ainda houver líquido nos poços. Para preparar as células para este ensaio, cove células mononucleares do sangue periférico recém-isoladas com azul de trien para viabilidade e conte-as: coloque o pbmc em placa a 2 milhões de células por mililitro em nossos 10 meios e incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para acompanhar o experimento, rotule a tampa da placa de Ali com o número de identificação da amostra, as condições do poço e a data.

Lave a placa seis vezes com PBS estéril usando o método de despejo e borrão. Tenha cuidado para não espirrar o prato durante o despejo, pois isso pode fazer com que os poços do prato fiquem roxos. Adicione nossos 20 meios a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora.

Enquanto a placa está incubando, conte as células que descansaram durante a noite. Colha o pbmc por centrifugação. Transvase o sobrenadante e ressuspenda o pellet em nossos 10 meios a uma concentração de 1 milhão de células por mililitro.

Após a incubação de uma hora da placa pontual aliada, remova o meio R 20 usando o método de despejo e borrão. Tenha cuidado para não espirrar o prato durante o despejo. Adicione 100 microlitros de suspensão celular a cada um.

Seguir o desenho experimental com adição de péptidos e antigénios aos poços de ensaio correspondentes. Inclua sempre um controle negativo de células sem peptídeos e também poços de controle positivo com adição de fito hemaglutinina. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Lave a placa seis vezes com 150 microlitros de um XPBS usando o método de despejo e borrão. Adicione 100 microlitros de PBS a cada poço da placa e coloque a placa na geladeira ou em temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpo de biotina em PBS.

Retire a placa de spot ALI da geladeira e descarte o PBS jogando-o na cesta de lixo. Tenha cuidado para não espirrar a placa enquanto despeja uma alíquota da solução de anticorpo de biotina em cada poço e incube a placa na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente por uma hora. Lave a placa seis vezes com PBS usando o método de despejo e borrão na última lavagem.

Deixe o PBS no prato agora. Prepare a solução de anticorpos STREPTAVIDIN em PBS, certificando-se de que a solução a misturar. Bem, descarte a última lavagem de PBS dos poços e plote a placa de spot ALI.

Adicione a solução de anticorpos estreptavidina a cada poço e incube a placa na capa de cultura de tecidos à temperatura ambiente por uma hora. Para remover o excesso de anticorpo de trevaína, lave a placa seis vezes com PBS usando o método de despejo e borrão na última lavagem, conduza o PBS na placa. Dada a sensibilidade à luz da solução de substrato de fosfatase alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Trabalhe no escuro ao preparar a solução de caule conforme descrito pelos fabricantes nas instruções do kit de substrato de fosfatase alcalina, descarte o PBS restante dos poços e seque a placa de ponto ly. Adicione solução de substrato a cada poço e acenda a luz. Após cinco a 10 minutos de desenvolvimento da cor, deixe os reagentes permanecerem na placa até que as manchas comecem a ficar roxas e bem escuras.

Isso leva até 20 minutos. Lave a placa de spot Ali três vezes com água da torneira e deixe secar ao ar. Cada placa contém um controle positivo, controle negativo e peptídeo de interesse conduzidos no mínimo em duplicata.

Os poços de controle positivo são de uma cor roxa profunda, refletem uma camada confluente de células e quase nenhum fundo branco. Os poços de controle negativo não têm fundo roxo e nem manchas, como esperado. Os poços de amostra de teste ilustram as respostas celulares aos peptídeos microbianos aqui.

As manchas roxas representam uma única célula responsiva expressando a citocina de interesse Ao realizar a técnica de mancha LA. Tenha cuidado para não perfurar a membrana com as pontas da pipeta ou permitir que a placa seque, pois isso levará a um fundo alto.