Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

O objetivo geral deste procedimento é detectar respostas de linfócitos T a antígenos de interesse. Isso é realizado primeiramente por meio da codificação com anticorpos de captura. O segundo passo do procedimento consiste em adicionar células e os antígenos de interesse e, em seguida, incubar durante a noite.

O terceiro passo do procedimento é adicionar os anticorpos de detecção. O passo final do procedimento é desenvolver a placa com reagentes de substrato e analisar as manchas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que identificam citocinas de interesse por meio da análise de unidades formadoras de manchas.

Olá, meu nome é Dra. Ki Richter e sou instrutora de pesquisa no laboratório da Dra. Wonder Drake na Universidade Vanderbilt, na divisão de Doenças Infecciosas. Hoje vamos demonstrar a técnica Ellie Spot, também conhecida como ensaio imunoenzimático em placa com detecção de pontos. As Doutoras Isfahan Chambers e Tiffany Cone irão demonstrar a técnica para vocês hoje.

Para manter os padrões de cultura celular, realize manipulações em condições estéreis na câmara de fluxo laminar, abra uma placa com poços circulares e lave três vezes com PBS. Prepare uma solução de revestimento do anticorpo de captura em PBS. Misture bem por vortexagem para facilitar.

Transfira a solução de anticorpo para um reservatório da pipeta multicanal e distribua alíquotas de 100 microlitros da solução de revestimento em cada poço. Selle bem a placa com perfil e coloque na geladeira durante a noite. Essas placas revestidas com anticorpo são estáveis por semanas.

A regra geral determina que uma placa pode ser utilizada se ainda houver líquido nos poços. Para preparar as células para este ensaio, marque os linfócitos mononucleares do sangue periférico recém-isolados com trien azul para avaliar a viabilidade e conte-os. Plaque os PBMC a 2 milhões de células por mililitro no meio 10 e incube durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para acompanhar o experimento, rotule a tampa da placa Ali spot com o número de identificação da amostra, as condições dos poços e a data.

Lave a placa seis vezes com PBS estéril utilizando o método de descarte e absorção. Tenha cuidado para não derramar a placa ao descartar, pois isso pode fazer com que os poços da placa fiquem roxos. Adicione nosso meio 20 a cada poço e incube a placa a 37 graus Celsius por uma hora.

Enquanto a placa está em incubação, conte as células que foram mantidas em repouso durante a noite. Recolha os pbmc por centrifugação. Decante o sobrenadante e ressuspenda o pellet em nosso meio 10 na concentração de 1 milhão de células por mililitro.

Após a incubação de uma hora da placa de cultura em gota, remova o meio R 20 utilizando o método de descarte e secagem. Tenha cuidado para não provocar respingos na placa durante o descarte. Adicione 100 microlitros de suspensão celular a cada uma.

Seguiremos o delineamento experimental com a adição de peptídeos e antígenos aos poços de teste correspondentes. Inclua sempre um controle negativo de células sem peptídeos e também poços controle positivo com fitohemaglutinina adicionada. Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Lave a placa seis vezes com 150 microlitros de um XPBS utilizando o método de descarte e absorção. Adicione 100 microlitros de PBS a cada poço da placa e coloque a placa na geladeira ou à temperatura ambiente por 15 minutos. Enquanto isso, prepare a solução de anticorpo biotinilado em PBS.

Retire a placa de poços ALI da geladeira e descarte o PBS descartando-o na cesta de resíduos. Tenha cuidado para não salpicar a placa ao adicionar uma alíquota da solução de anticorpo biotinilado em cada poço e incube a placa na câmara de cultura tecidual à temperatura ambiente por uma hora. Lave a placa seis vezes com PBS utilizando o método de descarte e absorção, aplicando esse método também na última lavagem.

Deixe o PBS na placa agora. Prepare a solução de anticorpo STREPTAVIDINA em PBS, certificando-se de fazer vórtex na solução para misturar. Descarte a última lavagem de PBS dos poços e monte a placa de pontos ALI.

Adicione a solução de anticorpo estreptavidina a cada poço e incube a placa na capela de cultura de tecidos à temperatura ambiente por uma hora. Para remover o anticorpo trevain em excesso, lave a placa seis vezes com PBS, utilizando o método de descarte e absorção no último ciclo de lavagem, deixando o PBS sobre a placa. Considere a sensibilidade à luz da solução de substrato de fosfatase alcalina B-C-I-P-M-B-T.

Trabalhe no escuro ao preparar a solução de substrato conforme descrito pelos fabricantes nas instruções do kit de substrato de fosfatase alcalina; descarte o PBS remanescente dos poços e seque delicadamente a placa com manchas. Adicione a solução de substrato a cada poço e acenda a luz. Após cinco a 10 minutos de desenvolvimento da coloração, deixe os reagentes na placa até que as manchas comecem a ficar roxas e estejam bem escuras.

Isso leva até 20 minutos. Lave a placa de poços Ali três vezes com água da torneira e deixe secar ao ar. Cada placa contém um controle positivo, um controle negativo e o peptídeo de interesse, realizados no mínimo em duplicata.

Os poços do controle positivo apresentam uma coloração roxa intensa, refletindo uma camada confluente de células e praticamente nenhum fundo branco. Os poços do controle negativo não apresentam fundo roxo nem manchas, conforme esperado. Os poços das amostras-teste ilustram as respostas celulares a peptídeos microbianos aqui.

As manchas roxas representam uma única célula responsiva que expressa a citocina de interesse ao realizar a técnica LA spot. Tenha cuidado para não perfurar a membrana com as ponteiras da pipeta nem permitir que sua placa seque, pois isso resultará em um fundo elevado.