A TreadWheel: Protocolo de treinamento de intervalo para suavemente induzido por exercício em Drosophila melanogaster.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa metabólica, como determinar se intervenções específicas no estilo de vida, como exercícios, podem beneficiar indivíduos específicos. Freqüentemente, indivíduos novos neste método terão dificuldade em identificar larvas no estágio de primeiro ínstar. A chave é coletar larvas quase do mesmo tamanho que os ovos.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para avaliar o impacto do exercício em muitas condições experimentais e genótipos. Primeiro, monte câmaras de assentamento para cada grupo experimental. Aplique um bocado de pasta de fermento em um prato de ágar suco de maçã e prenda o prato em uma garrafa de plástico de seis onças.

Os pratos de ágar suco de maçã são feitos fazendo uma solução de ágar 3% em suco de maçã comprado em loja. E então enchendo pratos de 35 por 10 milímetros a 3/4 da parede. A pasta de fermento é feita misturando fermento seco ativo comprado em loja com água na proporção de cerca de dois mililitros de água destilada por grama de fermento.

Mantenha a pasta coberta frouxamente para permitir a desgaseificação e aplique cerca de três milímetros em cada placa. A garrafa, feita de polipropileno, deve ser preparada com pequenos orifícios para ventilação. Depois de preparar os componentes para a câmara, prossiga com o carregamento nos adultos.

Assim que os adultos do genótipo desejado estiverem todos na garrafa, tampe a garrafa com a placa e prenda o conjunto com elásticos. Garantir um número suficiente de moscas adultas para as câmaras de postura provavelmente requer que se comece a construir números populacionais várias gerações antes do experimento planejado. Agora, troque os pratos de ágar suco de maçã duas vezes ao dia, uma de manhã e outra à noite.

Em seguida, deixe os ovos se desenvolverem nas placas coletadas por 12 a 24 horas em larvas de primeiro ínstar. Para coletar essas larvas, use um pincel fino ou uma palheta feita de uma agulha fina flexível e uma alça. Para cada grupo experimental, transfira 50 larvas de primeiro ínstar para um frasco de comida fresca e deixe-as se desenvolver até a idade adulta.

Para garantir que você seja capaz de coletar larvas suficientes para cada uma de suas réplicas, certifique-se de que haja pesquisadores disponíveis que sejam eficientes na coleta de larvas para obter os números necessários. Após a pupação, colete as pupas umedecendo-as primeiro com um pequeno pincel úmido. Em seguida, retire suavemente as pupas das laterais dos frascos com uma espátula.

Coloque as pupas em frascos vazios. Em seguida, após a eclosão, transfira os adultos para frascos de alimentos padrão. Um a cinco dias após a eclosão, separe as moscas com base no sexo e divida cada sexo em dois grupos, experimental e controlado.

Mantenha os adultos em 50 moscas por frasco. Dê às moscas frascos frescos com fermento vivo a cada dois dias. Embora seja possível manter adultos sem suplementação de levedura viva, descobrimos que os adultos têm melhor desempenho com o suplemento.

A suplementação de levedura viva é uma variável que os pesquisadores podem modificar para atender aos seus objetivos específicos de pesquisa. O dispositivo de exercício usa um sistema simples de correia e polia alimentado por um motor de velocidade variável. Antes de usar o dispositivo de exercício, remova todos os frascos conectados a ele e calibre a velocidade do motor usando a fonte de alimentação de forma que um período de rotação completo seja de 15 segundos.

Para cronometrar a velocidade de rotação, prenda um pincel pequeno na tampa do motor e posicione o pincel de forma que toque em um dos suportes giratórios. Em seguida, cronometre o número de rotações feitas contando os contatos da escova e o suporte por minuto. Usando uma máquina calibrada, prossiga com o primeiro dia de exercício, geralmente uma segunda-feira.

Empurre os plugues do frasco para injetáveis nos frascos. Deixe as moscas com um centímetro de espaço em frascos de controle e seis centímetros de espaço em frascos de exercícios. Agora coloque os frascos nas pinças e com 10 minutos para deixar as moscas se aclimatarem.

O dispositivo de exercício pode conter até 48 frascos. A temperatura ambiente deve permanecer constante durante todo o procedimento de vários dias ou o dispositivo de exercício pode caber em uma incubadora, se desejado. O delineamento experimental consiste em cinco dias consecutivos de exercício por semana.

Cada dia de exercício contém períodos alternados de exercício e descanso. Em cada dia, cinco minutos são adicionados a um dos períodos de exercício, de modo que, ao longo de uma semana de trabalho de cinco dias, todos os quatro períodos de exercício aumentem em cinco minutos. Assim que as moscas estiverem aclimatadas, inicie o primeiro período de exercícios.

Ligue a máquina por 15 minutos. Durante o descanso entre períodos de cinco minutos, deixe os frascos nos grampos. Depois de completar o quarto ciclo de exercícios, retorne os tampões do frasco de comida às suas posições normais e retorne as moscas à incubadora.

Para estabelecer se o exercício no TreadWheel influenciou as características metabólicas, o armazenamento de triglicerídeos em moscas Oregon R e amarelas foi medido e normalizado em relação à concentração de proteína das moscas. A análise estatística revelou interação genótipo por exercício significativa afetando o armazenamento de triglicerídeos. Houve também um efeito sexualmente dimórfico significativo, com os machos armazenando mais triglicerídeos do que as fêmeas.

As moscas fêmeas exercitadas tinham níveis de triglicerídeos significativamente mais baixos do que suas contrapartes não exercitadas. Isso não foi observado em homens. Em seguida, as moscas foram criadas em dietas variáveis, submetidas ao regime de exercícios e, em seguida, testadas em um ensaio de geotaxia negativa semelhante ao RING.

As fêmeas subiram significativamente mais quando criadas com a dieta rica em gordura do que em qualquer um dos outros tratamentos. Para os machos, o exercício só melhorou a escalada quando eles foram criados com uma dieta normal. Uma dieta rica em gordura não teve efeito.

Curiosamente, houve uma diminuição no desempenho de escalada após o exercício para mulheres da linha DGRP 153 quando criadas com uma dieta normal. Assim, o exercício pode não ser uma intervenção uniformemente positiva para todos os genótipos. Após este procedimento, outros métodos, como ensaios de glicose hemolinfática ou análises de vida útil, podem ser realizados para avaliar o efeito do exercício no diabetes tipo II ou na longevidade.

Essa técnica permite que pesquisadores nas áreas de genética e metabolismo explorem o papel do exercício na manutenção da saúde metabólica no organismo modelo, Drosophila.